基于Epac1-MEK 通路探討黃芩苷對脊神經(jīng)結(jié)扎模型大鼠的保護機制

蔣海斌 張鐵峰 連吉 楊建美 柴金花 張蕾 安敏 王學清

（1 蘭州市第一人民醫(yī)院麻醉科,甘肅 蘭州 730050;2 陜西省腫瘤醫(yī)院麻醉科;3 蘭州市第一人民醫(yī)院疼痛科;4 甘肅省第三人民醫(yī)院麻醉科）

神經(jīng)病理性疼痛（NP）是因中樞神經(jīng)或外周神經(jīng)的損傷導(dǎo)致的病理性疼痛〔1〕，臨床特征以自發(fā)疼痛、痛覺過敏、疼痛異常等為主，疾病類型包括三叉神經(jīng)痛、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛等〔2〕，如今隨著社會的發(fā)展，NP 發(fā)病率逐年上升，且目前還沒有特別有效的治療手段，故尋找安全有效的治療藥物是目前臨床的研究熱點〔3〕。黃芩苷（BA）是傳統(tǒng)的清熱解毒中藥黃芩的主要有效活性成分，可抗氧化、抗炎、抗菌，具有鎮(zhèn)靜及減輕心腦血管損傷的作用，能緩解痛風性關(guān)節(jié)炎患者疼痛癥狀，并可降低炎癥因子釋放，改善神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠機械性痛覺超敏癥狀〔4～6〕，但其藥理機制目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細胞活化導(dǎo)致的脊髓背角神經(jīng)炎癥是神經(jīng)病理性疼痛的主要病理基礎(chǔ)〔7〕，環(huán)磷酸腺苷活化交換蛋白（Epac）1 可調(diào)控絲裂原活化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MEK）磷酸化參與介導(dǎo)炎癥過程，下調(diào)Epac 信號可抑制炎癥反應(yīng)，緩解炎癥后痛覺過敏〔8，9〕，因而推測BA 可能通過調(diào)控Epac1-MEK 通路影響炎癥反應(yīng)，進而影響脊神經(jīng)結(jié)扎（SNL）模型大鼠疼痛癥狀，基于此，本研究通過建立SNL 模型大鼠，基于Epac1-MEK 通路探討B(tài)A 對SNL 模型大鼠的保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD 大鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號:SCXK（京）2018-0011，清潔級，體重180～220 g。在清潔級的動物房中適應(yīng)飼養(yǎng)，動物房噪音小于85 db，大鼠飲食、飲水不加限制，通風換氣:10～20 次/h，光照:12 h/12 h 明暗交替循環(huán)，溫度:22～25℃，濕度:55%～65%。

1.1.2 試劑與儀器 BA〔高效液相色譜法（HPLC）≥98%，規(guī)格:20 mg，上海源葉生物科技有限公司，批號:B20570〕；加巴噴丁（GAB，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號:20180612）；腫瘤壞死因子（TNF）-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（批號:ab100785）、白細胞介素（IL）-6 ELISA 試劑盒（批號:ab100772）、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗（批號:ab181602）、兔源Epac1 一抗（批號:ab21236 ）、兔源MEK 一 抗（批號:ab178876）、兔源磷酸化MEK（p-MEK）一抗（批號:ab96379）、羊抗兔二抗（批號:ab150077）均購自美國Abcam 公司；BCA 試劑盒（批號:P0011）、蛋白裂解液（批號:P0013B）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；多道電生理記錄儀（型號:MP160）購自美國BIOPAC 公司；Von Frey 探針（型號:BIO-EVF3）購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；智能熱板儀（型號:ZH-YLS-6B）購自上海珂淮儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號:IBright CL 1500）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；蛋白電泳儀（型號:1659001）、酶標儀（型號:Elx800）、轉(zhuǎn)膜儀（型號:Trans-Blot Turbo）購自美國Bio-Rad 公司等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型制備及分組給藥 參照文獻〔10〕制備SNL 大鼠模型:腹腔注射40 mg/kg 的2.5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，將其以俯臥位固定在操作臺上，找到大鼠背部L5 棘突后水平縱行切開皮膚，鈍性分離、暴露右側(cè)L5 橫突后將其咬除，暴露L5 脊神經(jīng)，以5-0 號絲線結(jié)扎，止血、消毒后逐層縫合傷口。當大鼠術(shù)側(cè)爪出現(xiàn)內(nèi)收，后足輕度外翻和跛行，但并未癱瘓時，表明SNL 模型大鼠建立成功，共建模68只，成功60 只，隨機分為5 組:模型組、BA 低（15 mg/kg）劑量組、BA 中（30 mg/kg）劑量組、BA高（60 mg/kg）劑量組、GAB 組（100 mg/kg），另選取12 只大鼠僅暴露L5 脊神經(jīng)但不結(jié)扎，其余相同操作，設(shè)為假手術(shù)組。

以0.9%NaCl 溶液溶解BA、GAB，具體方法參考文獻〔11〕，分別配制為濃度1.5、3.0、6.0 mg/ml 的BA 溶液，濃度10 mg/ml 的GAB〔12〕溶液，建模成功后，BA 低劑量組、BA 中劑量組、BA 高劑量組及GAB 組大鼠每天灌胃干預(yù)1 次，劑量為10 ml/kg，模型組和對照組每天以10 ml/kg 劑量的0.9%NaCl溶液灌胃干預(yù)1 次，均持續(xù)干預(yù)14 d。

1.2.2 機械性疼痛刺激試驗 第14 天給藥干預(yù)結(jié)束后24 h，使用Von Frey 探針進行機械性疼痛刺激試驗，將大鼠自飼養(yǎng)籠中取出，適應(yīng)一段時間后處于安靜狀態(tài)時，自最小克數(shù)的Von Frey 探針開始刺激大鼠結(jié)扎脊神經(jīng)側(cè)足底6 s，力度以能使腳爪輕度彎曲為準，當大鼠縮爪或添足時（刺激過程中或撤除刺激后出現(xiàn)均可），表示其有疼痛癥狀，記錄此時Von Frey 探針的克數(shù)，即表示大鼠的縮爪閾值，可反映大鼠的機械性痛覺過敏程度，重復(fù)測試3 次，取平均值。

1.2.3 熱敏試驗 機械性疼痛刺激試驗結(jié)束后，使用智能熱板儀進行熱敏試驗，將各組大鼠置于熱板上適應(yīng)一段時間，待其安靜后，打開熱板，設(shè)定并維持溫度在（44±1）℃，當大鼠舔舐結(jié)扎脊神經(jīng)側(cè)足或后肢撤回時，表示其有疼痛癥狀，記錄此時所用時間，即表示大鼠的熱敏潛伏期，可反映大鼠的熱痛覺過敏程度，重復(fù)測試3 次，取平均值（本實驗為最大程度降低皮膚損害大鼠在熱板上最大時間不超過60 s）。

1.2.4 神經(jīng)傳導(dǎo)速率試驗 熱敏試驗結(jié)束后，以1.2.1 中麻醉方法麻醉大鼠，然后以俯臥位將其固定在操作板上，于結(jié)扎脊神經(jīng)側(cè)閉孔附近神經(jīng)區(qū)、同側(cè)頸神經(jīng)踝關(guān)節(jié)區(qū)各插入一個指示電極，分別作為近端刺激點和遠端刺激點，再將一個參比電極插入近端刺激點附近約1 cm 處，以單矩形脈沖刺激0.2 ms，電壓:1.5 V，使用多導(dǎo)生理記錄儀記錄動作電位并計算神經(jīng)傳導(dǎo)速度（m/s）=兩個刺激點之間距離（L）/近端刺激點和遠端刺激點之間的動作電位延遲時間差（T），重復(fù)測試3 次，取平均值。

1.2.5 大鼠血清中IL-6、TNF-α 水平測定 神經(jīng)傳導(dǎo)速率試驗結(jié)束后，各組大鼠以注射器自尾靜脈采血，靜置，離心，小心吸出上清液（血清），以試劑盒通過ELISA 測定其中IL-6、TNF-α 水平。

1.2.6 各組大鼠脊髓組織Epac1-MEK 通路相關(guān)蛋白表達的檢測 尾靜脈取血后將大鼠斷頭處死，解剖，取出腰椎中脊髓組織，剪為小碎塊后置于含有蛋白裂解液的玻璃管中，勻漿，離心，以試劑盒通過BCA 法測定上清中的總蛋白濃度，具體操作步驟按照說明書指導(dǎo)進行，分別取含相同質(zhì)量總蛋白的各組蛋白樣品液上樣，十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），濕轉(zhuǎn)，以5%的脫脂奶粉室溫封閉聚偏氟乙烯（PVDF）膜上蛋白，將GAPDH、Epac1、MEK 及p-MEK 蛋白條帶截取下，分別置于孵育盒中孵育一抗，洗膜后孵育二抗，洗膜后通過增強化學發(fā)光法顯色，以凝膠成像儀拍攝條帶，并以Image Lab 軟件分析圖像，定量各蛋白灰度值后，統(tǒng)計分析得出其相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS24.0 軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠縮爪閾值 與假手術(shù)組比較，模型組縮爪閾值顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，BA 低劑量組、BA 中劑量組、BA 高劑量組及GAB 組大鼠縮爪閾值增高且BA 各組之間呈劑量依賴性（P＜0.05）；BA 高劑量組與GAB 組比較無顯著差異（P＞0.05），見表1。

2.2 各組熱敏刺激測定結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組熱敏潛伏期顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，BA 低劑量組、BA 中劑量組、BA 高劑量組及GAB 組熱敏潛伏期增高且BA 各組之間呈劑量依賴性（P＜0.05）；BA 高劑量組與GAB 組比較無顯著差異（P＞0.05），見表1。

2.3 各組神經(jīng)傳導(dǎo)速度 與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)傳導(dǎo)速度顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，BA 低劑量組、BA 中劑量組、BA 高劑量組及GAB 組大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)速度增高且BA 各組之間呈劑量依賴性（P＜0.05）；BA 高劑量組與GAB 組比較無顯著差異（P＞0.05），見表1。

2.4 各組血清中IL-6、TNF-α 水平 與假手術(shù)組比較，模型組血清中IL-6、TNF-α 水平顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，BA 低劑量組、BA 中劑量組、BA 高劑量組及GAB 組血清中IL-6、TNF-α 水平降低且BA 各組之間呈劑量依賴性（P＜0.05）；BA 高劑量組與GAB 組比較，無顯著差異（P＞0.05），見表1。

2.5 各組脊髓組織Epac1-MEK 通路相關(guān)蛋白表達 與假手術(shù)組比較，模型組脊髓組織Epac1、p-MEK蛋白表達顯著增高（P＜0.05），MEK 蛋白表達無顯著差異（P＞0.05）；與模型組比較，BA 低劑量組、BA中劑量組、BA 高劑量組及GAB 組脊髓組織Epac1、p-MEK 蛋白表達降低且BA 各組之間呈劑量依賴性（P＜0.05），MEK 蛋白表達無顯著差異（P＞0.05）；BA 高劑量組與GAB 組比較無顯著差異（P＞0.05），見表1、圖1。

表1 各組縮爪閾值、熱敏潛伏期、神經(jīng)傳導(dǎo)速度、血清IL-6、TNF-α 水平、Epac1-MEK 通路相關(guān)蛋白表達比較(,n=12)

表1 各組縮爪閾值、熱敏潛伏期、神經(jīng)傳導(dǎo)速度、血清IL-6、TNF-α 水平、Epac1-MEK 通路相關(guān)蛋白表達比較(,n=12)

與假手術(shù)組比較:1）P＜0.05；與模型組相比:2）P＜0.05；與BA 低劑量組相比:3）P＜0.05；與BA 中劑量組相比:4）P＜0.05

圖1 Western 印跡檢測各組脊髓組織Epac1-MEK 通路相關(guān)蛋白表達

3 討論

NP 致病因素很多，其中帶狀皰疹、糖尿病導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)病變、感覺神經(jīng)系統(tǒng)受損、截肢手術(shù)等是其中主要的幾種〔13〕，隨著NP 病情進展，患者疼痛加重，輾轉(zhuǎn)難眠，最終可造成抑郁、焦慮等精神障礙疾病，嚴重影響患者正常工作生活，危害其身心健康〔14〕，因此找到NP 的有效治療手段具有重大的臨床和社會意義。SNL 模型能較全面地反映NP 患者痛覺過敏、自發(fā)性疼痛等臨床癥狀，廣泛應(yīng)用于NP的基礎(chǔ)研究中〔15〕，另有研究顯示〔16〕，當機體外周或中樞神經(jīng)受到損傷時，活化的免疫細胞可合成分泌IL-6、TNF-α 等炎癥因子，引發(fā)神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致神經(jīng)疼痛。本研究通過建立SNL 模型大鼠進行實驗，結(jié)果顯示，建模大鼠血清IL-6 及TNF-α 水平顯著增高，表明建模大鼠發(fā)生神經(jīng)炎癥反應(yīng)，另外大鼠熱敏潛伏期、縮爪閾值、神經(jīng)傳導(dǎo)速度相比正常大鼠也顯著降低，表明大鼠機械性及熱痛覺過敏，出現(xiàn)疼痛癥狀，且神經(jīng)傳導(dǎo)功能顯著損傷，揭示SNL 模型建立成功。

BA 作為傳統(tǒng)中藥黃芩的主要有效成分，據(jù)張仲景《傷寒雜病論》記載，具有清熱解毒，涼血燥濕之功效，可用于組成治療疼痛的組方，并對神經(jīng)病理性疼痛大鼠機械性痛覺超敏癥狀具有改善作用〔6，17〕，但其具體作用機制目前還未完全闡明。有研究認為，神經(jīng)損傷能導(dǎo)致脊髓小膠質(zhì)細胞的異?；罨蛊洚a(chǎn)生大量炎性細胞因子、介質(zhì)及神經(jīng)活性分子，進而促進病理性疼痛的進一步發(fā)展和持續(xù)〔18〕，Epac1可介導(dǎo)MEK 的激活，調(diào)控其磷酸化水平，進而參與炎癥的發(fā)生及發(fā)展〔8，9〕，另外Epac1 信號還可介導(dǎo)持續(xù)性炎性疼痛及慢性疼痛的發(fā)生及進展，下調(diào)該信號可減輕疼痛，緩解手術(shù)后疼痛〔19，20〕，表明Epac1-MEK 通路是調(diào)控SNL 模型大鼠疼痛癥狀的重要信號，但BA 對SNL 大鼠脊髓Epac1-MEK 通路的影響目前并不清楚，本研究實驗結(jié)果表明BA 可下調(diào)Epac1-MEK 信號通路蛋白表達，抑制大鼠神經(jīng)炎癥，緩解其機械性和熱痛覺過敏癥狀，修復(fù)大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)功能，高劑量的BA 與陽性對照藥GAB 的療效相似，揭示BA 可抑制Epac1-MEK 信號激活，并改善SNL 大鼠神經(jīng)疼痛癥狀。

綜上所述，BA 可降SNL 模型大鼠脊髓炎性因子水平，抑制神經(jīng)炎癥，減輕其疼痛癥狀，并修復(fù)大鼠受損神經(jīng)傳導(dǎo)功能，最終緩解其臨床癥狀，干擾Epac1-MEK 信號途徑傳導(dǎo)可能是其藥理機制之一，但本研究尚未通過該通路激動劑和抑制劑做回復(fù)實驗，進行對照驗證，證據(jù)還存在一定不足，后續(xù)還會繼續(xù)研究，以便深入探討B(tài)A 治療NP 的藥理機制。