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    低密度脂蛋白受體基因突變及功能檢測和臨床應用進展

    2022-01-05 10:25:38朱勇琳王綠婭鄢盛愷
    檢驗醫(yī)學 2021年12期
    關鍵詞:基因突變分析法膽固醇

    朱勇琳, 王綠婭, 鄢盛愷

    (1.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科,貴州 遵義 563003;2.首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院,北京 100029)

    低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor,LDLR)是機體清除血漿低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)的關鍵受體,在維持體內(nèi)膽固醇代謝平衡方面具有重要作用[1-2]。LDLR基因突變可致多種脂代謝紊亂性疾病,最典型的是家族性高膽固醇血癥(familial hypercholesterolemia,F(xiàn)H),其最主要的臨床表現(xiàn)是低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)升高、黃色瘤、角膜弓和早發(fā)動脈粥樣硬化性心血管疾?。╝therosclerotic cardiovascular disease,ASCVD)。本文對LDLR基因突變和功能的檢測方法與臨床應用進展進行綜述,以期能為脂代謝異常及FH患者的早期篩查與診治提供新思路。

    1 LDLR基因的結構和功能

    LDLR基因位于人類第19號染色體(p13.1-13.3),全長45 kb,包含18個外顯子和17個內(nèi)含子。LDLR在肝臟中分布最多,主要功能是清除血漿LDL,維持體內(nèi)膽固醇代謝平衡[1-2]。LDLR基因表達在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后分別受肝臟X受體(liver X receptor,LXR)和前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin-9(proprotein convertase subtilisin/Kexin type 9,PCSK9)的調(diào)控,同時也受轉(zhuǎn)錄因子膽固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白2(sterol-regulatory element binding protein-2,SREBP-2)的調(diào)控[3-4]。LDLR與LDL在細胞表面結合成復合物并轉(zhuǎn)運到核內(nèi)體,釋放出LDL后又返回細胞膜繼續(xù)轉(zhuǎn)運[1]。LDLR缺乏會導致體內(nèi)LDL代謝受阻,繼而引發(fā)FH,這是開發(fā)他汀類藥物等調(diào)脂藥物的理論基礎。ABIFADEL等[5]發(fā)現(xiàn),PCSK9可降解LDLR,進而導致高膽固醇血癥,這為研制PCSK9抑制劑提供了思路。純合型家族性高膽固醇血癥(homozygous familial hypercholesterolemia,HoFH)是由LDLR基因的雙等位基因突變引起的,危害更大,且他汀類藥物和PCSK9抑制劑對其治療效果有限。近年來,國外研發(fā)出的血管生成素樣蛋白3(angiopoietin-like protein 3,ANGPTL3)抑制劑,具有不依賴LDLR降低血漿LDL-C的特點,可使HoFH患者的LDL-C降低50.9%~90.2%[6-7]。

    2 LDLR基因突變的檢測方法與臨床應用

    2.1 LDLR基因突變的檢測方法

    LDLR基因突變的檢測以往多采用Southern印跡法、原位熒光雜交法、脈沖場凝膠電泳法、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應、變性梯度凝膠電泳和單鏈構象多態(tài)性等方法[8]。近年來,Sanger測序(一代測序)、二代測序(next generation sequencing,NGS)和多重連接依賴性探針擴增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)等技術成為檢測LDLR基因突變的主流方法,其優(yōu)缺點及應用示例見表1[9]。LDLR基因突變的致病性可在LOVD、ClinVar和PubMed等數(shù)據(jù)庫中查詢[10],如查詢不到,則可能為新的突變,可用Sorting Tolerant From Intolerant(SIFT)、PolyPhen-2、FruitFly、Dann和The Combined Annotation Dependent Depletion(CADD)等工具評估新突變的致病性及有害性[11-12]。

    表1 3種常用LDLR基因突變檢測方法的優(yōu)缺點及其應用

    2.2 LDLR基因突變檢測的臨床應用

    LDLR基因突變檢測是FH診斷的金標準[14]。目前報道的LDLR基因突變多達3 050個(來源于ClinVar數(shù)據(jù)庫),其中第4外顯子上的突變最為多見,突變頻率較高的位點有助于FH篩查[15],部分突變的位點見圖1。LDLR基因致病性突變可致相應的氨基酸結構改變,并導致LDLR功能改變,從而影響膽固醇代謝及LDL的清除,最終引發(fā)FH,由其突變導致的FH病例,占所有報道病例的90%以上[14-15]。目前,F(xiàn)H的診斷率為28%~80%,單以臨床癥狀進行診斷的效能有限,有90%以上的患者未得到有效的診斷和治療[15-16]?!都易逍愿吣懝檀佳Y篩查與診治中國專家共識》認為FH的診斷應結合臨床癥狀和基因檢測[14]。同時,也應注意基因檢測結果與臨床診斷之間可能存在不一致的情況[17],特別是植物固醇血癥患者臨床癥狀與部分HoFH患者相似,可通過檢測血漿植物固醇水平及三磷酸腺苷結合盒轉(zhuǎn)運蛋白(adenosine triphosphatebinding cassette,ABC)G5或ABCG8基因突變加以鑒別[18]。

    LDLR基因突變檢測也有助于評估ASCVD風險以及基因變異類型對ASCVD的影響程度。有研究發(fā)現(xiàn),在同等LDL-C水平下,致病性突變攜帶者ASCVD發(fā)生風險高于非攜帶者[19]。TRINDER等[20]通過一項大樣本高膽固醇血癥隊列(277例單基因FH、379例多基因FH)評估基因變異對ASCVD發(fā)生風險的影響,發(fā)現(xiàn)遺傳因素增加ASCVD發(fā)生風險程度由強到弱依次為單基因變異FH患者、多基因變異FH患者、無變異患者。

    圖1 部分LDLR基因突變位點與突變類型示意圖

    此外,LDLR基因檢測還有助于血脂異常患者的治療決策與綜合管理。有研究發(fā)現(xiàn),LDLR基因檢測對調(diào)脂治療的啟動、依從性和更有效降低LDL-C等均有積極作用[16]。LDLR基因檢測可明確FH患者的基因型,不同基因型患者的預后不盡相同,且級聯(lián)篩查的模式和臨床治療方案的選擇也有很大差別,這有助于對患者進行個體化精準治療。未及時治療的FH患兒成年后發(fā)生冠狀動脈事件的風險更高[21],而兒童期被及時診斷和適當治療的FH患兒預期壽命有望達到同齡兒童正常水平,經(jīng)明確診斷和適當治療的成年FH患者也可顯著降低早發(fā)冠心病的風險[22]。

    3 LDLR功能的檢測方法與臨床應用

    3.1 LDLR功能的檢測方法

    LDLR的功能主要是清除血漿LDL[1],研究整個LDLR周期(包括LDLR的表達和LDLR與LDL的結合)可全面反映LDLR的功能。目前,常用的方法包括熒光分析法和放射性分析法,2種方法的比較見表2。因熒光標記LDL是一種更安全且等效的方法,所以放射性分析法正逐漸被熒光分析法取代[2,15]。檢測儀器主要有流式細胞儀(fluorescence-activated cell sorting,F(xiàn)ACS)、共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)等。此外,體外細胞模型可用于研究LDLR基因突變、功能及致病機制,如中國倉鼠卵巢細胞系CHO-ldlA7不表達內(nèi)在LDLR,是研究LDLR功能的優(yōu)秀模型[7]。

    表2 熒光分析法和放射性分析法比較

    3.1.1 熒光分析法 (1)熒光分析法檢測LDLR的表達主要有3種方法。第1種為抗體標記法,用熒光標記IgG-C7,利用FACS檢測細胞熒光強度,可反映LDLR的表達量。IgG-C7是LDLR的單克隆抗體,可定量檢測LDLR的數(shù)量[23];第2種為間接免疫熒光法,將LDLR基因突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO-ldlA7細胞、LDLR抗體和熒光二抗共同孵育后,使用FACS定量檢測熒光強度來反映LDLR的表達量[7];第3種為免疫印跡法,將LDLR基因突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO-ldlA7細胞、LDLR抗體、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體和熒光二抗共同孵育后,量化LDLR蛋白的相對條帶強度,可用于半定量分析CHO-ldlA7細胞中成熟LDLR的表達量[15]。(2)熒光分析法檢測LDLR與LDL結合的能力主要有2種方法。第1種為FACS檢測法,用熒光標記LDL,與LDLR抗體和熒光二抗共同孵育后,通過FACS測定熒光強度,總熒光強度對應細胞內(nèi)攝取LDL的量,可反映LDLR結合LDL的能力。加入臺盼藍,可抑制細胞外部熒光,能更準確地檢測LDLR結合LDL的量[7,24];第2種為CLSM檢測法,采用熒光標記LDL,與LDLR基因突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO-ldlA7細胞共同培養(yǎng),通過CLSM觀察LDLR與LDL的結合。使用CLSM和軟件分析能直觀地觀察細胞,并進行圖像處理和熒光強度量化[7]。

    3.1.2 放射性分析法 (1)LDLR表達的檢測。將125I標記的IgG-C7與LDLR共同孵育,通過化學發(fā)光法檢測細胞的放射性,可反映LDLR的表達量[23]。(2)LDLR與LDL結合能力的檢測。將125I標記到LDL上,懸浮在肝素溶液中,通過化學發(fā)光法檢測肝素的放射性,可反映細胞內(nèi)LDLR結合125I-LDL的能力[25]。

    3.2 LDLR功能檢測的臨床應用

    LDLR功能檢測有助于LDLR基因突變的分類。目前報道的LDLR基因突變中,僅有約15%的LDLR基因突變進行了功能研究[15]。因沒有標準化的突變分類方法[26],根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學會的標準,F(xiàn)H患者中有約50%的相關突變歸為意義未知的突變[27]。只有當突變對LDLR活性及LDL清除有影響時才會被定義為致病突變。LDLR基因突變分類是FH診斷的一部分,只有可能致病和致病突變是臨床診斷的依據(jù)。為了能更好地診治FH患者,根據(jù)LDLR功能來分類突變勢在必行[15]。

    LDLR功能檢測有助于評估LDLR基因突變的致病性。不同類型的LDLR基因突變后受體活性為正常受體活性的2%~80%[7],80%~100%是正常的受體活性,低于80%與受體活性降低(缺陷突變)相關,低于2%與沒有受體活性(“零”突變)相關[15],活性越低后果越嚴重。在大多數(shù)FH類型中,LDLR基因突變會導致LDLR功能降低,但近期BJORNSSON等[28]報道的LDLR基因3′非翻譯區(qū)中的del2.5突變,是目前僅有的一處LDLR功能增益型突變。目前認為,LDLR基因最嚴重的突變是位于第10外顯子上的(1448G>A,p.Trp483X)突變,即第1448位堿基由G突變?yōu)锳,終止密碼子提前出現(xiàn),蛋白質(zhì)翻譯提前終止,導致氨基酸鏈縮短和蛋白質(zhì)分子不完全形成[29]。功能分析表明,W483X突變可導致LDLR結合活性降低17%,LDLR內(nèi)化活性降低39%,降低了LDLR清除體內(nèi)LDL的效率,這是我國南方FH患者和我國普通人群中最常見的致病突變[12,30]。

    LDLR功能檢測有助于指導FH患者的治療。不同基因突變的FH患者治療方式不盡相同,隨著不同的調(diào)脂藥物的應用,通過LDLR功能研究可了解LDLR活性及治療效果,有針對性地選用合適的藥物或其他方法進行調(diào)脂治療,以降低ASCVD的發(fā)生風險,有助于FH患者的綜合管理[11,15]。如HoFH患者不能合成LDLR,對調(diào)脂藥物治療的反應性不好,不經(jīng)治療在30歲之前就可能會發(fā)生心肌梗死;雜合型家族性高膽固醇血癥(heterozygous familial hypercholesterolemia,HeFH)患者癥狀較輕,對調(diào)脂藥物表現(xiàn)出更好的治療反應[30]。

    4 展望

    近年來,越來越多的國家開始重視FH,但因沒有公認的診斷標準、適用于各級實驗室的檢測手段,加之臨床醫(yī)生認知與重視度不夠等原因,導致不能及時、有效地篩查出LDLR基因的致病性突變,F(xiàn)H漏診嚴重,這一現(xiàn)象在發(fā)展中國家,特別是經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)尤為突出。同時,現(xiàn)有的用于治療FH的一線藥物也具有一定的局限性,如需聯(lián)合他汀類藥物與PCSK9抑制劑等昂貴藥物同時治療,常常導致有些FH患者單靠藥物治療并不能達到預期效果。因此,開發(fā)價廉、更快、更準確、不需特殊設備且適用于基層實驗室開展的檢測方法和商品化檢測試劑非常必要,有助于發(fā)現(xiàn)LDLR新的基因突變及潛在的調(diào)脂治療靶點,研制出療效更好的調(diào)脂藥物;也有助于早期高效篩查ASCVD及FH高危人群,以實現(xiàn)早診斷、早治療。同時,還應進一步加強臨床及全社會對FH的危害性和ASCVD早期干預重要性的認識與關注,以幫助防治ASCVD。

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