熒光染色法在真菌檢測(cè)中的應(yīng)用

趙 琳， 喬 昀

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200021）

目前已發(fā)現(xiàn)的對(duì)人類有致病性的真菌約有300多個(gè)種類。根據(jù)侵犯人體部位的不同，臨床上將致病真菌分為淺部真菌和深部真菌[1]。淺部真菌（癬菌）僅侵犯皮膚、毛發(fā)和指（趾）甲，而深部真菌能侵犯人體皮膚、黏膜、深部組織和內(nèi)臟，甚至引起全身播散性感染。目前真菌的常用檢測(cè)方法包括直接涂片、革蘭染色、墨汁染色、真菌培養(yǎng)和KOH濕片法[2]。培養(yǎng)方法耗時(shí)長(zhǎng)；直接涂片檢出率相對(duì)較低；KOH濕片法對(duì)檢驗(yàn)人員的技術(shù)水平要求較高，容易漏檢[3]。近年來，熒光染色法在真菌感染診斷中的應(yīng)用越來越廣。本研究采用熒光染色、直接涂片、革蘭染色、墨汁染色、真菌培養(yǎng)及KOH濕片法對(duì)臨床樣本進(jìn)行同步檢測(cè)，以評(píng)估熒光染色法在真菌檢測(cè)中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 樣本

收集2019年上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院門診及住院患者臨床樣本232份，樣本類型包括痰（75份）、咽拭子（48份）、白帶（30份）、皮屑（15份）、甲屑（12份）、尿液（12份）、糞便（10份）、腦脊液（30份）。所有臨床樣本采集后均放置于無菌容器內(nèi)送檢。痰、咽拭子、白帶、尿液及糞便等深部樣本同時(shí)采用熒光染色、直接涂片和革蘭染色進(jìn)行檢測(cè)[4]，皮屑和甲屑淺表樣本同時(shí)采用熒光染色、KOH濕片法及真菌培養(yǎng)進(jìn)行檢測(cè)[5]，腦脊液樣本采用熒光染色和墨汁染色進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 （1）痰樣本取自患者第一口晨痰，置于無菌痰盒中。（2）咽拭子樣本采用無菌咽拭子采集管，用棉棒自患者咽喉部取樣。（3）白帶樣本采用無菌棉簽管，用棉棒自患者陰道內(nèi)部取樣。（4）皮屑樣本，用75%乙醇消毒患者皮損部位，使用鈍頭刀片刮取皮屑。（5）甲屑樣本，用75%乙醇消毒患者病甲后，用消毒刀片刮取甲下碎屑。（6）尿液樣本取自患者第1次晨尿，使用無菌管收集保存，離心后取沉渣鏡檢。（7）糞便樣本取樣后置于無菌容器內(nèi)。（8）腦脊液樣本離心后取沉淀物鏡檢。

1.2.2 熒光染色 采用南京漢瑞生物科技有限公司真菌熒光染色液進(jìn)行染色。將樣本均勻涂于載玻片上，加1滴熒光染液，覆上蓋玻片，輕壓蓋玻片靜待1 min，待染液與樣本充分混勻后，在熒光顯微鏡下觀察，查見熒光標(biāo)記的孢子或菌絲即為陽(yáng)性。陽(yáng)性對(duì)照白念珠菌（ATCC 14053）購(gòu)自上海市臨床檢驗(yàn)中心。

1.2.3 革蘭染色 采用珠海貝索生物技術(shù)有限公司革蘭染色液進(jìn)行染色。將樣本均勻涂于載玻片上，在火焰上快速通過3次固定，加龍膽紫液染色1 min，流水沖洗；加媒染液染色1 min，流水沖洗；加脫色乙醇至無紫色脫落為止，流水沖洗；復(fù)染劑（石炭酸復(fù)紅）染色30 s，流水沖洗。干燥后，用高倍鏡查找真菌孢子和菌絲。陽(yáng)性對(duì)照為白念珠菌（ATCC 14053）。

1.2.4 直接涂片 將樣本放置于載玻片上，加1滴0.9%氯化鈉溶液，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察，查見孢子或菌絲即為陽(yáng)性。

1.2.5 KOH濕片法 將樣本放置于載玻片上，加1滴10% KOH溶液，蓋上蓋玻片，用酒精燈微加熱溶解甲屑，顯微鏡下查見孢子或菌絲即為陽(yáng)性。

1.2.6 真菌培養(yǎng) 在超凈工作臺(tái)將皮屑、甲屑樣本接種于蛋白胨沙氏瓊脂培養(yǎng)基（上海科瑪嘉公司），置25 ℃溫箱中培養(yǎng)2周后觀察，有菌落生長(zhǎng)為陽(yáng)性，無菌生長(zhǎng)則為陰性。

1.2.7 墨汁染色 樣本離心后，將沉淀物涂于潔凈玻片上，然后加1滴墨汁，蓋上蓋玻片鏡檢，背景呈黑褐色，菌體無色透明，有多糖莢膜。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同類型樣本形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

232份臨床樣本熒光染色結(jié)果顯示，可見菌絲及孢子發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光，在暗黑的背景下，易于識(shí)別。痰樣本的熒光染色和直接涂片結(jié)果見圖1，曲霉菌的熒光染色結(jié)果見圖2。

圖1 痰樣本熒光染色和直接涂片結(jié)果

圖2 曲霉菌熒光染色結(jié)果

2.2 熒光染色、革蘭染色、直接涂片真菌陽(yáng)性檢出率比較

熒光染色、革蘭染色、直接涂片對(duì)除腦脊液樣本外的175份深部樣本（痰、咽拭子、白帶、尿液、糞便）的真菌陽(yáng)性檢出率分別為87.43%、78.86%、74.29%，熒光染色陽(yáng)性檢出率高于革蘭染色、直接涂片（χ2值分別為4.857、9.765，P＜0.05）。見表1。

表1 熒光染色、革蘭染色、直接涂片真菌陽(yáng)性檢出率比較 份/%

2.3 熒光染色和KOH濕片法、真菌培養(yǎng)真菌陽(yáng)性檢出率比較

熒光染色和KOH濕片法、真菌培養(yǎng)對(duì)27份皮屑和甲屑淺表樣本的真菌陽(yáng)性檢出率分別為85.19%、74.07%和62.96%，熒光染色陽(yáng)性檢出率高于KOH濕片法、真菌培養(yǎng)（χ2值分別為4.523、5.684，P＜0.05）。見表2。

表2 熒光染色和KOH濕片法、真菌培養(yǎng)真菌陽(yáng)性檢出率比較 份/%

2.4 熒光染色和墨汁染色的真菌陽(yáng)性檢出率比較

熒光染色和墨汁染色對(duì)30例腦脊液樣本的真菌的陽(yáng)性檢出率分別為10.00%和20.00%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.531）。

3 討論

目前，真菌感染常用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法有直接涂片、革蘭染色、真菌培養(yǎng)、KOH濕片法、墨汁染色、真菌培養(yǎng)以及聚合酶鏈反應(yīng)。真菌培養(yǎng)由于時(shí)間較長(zhǎng)，易延誤患者病情和治療；聚合酶鏈反應(yīng)雖然有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速等優(yōu)勢(shì)，但是對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和人員要求較高；革蘭染色操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，易受染液質(zhì)量、檢驗(yàn)人員水平等多種因素的影響，且不能對(duì)甲屑等樣本進(jìn)行檢測(cè)；KOH濕片法因真菌孢子易與脂肪滴、紅白細(xì)胞混淆，不易區(qū)分，需要工作人員有一定的經(jīng)驗(yàn)，且操作較繁瑣，顯白色背景，不易區(qū)分孢子、菌絲的形態(tài)。熒光染色是根據(jù)染料中帶有熒光素的抗體能與真菌細(xì)胞壁中葡聚糖層和幾丁質(zhì)層中的β-糖苷鍵特異性結(jié)合的特性，間接將熒光素標(biāo)記到真菌細(xì)胞壁上，在熒光顯微鏡下可觀察到真菌輪廓，其利用的是抗體特異性結(jié)合和形態(tài)學(xué)觀察的原理，能有效降低背景干擾，孢子及菌絲能發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光，在熒光顯微鏡下與黑色背景形成明顯反差，易于在鏡下尋找和識(shí)別。本研究對(duì)175份痰、咽拭子、白帶、尿液、糞便深部臨床樣本，采用熒光染色、直接涂片、革蘭染色進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率分別為87.43%、78.86%和74.29%，熒光染色的陽(yáng)性檢出率顯著高于其他2種檢測(cè)方法（P＜0.05）；對(duì)27份皮屑和甲屑淺表樣本采用熒光染色與KOH濕片法、真菌培養(yǎng)進(jìn)行檢測(cè)，真菌陽(yáng)性檢出率分別為85.19%、59.26%和55.56%，熒光染色的陽(yáng)性檢出率也高于其他2種檢測(cè)方法（P＜0.05）；對(duì)30份腦脊液樣本，熒光染色和墨汁染色的真菌陽(yáng)性檢出率分別為10.00%和20.00%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.531）。提示熒光染色在真菌檢測(cè)方面，針對(duì)各種樣本均可進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)能通過形態(tài)初步鑒定淺部真菌，是一種快速、有效的新方法[6]。熒光染色操作簡(jiǎn)便，只需要在載有樣本的玻片上，加1滴熒光液即可在熒光顯微鏡下觀察，且熒光液對(duì)脂肪滴不產(chǎn)生標(biāo)記，易與真菌孢子鑒別[7]。

綜上所述，熒光染色檢測(cè)真菌具有特異性高、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，在真菌快速檢測(cè)中有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。