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    關(guān)于小麥中嘔吐毒素檢測(cè)質(zhì)量控制的評(píng)價(jià)

    2022-01-05 01:11:46李滑滑曾奎杰倪小英
    糧食與飼料工業(yè) 2021年6期
    關(guān)鍵詞:親和柱麥粉毒素

    楊 靜,李滑滑,洪 玲,沈 娜,曾奎杰,黃 力,倪小英

    (1.湖南省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心,湖南 長沙 410201; 2.稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室,湖南 長沙 410201)

    近年來,食品安全問題受到國際社會(huì)的高度重視,國際食品法典委員會(huì)、歐盟、美國和中國均對(duì)糧食中包括嘔吐毒素在內(nèi)的幾種主要真菌毒素規(guī)定了限量標(biāo)準(zhǔn)[1-2],對(duì)糧食檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢測(cè)能力的要求也越來越高。提高檢驗(yàn)人員的檢測(cè)能力與水平,加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制勢(shì)在必行[3-6]。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制活動(dòng)可分為外部質(zhì)量控制和內(nèi)部質(zhì)量控制,外部質(zhì)量控制是通過實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)實(shí)驗(yàn)、能力驗(yàn)證和測(cè)量審核來進(jìn)行,而內(nèi)部質(zhì)量控制是在相同的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件下,通過人員比對(duì)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測(cè)、質(zhì)控樣品分析、校準(zhǔn)曲線核查、回收率實(shí)驗(yàn)等方法展開[7-8,10-11]。

    本研究建立免疫親和層析凈化-高效液相色譜法,通過16名檢測(cè)人員對(duì)小麥中嘔吐毒素前處理過程進(jìn)行人員比對(duì),并采用Z比分?jǐn)?shù)和雙試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)其實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制進(jìn)行評(píng)價(jià)。為本實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制提供可靠的數(shù)據(jù)與依據(jù),也可為其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制建設(shè)給予參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)計(jì)劃

    按質(zhì)量控制要求制定比對(duì)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃,確定比對(duì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間、人員安排、質(zhì)量監(jiān)督、檢驗(yàn)依據(jù)和評(píng)價(jià)方法。

    1.2 儀器與試劑

    Agilent 1260型高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司;HY-4A型調(diào)速振蕩器,常州澳華儀器有限公司;Direct-Q 8UV-R型超純水機(jī),德國密理博公司;嘔吐毒素免疫親和柱,北京華安麥科生物技術(shù)有限公司;嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):100 μg/ml,北京美正檢測(cè)技術(shù)有限公司;甲醇:色譜純,德國默克公司;全麥粉中嘔吐毒素質(zhì)控樣品:800±120 μg/kg和1 845±277 μg/kg,國家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院;全麥粉嘔吐毒素空白樣品:湖南糧食集團(tuán)倉庫扦取制得;聚乙二醇6000:化學(xué)純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;玻璃纖維微孔濾紙,上海興亞凈化材料廠生產(chǎn)。

    1.3 試樣提取

    稱取25 g試樣(精確到0.01 g),加入5.0 g聚乙二醇,于250 ml錐形瓶中,加入100 ml 水,渦旋混勻,置調(diào)速振蕩器(200~300 r/min)劇烈振蕩20 min,分別通過快速定性濾紙、玻璃纖維微孔濾紙過濾,取上清液備用。

    1.4 親和柱凈化

    免疫親和柱平衡后,柱上面連接25 ml一次性注射器,準(zhǔn)確移取2.0 ml上清液,調(diào)節(jié)開關(guān),使液體以1~2滴/s的速度流出;待液體排干后,用去離子水洗滌2次,每次10 ml ;待液體排干后,上樣1 ml甲醇,流速1滴/s,收集洗脫液,并在50℃加熱條件下氮?dú)獯蹈?,然后?zhǔn)確移取1.0 ml流動(dòng)相(20%甲醇)復(fù)溶,最后用0.22 μm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶,用于液相分析。

    1.5 液相色譜條件

    色譜柱:ZORBAX SB C18(150 mm×4.6 mm,5.0 μm);流動(dòng)相:80%水+20%甲醇(V/V);流速:0.8 ml/min;柱溫:35℃;進(jìn)樣體積:50 μl;波長:218 nm。

    1.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

    由濃度為100 μg/ml嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的甲醇溶液定容,依次稀釋成濃度為100、250、500、1 000、2 000、5 000 ng/ml的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液。

    1.7 結(jié)果統(tǒng)計(jì)與評(píng)價(jià)

    比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果須符合GB 5009.111—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?;苌锏臏y(cè)定》(第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法)中相應(yīng)方法標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求[9],并以《能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和能力評(píng)價(jià)指南CNAS—GL02:2018》和《利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)進(jìn)行能力驗(yàn)證的統(tǒng)計(jì)方法GB/T 28043—2019》為依據(jù)[10-11],利用Z比分?jǐn)?shù)作為性能統(tǒng)計(jì)量評(píng)價(jià)各參考人員的結(jié)果滿意度。

    式中,xi為測(cè)定值,xpt為指定值,σpt為能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差。

    (1)指定值:本次比對(duì)考核采用國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),指定值xpt即為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)值。

    (2)能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差:采用GB/T 28043—2019中8.3的方法,并結(jié)合GB 5009.111—2016 中第二法再現(xiàn)性允許差確定。

    (3)當(dāng)指定值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(xpt)遠(yuǎn)大于能力驗(yàn)證中能力評(píng)定使用的標(biāo)準(zhǔn)差σpt,即u(xpt)>0.3σpt時(shí),指定值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度不能忽略,需使用校正的比分?jǐn)?shù)Z'對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)定。

    式中,u(xpt)為包含因子k=2時(shí)指定值xpt的擴(kuò)展不確定度。

    (4)Z值評(píng)價(jià):若∣Z∣≤1,表明“優(yōu)秀”,1<∣Z∣≤2,表明“滿意”,無需采取進(jìn)一步措施;2<∣Z∣≤3,表明“有問題”,應(yīng)給予警戒信號(hào);∣Z∣>3,表明“不滿意”,需要采取措施。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限

    以100 μg/ml 嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋所得的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液(100~5 000 ng/ml),在確定的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(單位ng/ml)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,嘔吐毒素含量在100~5 000 ng/ml的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性方程:If=0.063 5×c-0.076 9,其相關(guān)系數(shù)R2為1.000 0。在空白全麥粉中添加目標(biāo)化合物,以3倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限(LOD)為25 μg/kg;以10倍的倍信噪比確定方法的定量限(LOQ)為83 μg/kg,完全能滿足糧食中嘔吐毒素的測(cè)定需求。

    2.2 準(zhǔn)確性和重復(fù)性

    選取不含嘔吐毒素的全麥粉樣品進(jìn)行加標(biāo)和重復(fù)性實(shí)驗(yàn),樣品中添加了不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(3個(gè)濃度水平,添加量相當(dāng)于嘔吐毒素含量500、1 000、2 000 μg/kg)后,放置60 min,使待測(cè)成分與樣品基體成分相互作用達(dá)到平衡,再應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)的前處理方法進(jìn)行操作,其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表1。

    表1 全麥粉中嘔吐毒素的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

    由表1可見,3個(gè)濃度水平加標(biāo)回收率為90.4%~100.1%,3次重復(fù)測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%~2.6%,符合一般痕量分析要求。

    2.3 人員比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)與評(píng)價(jià)

    為了開展小麥中嘔吐毒素人員比對(duì)考核項(xiàng)目,通過國家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院購得2個(gè)濃度的全麥粉嘔吐毒素質(zhì)控樣品作為本次比對(duì)樣品,將其每個(gè)濃度的樣品均勻的分裝成8份,隨機(jī)分發(fā)給16名參加本次比對(duì)的人員。在相同的實(shí)驗(yàn)室條件下,16名人員分別單獨(dú)完成前處理步驟,再由專業(yè)人員統(tǒng)一上機(jī)測(cè)定,其統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

    表2 全麥粉中嘔吐毒素的檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

    由表2可見,本次小麥中嘔吐毒素人員比對(duì)的檢測(cè)結(jié)果雙試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均≤9.4%,遠(yuǎn)低于GB 5009.111—2016 中第二法再現(xiàn)性允許差≤23%;利用Z比分?jǐn)?shù)評(píng)價(jià),全部∣Z∣≤1,表明“優(yōu)秀”。這表明本實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)過程是受控的、可信的、有效的,檢測(cè)結(jié)果是準(zhǔn)確的、可靠的。

    2.4 實(shí)驗(yàn)操作關(guān)鍵點(diǎn)分析

    參加本次實(shí)驗(yàn)比對(duì)的16名人員,均熟悉嘔吐毒素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容,熟練各個(gè)樣品前處理步驟關(guān)鍵點(diǎn),有效控制不利的影響因素,在該項(xiàng)檢測(cè)上具有一致的水平和能力。結(jié)合本次人員比對(duì)實(shí)驗(yàn)和長期從事嘔吐毒素項(xiàng)目檢測(cè)所獲經(jīng)驗(yàn),認(rèn)為應(yīng)當(dāng)把握以下4個(gè)實(shí)驗(yàn)操作關(guān)鍵點(diǎn):①精確稱量樣品,定量移取提取液、上親和柱的凈化液、氮吹后加入的復(fù)溶液,需準(zhǔn)確、熟練;②樣品加入提取液后,應(yīng)先小心的手動(dòng)搖晃,將錐形瓶底未與提取液互溶的固體散開,再置于調(diào)速振蕩器振蕩,確保樣品中嘔吐毒素的完全提取并釋放出來;③親和柱的操作是整個(gè)前處理的最關(guān)鍵步驟,應(yīng)保證整個(gè)操作過程連續(xù)、一氣呵成,還需要將水洗滌后的親和柱吹干與處理,避免親和柱中含水過多,稀釋加入的甲醇,影響嘔吐毒素的洗脫;④氮吹甲醇往往是最容易操作失誤的步驟,氮吹溫度、氮?dú)饬髁坎灰颂?,以免嘔吐毒素伴隨甲醇跑掉,過程應(yīng)連續(xù)操作、少接觸易吸附的塑料器材,復(fù)溶后,渦旋均勻,經(jīng)微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶。

    3 結(jié)論

    本次開展小麥中嘔吐毒素前處理過程人員比對(duì)實(shí)驗(yàn),能較好的判定檢驗(yàn)人員的檢測(cè)操作能力與水平,也能加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量控制及有效監(jiān)控,提升實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力水平。本實(shí)驗(yàn)通過人員比對(duì)的檢測(cè)結(jié)果分析以及實(shí)驗(yàn)操作過程的觀察,發(fā)現(xiàn)影響檢測(cè)工作準(zhǔn)確性的因素有很多,要真正使實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力更上一個(gè)臺(tái)階,在同一實(shí)驗(yàn)室人員比對(duì)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,還須參加上級(jí)或外部機(jī)構(gòu)組織的實(shí)驗(yàn)室間能力驗(yàn)證活動(dòng),才能了解自己在該檢測(cè)項(xiàng)目中的真實(shí)水平,發(fā)現(xiàn)問題,采取措施,及時(shí)糾正和整改[12]。

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