PVT1通過調(diào)節(jié)miR-486-3p/MAPK14軸降低食管癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性①

盧萬里 金 哲 段東奎 王 錚 裴書飛（南陽市中心醫(yī)院胸外科，南陽 473000）

食管癌作為一種難以治療的惡性腫瘤，在我國其發(fā)病率居惡性腫瘤的第6位，病死率第4位，并且其 中90%的患者為鱗癌［1］。順 鉑（cis-platinum，DDP）是食管癌化療的主要藥物，但治療期間腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的耐藥性會導(dǎo)致療效降低［2］。目前腫瘤對DDP耐藥性的具體機(jī)制仍未闡明，引起DNA損傷導(dǎo)致細(xì)胞毒性作為DDP的主要作用機(jī)制，相關(guān)研究顯示長鏈非編碼RNA（LncRNA）在DNA損傷反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，PVT1是位于8號染色體長臂2區(qū)4帶（8q24），這一區(qū)域包含多種疾病的風(fēng)險位點(diǎn)，屬于癌癥風(fēng)險區(qū)域［3-5］。相關(guān)研究顯示，PVT1能夠顯著降低腫瘤細(xì)胞對DDP藥物的敏感性，但其具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚［6］。微小RNA（miRNA）作為片段較小的非編碼RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后水平來調(diào)控基因的翻譯，在人類的許多病理生理進(jìn)程中均發(fā)揮重要作用，并且有研究表示miRNA是LncRNA發(fā)揮作用的重要環(huán)節(jié)［7］。本研究通過構(gòu)建PVT1過表達(dá)和敲除食管癌細(xì)胞系，探究PVT1影響食管癌細(xì)胞DDP化學(xué)敏感性的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 食管癌細(xì)胞系（KYSE450、KYSE70、Eca-109、COLO-680N）和永生化人食管上皮細(xì)胞系HET-1A（上海細(xì)胞庫）；PVT1敲除、過表達(dá)腺病毒包裝載體，miR-486-3p過表達(dá)質(zhì)粒及其對應(yīng)的空白載體，MAPK14過表達(dá)載體（上海吉瑪基因公司）；Lipofectamine?2000、ECL Kit（Thermo Fisher Scientific）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）；DNR BioImaging System（DNR，Israel）；CCK-8試劑盒（Dojindo）；注射用DDP（凍干型）（齊魯制藥有限公司）；10%胎牛血清（Sigma-Aldrich）；青霉素（MerckKGaA）；鏈霉素（Darmstadt）；TRIzol Kit（Thermo Fisher Scientific）；Revertaid First Strand cDNA Kit（Thermo Fisher）；SYBRGreen PCR（TaKaRa）；PVDF膜（Millipore公司）；PIPA蛋白裂解液（西隴化工有限公司）、兔抗人MRP1、P-gp、Bax、Bcl-2、MAPK14、β-actin抗體（美國CST公司）；Western blot凝膠試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；LightCyler96實時熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）；可見熒光免疫印跡成像系統(tǒng)（美國Azure公司）；蛋白垂直電泳槽、電泳儀電源、電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（美國Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 食管癌細(xì)胞株系KYSE450、KYSE70、Eca-109、COLO-680N以及永生化人食管上皮細(xì)胞系HET-1A培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素或鏈霉素的完全RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，并在37℃、5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)期，0.25%胰蛋白酶消化液處理制成細(xì)胞懸液。RT-qPCR檢測4種食管癌細(xì)胞株系中PVT1、miR-486-3p相對表達(dá)水平，并從中挑選出表達(dá)量最低的Eca-109作為后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染背景。

1.2.2 DDP耐藥性細(xì)胞株培養(yǎng) 選取Eca-109為培養(yǎng)株系，參考文獻(xiàn)［3］的方法：在親本細(xì)胞中最初使用含0.1μmol/L DDP的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并逐步增加培養(yǎng)基DDP濃度至10μmol/L以提高細(xì)胞耐藥性狀，保證6個月后細(xì)胞能夠在10μmol/L的DDP培養(yǎng)基中增殖即暴露于DDP中沒有生長抑制，同時在不含DDP的培養(yǎng)基中傳代超過15代依然保持其DDP耐藥性。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗 將Eca-109/DDP細(xì)胞株置于DMEM培養(yǎng)基（含有10%小牛血清）于37℃、5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)至對數(shù)時期，生理鹽水漂洗、0.25%胰蛋白酶消化液處理2 min，棄除胰蛋白酶，再加入完全培養(yǎng)基洗脫細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液；參照試劑盒操作說明并采用Lipofectamine?2000將sh-PVT1、Ad-PVT1、miR-486-3p inbibitor、miR-486-3p mimic、Ad-PVT1+miR-486-3p mimic、pLenti-CMVMAPK14、sh-PVT1+MAPK14轉(zhuǎn) 染 至Eca-109/DDP細(xì)胞株，并根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進(jìn)行命名。

1.2.4 實時熒光定量PCR試驗Trizol法提取轉(zhuǎn)染成功的各組Eca-109/DDP細(xì)胞中總RNA，利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)PCR定量試劑盒中試劑說明書進(jìn)行實時定量PCR檢測。PCR反應(yīng)于Roche LightCycler 96型實時定量PCR儀中進(jìn)行，條件為56℃2 min，95℃2 min，95℃15 s→60℃1 min，共40次循環(huán)，選用β-actin作為內(nèi)源對照基因，每次實驗進(jìn)行3個技術(shù)重復(fù)。以2-ΔΔCt計算待檢測基因的相對表達(dá)量。

1.2.5 雙熒光素酶報告試驗 搜索NCBI數(shù)據(jù)庫獲取PVT1基因的3'-UTR序列，以基因組DNA為模板擴(kuò)張合成3'-UTR序列片段，經(jīng)過酶切、純化后與雙熒光素酶報告載體進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，將陽性克隆轉(zhuǎn)化子接種于含氨芐霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～16 h，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。將含有目的序列的野生型質(zhì)粒命名為PVT1-WT，經(jīng)定點(diǎn)突的突變型質(zhì)粒命名為PVT1-MUT；培養(yǎng)Eca-109/DDP細(xì)胞至指數(shù)生長期，消化后吹打成細(xì)胞懸液，接種在24孔的培養(yǎng)板中，每孔1×105個細(xì)胞，37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度在60%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將X-tremegene HP轉(zhuǎn)染試劑以及質(zhì)粒按照1μg∶2μl比例移至100μl的opti-MEM中輕柔混勻室溫靜置20 min，將混合液輕輕移至細(xì)胞中，37℃、5%CO2培養(yǎng)5～6 h后加入含10%血清的完全培養(yǎng)基200μl；48 h后，吸去24孔板中的培養(yǎng)基，加入1×Passive Lysis Buffer 300μl，4℃冰箱中反應(yīng)20 min，待細(xì)胞充分裂解后，振蕩3～5 min，吸取40μl細(xì)胞裂解液在Lockwell maxisorp檢測板上，加入20μl Luciferase Assay Reagent，混勻后利用酶標(biāo)儀檢測熒光酶熒光值，檢測完后加入20μl Stop &Glo?Reagent，振蕩混勻后靜置3 min進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測熒光素酶，收集、分析數(shù)據(jù)計算熒光素酶活性。

1.2.6 CCK-8法檢測DDP耐藥性 將Eca-109/DDP細(xì)胞接種在96孔板上，每孔加入100μl細(xì)胞懸液，使每孔中細(xì)胞為5×104個，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，用不同濃度的DDP（2.5、5、10、20、40、80μmol/L）分別處理24 h；更換含10%CCK-8的培養(yǎng)液后，培養(yǎng)1 h，在酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測其OD值。細(xì)胞活力（%）=（DDP處理組OD值-空白對照組OD值）/（對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。同時計算出DDP的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將各組Eca-109/DDP細(xì)胞懸浮液密度調(diào)整為4×104個/ml，接種于6孔板中、400μl/孔，每組3個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌2遍，棄上清液，加入試劑盒中的緩沖液，混勻，再加入5μl Annexin V/FITC、10μl PI混合，室溫避光孵育15 min，用于流式細(xì)胞儀上樣檢測，Cell Quest軟件分析計算細(xì)胞凋亡率。

1.2.8 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 將處理后的各組細(xì)胞接種于6孔板上，吸去培養(yǎng)基溶液后，PBS緩沖液清洗3次，在每孔中加入100μl 4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，BCA法提取各組細(xì)胞蛋白并通過Bradford調(diào)整各組蛋白濃度一致。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至甲醛預(yù)處理過的PVDF膜，密封2 h，加入兔抗人MRP1、P-gp、Bax、Bcl-2、MAPK14、β-actin（1∶500）一抗4℃孵育過夜，TBST漂洗40 min，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶500）孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL發(fā)光液將PVD膜顯色，暗室曝光到X線片上，采用Imaging System軟件分析各組條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參積分吸光度值比值表示蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 本文計量資料均以±s表示，并進(jìn)行至少3個獨(dú)立檢驗，采用GraphPad Prism與SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗或單因素方差檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PVT1、miR-486-3p在食管癌細(xì)胞系中表達(dá)情況qRT-PCR試驗結(jié)果（圖1）表明：PVT1在KYSE450、KYSE70、Eca-109、COLO-680N等食管癌細(xì)胞系中表達(dá)水平顯著升高（均P＜0.05），miR-486-3p的表達(dá)水平顯著降低（均P＜0.05），其中Eca-109細(xì)胞株系中PVT1、miR-486-3p表達(dá)水平的變化更顯著（P＜0.01）。

圖1 PVT1、miR-486-3p在食管癌細(xì)胞系中表達(dá)情況Fig.1 Expressions of PVT1 and miR-486-3p in esophageal cancer cell lines

2.2 PVT1靶向抑制miR-486-3p表達(dá) 生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果（圖2A）顯示：PVT1與miR-486-3p存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)；qRT-PCR試驗結(jié)果（圖2B～F）顯示：sh-PVT1轉(zhuǎn)染后，Eca-109/DDP株系中PVT1相對表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），腺病毒包裝載體Ad-PVT1轉(zhuǎn)染后，Eca-109/DDP株系中PVT1相對表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001），miR-486-3p inhibitor轉(zhuǎn)染后，Eca-109/DDP株系中miR-486-3p的相對表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），miR-486-3p mimic轉(zhuǎn)染后，Eca-109/DDP株系中miR-486-3p的相對表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001），在過表達(dá)miR-486-3p的Eca-109/DDP株系中同時過表達(dá)PVT1能夠降低過表達(dá)miR-486-3p引起的miR-486-3p表達(dá)水平升高；雙熒光素酶報告試驗結(jié)果（圖2G）顯示：在PVT1-WT中轉(zhuǎn)染miR-486-3p mimic后，熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而在PVT1-MUT中轉(zhuǎn)染miR-486-3p mimic后熒光素酶活性無顯著變化（P＞0.05），說明PVT1靶向抑制miR-486-3p表達(dá)。

圖2 PVT1靶向抑制miR-486-3p表達(dá)Fig.2 Targeted inhibition of miR-486-3p expression by PVT1

2.3 PVT1靶向抑制miR-486-3p表達(dá)降低Eca-109/DDP細(xì)胞對DDP的敏感性CCK-8試驗結(jié)果（圖3A、B）顯示：過表達(dá)miR-486-3p后，Eca-109/DDP細(xì)胞的IC50、細(xì)胞增殖活性均明顯降低（P＜0.01），過表達(dá)PVT1后，Eca-109/DDP細(xì)胞的IC50、細(xì)胞增殖活性均明顯升高（P＜0.01），與過表達(dá)miR-486-3p比較，共同過表達(dá)PVT1、miR-486-3p后，Eca-109/DDP細(xì)胞的IC50、細(xì)胞增殖活性均明顯升高（P＜0.05）；Western blot檢測結(jié)果（圖3C）顯示：過表達(dá)miR-486-3p后MRP1、P-gp表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），過表達(dá)PVT1后MRP1、P-gp表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），與過表達(dá)miR-486-3p比較，共同過表達(dá)PVT1、miR-486-3p后，MRP1、P-gp表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。

圖3 PVT1靶 向 抑 制miR-486-3p對Eca-109/DDP細(xì) 胞DDP耐藥性的影響Fig.3 Targeted inhibition of effects of miR-486-3p on DDP resistance of Eca-109/DDP cells by PVT1

2.4 PVT1靶向抑制miR-486-3p表達(dá)抑制Eca-109/DDP細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞檢測結(jié)果（圖4A）顯示：過表達(dá)miR-486-3p后，Eca-109/DDP細(xì)胞的凋亡率顯著升高，過表達(dá)PVT1后，Eca-109/DDP細(xì)胞的凋亡率顯著降低，與過表達(dá)miR-486-3p比較，共同過表達(dá)PVT1、miR-486-3p后，Eca-109/DDP細(xì)胞的凋亡率明顯降低；Western blot檢測結(jié)果（圖4B）顯示：過表達(dá)miR-486-3p后Bcl-2表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），Bax表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），過表達(dá)PVT1后Bcl-2表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），Bax表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），與過表達(dá)miR-486-3p比較，共同過表達(dá)PVT1、miR-486-3p后Bcl-2表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），Bax表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。

圖4 PVT1靶向抑制miR-486-3p抑制Eca-109/DDP細(xì)胞凋亡Fig.4 Targeted inhibition of the inhibition effect of miR-486-3p on apoptosis of Eca-109/DDP cells by PVT1

2.5 PVT1促進(jìn)MAPK14表達(dá)降低DDP敏感性并抑制細(xì)胞凋亡 通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果（圖5A）顯示：miR-486-3p與MAPK14存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)；qRT-PCR結(jié)果（圖5B）顯示，MAPK14在KYSE450、KYSE70、Eca-109、COLO-680N等食管癌細(xì)胞系中表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；相關(guān)試驗結(jié)果（圖5C～F）顯示：敲除PVT1后，MAPK14表達(dá)水平、IC50、細(xì)胞增殖活性均顯著降低（P＜0.05），凋亡率顯著升高（P＜0.05），過表達(dá)MAPK14后，MAPK14表達(dá)水平、IC50、細(xì)胞增殖活性均顯著升高（P＜0.05），凋亡率顯著降低（P＜0.05）。

圖5 PVT1促進(jìn)MAPK14表達(dá)對Eca-109/DDP細(xì)胞DDP敏感性及凋亡率的影響Fig.5 Promotion of effects of MAPK14 expression on DDP sensitivity and apoptosis rate of Eca-109/DDP cells by PVT1

3 討論

DDP是一種廣譜的抗腫瘤藥物，在細(xì)胞內(nèi)形成DNA-Pt加合物引起DNA損傷進(jìn)而引起細(xì)胞毒性，作為食管鱗癌的治療常用化療藥物，大部分治療有效患者經(jīng)過一定時間的緩解期后，復(fù)發(fā)時用藥會出現(xiàn)耐藥性，而復(fù)發(fā)后的食管鱗癌患者的治療手段較少，因此研究食管鱗癌細(xì)胞對DDP耐藥的機(jī)制顯得尤為重要［8-9］。近年來研究證實DNA損傷會引起LncRNA表達(dá)譜的顯著變化，PVT1作為一種致癌基因，在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平升高，并且與腫瘤的發(fā)生進(jìn)展關(guān)系密切，除此之外，在腫瘤細(xì)胞對DDP、吉西他濱、鬼臼苦素等藥物的敏感性方面有著密切關(guān)系，并可能與影響DNA損傷修復(fù)有關(guān)［10-12］。

本次研究結(jié)果顯示，在食管癌細(xì)胞系中，PVT1的相對表達(dá)水平顯著升高，而miR-486-3p的相對表達(dá)水平顯著降低，而通過生物信息學(xué)軟件進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，兩者存在互補(bǔ)配對位點(diǎn)，同時雙熒光素酶報告試驗也進(jìn)一步證實了兩者的靶向關(guān)系，并且為PVT1靶向負(fù)調(diào)控miR-486-3p表達(dá)。miR-486-3p作為一種抑癌基因，在宮頸癌中能夠靶向ECM1基因進(jìn)而抑制癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并且還能夠作為檢測口腔是鱗狀細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物［13-14］，但目前miR-486-3p與DDP耐藥性之間的相關(guān)研究鮮少報道。本次研究通過構(gòu)建miR-486-3p mimic質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Eca-109/DDP細(xì)胞株系中，發(fā)現(xiàn)其DDP的IC50顯著降低，并且細(xì)胞增殖活性也顯著降低，對調(diào)控細(xì)胞耐藥性的關(guān)鍵蛋白MRP1、P-gp檢測發(fā)現(xiàn)其表達(dá)也顯著降低，表明miR-486-3p可能具有提高癌細(xì)胞DDP藥物敏感性的作用［15-16］。同時本研究共轉(zhuǎn)染Ad-PVT1后發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染miR-486-3p相比，共轉(zhuǎn)染后Eca-109/DDP細(xì)胞株系DDP的IC50、細(xì)胞增殖、MRP1、P-gp表達(dá)水平均明顯升高，表明PVT1可能通過靶向抑制miR-486-3p表達(dá)，誘導(dǎo)耐藥性相關(guān)蛋白的表達(dá)升高，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的耐藥性。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，miR-486-3p mimic轉(zhuǎn)染后，Eca-109/DDP細(xì)胞株的凋亡率顯著升高，促凋亡蛋白Bax表達(dá)顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平顯著降低，而共轉(zhuǎn)染Ad-PVT1后能夠降低細(xì)胞凋亡率及促凋亡蛋白Bax表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)［17-18］。

MAPK信號通路是真核生物信號傳遞過程中較為重要的途徑，不僅能夠在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，還能夠參與調(diào)控腫瘤的耐藥性［17-18］。本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-486-3p與MAPK14具有潛在的結(jié)合位點(diǎn)，并且MAPK14在食管癌細(xì)胞系中表達(dá)水平顯著升高，表明miR-486-3p可能通過抑制MAPK14表達(dá)進(jìn)而調(diào)控腫瘤發(fā)生進(jìn)展。sh-PVT1轉(zhuǎn)染后，Eca-109/DDP細(xì)胞株DDP的IC50、細(xì)胞增殖活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，而pLenti-CMV-MAPK14轉(zhuǎn)染后，Eca-109/DDP細(xì)胞株DDP的IC50、細(xì)胞增殖活性顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，而與sh-PVT1相比，共同轉(zhuǎn)染pLenti-CMV-MAPK14能夠顯著緩解Eca-109/DDP細(xì)胞的表型變化，提示PVT1可能通過靶向抑制miR-486-3p表達(dá)，解除對MAPK14的抑制作用，進(jìn)而降低食管癌細(xì)胞的DDP敏感性。

綜上所述，LncRNA間的相互作用在調(diào)控食管癌細(xì)胞DDP耐藥性的機(jī)制中起重要作用，而MAPK作為機(jī)體重要的信號通絡(luò)，在DDP耐藥性中也發(fā)揮重要的作用。本次研究發(fā)現(xiàn)，Lnc RNA PVT1可能通過調(diào)節(jié)miR-486-3p/MAPK14軸誘導(dǎo)耐藥性基因表達(dá)降低食管癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性，同時還能夠降低細(xì)胞凋亡率，但PVT1是否還能夠通過其他途徑影響食管癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性還有待深入研究。