CCL14是肺腺癌患者預后和免疫浸潤的標志物①

劉華松 賀方麗 徐蘭蘭（湖北醫(yī)藥學院附屬十堰市太和醫(yī)院胸心外科，十堰 442012）

肺癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率和高死亡率特點［1-2］。肺癌進展到晚期的原因之一是抗腫瘤免疫機制異常紊亂。例如，腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）在抗腫瘤免疫監(jiān)視過程中扮演重要角色，且與肺癌癥患者總生存期（overall survival，OS）相關［3-4］。細胞毒性T細胞，又名CD8+T細胞，能直接識別主要組織相容性復合體Ⅰ（major histocompatibility complex classⅠ，MHCⅠ）類分子提呈抗原，進而殺傷腫瘤細胞［5］。這可延緩腫瘤進展，進而改善癌癥患者的預后。VIHERVUORI等［6］報道TILs和CD8+T細胞與細胞周期中后期調(diào)節(jié)因子水平相關，可預測三陰性乳腺癌患者的預后，表明針對性調(diào)節(jié)TILs進行治療有望延長癌癥患者的遠期預后。

趨化因子能發(fā)揮誘導反應細胞定向趨化的能力。近年來，越來越多的研究證實趨化因子在癌癥進展過程中具有重要作用［7-9］。例如，CAO等［10］發(fā)現(xiàn)單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、巨噬細胞炎性蛋白1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）、MIP-1β、IL-8、生長調(diào)節(jié)致癌基因α（growth-regulated oncogeneα，GROα）、干擾素γ誘導蛋白10（interferon gamma-induced protein-10，IP-10）等在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）組織中的表達顯著高于腫瘤相鄰組織和正常肺組織。升高GROα、IP-10、INF-γ的表達水平與NSCLC患者無進展生存期（progressionfree survival，PFS）有關。NAUMNIK等［11］報道B細胞誘導趨化因子1（B cell-attracting chemokine 1，BCA-1）在NSCLC患者組織樣本中表達水平升高，升高其表達水平與NSCLC患者的預后有關。ZHOU等［12］報道NSCLC組織中miR-135a表達水平下降，而胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱Akt）表達顯著升高。上調(diào)miR-135a表達能抑制NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲能力，促進細胞凋亡，并降低IGF-1、PI3K、Akt、血管內(nèi)皮生長因子A（vscular endothelial growth factor A，VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、IL-8 mRNA和蛋白表達水平。然而，趨化因子CCL14在肺腺癌患者預后和免疫浸潤中的作用價值仍不明確。因此，本研究利用UALCAN、Timer、GEPIA和TISIDB數(shù)據(jù)庫探究CCL14在肺腺癌進展和免疫浸潤中的作用價值，鑒別CCL14是否是肺腺癌患者預后和免疫浸潤的標志物，為肺腺癌的治療提供新的靶分子。

1 資料與方法

1.1 UALCAN數(shù)據(jù)庫UALCAN數(shù)據(jù)庫是基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫建立起的二次分析網(wǎng)站［13］。在本研究中，首先輸入CCL14基因名，選擇癌癥類型為肺腺癌。探索CCL14在肺腺癌組織中的表達及其與肺腺癌患者臨床病理學特征和預后間的關系。

1.2 Timer數(shù)據(jù)庫Timer數(shù)據(jù)庫是目前常用的癌癥免疫浸潤標志物數(shù)據(jù)庫之一［14］。在Timer數(shù)據(jù)庫中，使用基因模塊分析CCL14表達水平與肺腺癌B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）和嗜中性粒細胞間的關系。在相關性分析模塊中探究CCL14表達水平與肺腺癌B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、DCs和嗜中性粒細胞標志物間的關系。

1.3 TISIDB數(shù)據(jù)庫TISIDB數(shù)據(jù)庫是常用的癌癥免疫浸潤標志物數(shù)據(jù)庫之一［15］。在TISIDB數(shù)據(jù)庫中輸入CCL14，探究CCL14可能涉及肺腺癌進展的生物學功能、分子功能、細胞組成和信號調(diào)節(jié)機制。

1.4 GEPIA數(shù)據(jù)庫 在GEPIA數(shù)據(jù)庫中，使用來源于TCGA數(shù)據(jù)庫的正常肺組織（n=59）和肺腺癌組織（n=483）基因表達數(shù)據(jù)，以及GTEx數(shù)據(jù)庫的正常肺組織（n=288）基因表達數(shù)據(jù)［16］。分析CCL14在肺腺癌和正常肺組織中的表達譜，并探究其表達水平與肺腺癌患者臨床分期和預后間的關系。在相關性分析模塊中驗證了肺腺癌組織中CCL14表達水平與免疫細胞標志物間是否具有相關性。

2 結(jié)果

2.1 CCL14在肺腺癌組織中表達降低，且與肺腺癌患者臨床分期、性別、吸煙史、組織學亞型和TP53突變相關 在GEPIA數(shù)據(jù)庫中，發(fā)現(xiàn)CCL14在肺腺癌組織中的差異具有統(tǒng)計學意義（圖1A、B）。此外，在UALCAN數(shù)據(jù)庫中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果（圖2A）。CCL14表達水平與肺腺癌患者臨床分期、性別、吸煙史、組織學亞型和TP53突變相關（圖1C、表1）。

圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫中CCL14表達下降與肺腺癌患者臨床分期和預后不良相關Fig.1 Decreased expression of CCL14 in GEPIA database is associated with the clinical stage and poor prognosis of lung adenocarcinoma patients

2.2 CCL14表達水平下降的肺腺癌患者預后不良 在GEPIA數(shù)據(jù)庫中，Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)CCL14表達水平降低的肺腺癌患者OS和無病生存期（disease-free survival，DFS）較差（圖1D）。然而CCL14表達水平與肺腺癌患者DFS間的統(tǒng)計學分析不具有統(tǒng)計學意義。在UALCAN數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，CCL14表達水平降低的肺腺癌患者OS較差（圖2B）。提示上調(diào)CCL14表達水平的肺腺癌患者的預后更好。

圖2 UALCAN數(shù)據(jù)庫中CCL14表達下降與肺腺癌患者預后不良相關Fig.2 Decreased expression of CCL14 in UALCAN database is associated with poor prognosis of lung adenocarcinoma patients

2.3 CCL14表達水平與肺腺癌免疫細胞浸潤標志物相關CCL14表達水平與肺腺癌純度、免疫B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、DCs和嗜中性粒細胞相關，具體數(shù)據(jù)見圖3。在此基礎上，課題組探究趨化因子CCL14在肺腺癌免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用。

圖3 CCL14表達水平與肺腺癌純度和免疫細胞相關Fig.3 CCL14 expression level is correlated with lung adenocarcinoma purity and immune cells

在Timer數(shù)據(jù)庫中，CCL14表達水平與CD3E、CD2、CD19、CD79A、CD86、CSF1R、CCL2、CD68、IL10、NOS2、PTGS2、CD163、VSIG4、MS4A4A、CEACAM8、ITGAM、CCR7、KIR2DL4、KIR3DL3、HLA-DPB1、STAT1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLADPA1、CD1C、NRP1、ITGAX、TBX21、STAT4、IFNG、STAT6、STAT5A、IL-13、BCL6、IL-21、STAT3、STAT5B、TGFB1、LAG3、HAVCR2和GZMB表達水平具有顯著相關性。見圖4～6、附表1（http：//www.immune 99.com）。

圖4 CCL14表達水平與肺腺癌B細胞和單核細胞標志物相關Fig.4 CCL14 expression level is correlated with lung adenocarcinoma B cell and monocyte markers

表1 CCL14表達水平與肺腺癌患者臨床病理學特征相關Tab.1 CCL14 expression level is correlated with clinicopathological characteristics of patients with lung adenocarcinoma

進一步使用GEPIA數(shù)據(jù)庫鑒別上述標志物在肺腺癌組織中的表達水平與CCL14表達水平之間的關系。結(jié)果表明CCL14表達水平與CD3E、CD2、CD19、CD79A、CD86、CSF1R、CCL2、CD68、IL-10、CD163、VSIG4、MS4A4A、IFNG、STAT6、STAT5A、IL-13、BCL6、CEACAM8、ITGAM、CCR7、KIR2DL4、HLA-DPB1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLA-DPA1、CD1C、ITGAX、STAT4、STAT5B、TGFB1和HAVCR2表達水平相關（表2）。

表2 GEPIA數(shù)據(jù)庫中分析CCL14表達水平與肺腺癌免疫浸潤標志物水平之間的相關性Tab.2 Correlation between CCL14 expression level and lung adenocarcinoma immune infiltration marker level in GEPIA database

2.4 CCL14在肺腺癌進展中的生物學價值和可能調(diào)節(jié)機制 在TISIDB數(shù)據(jù)庫中，CCL14與癌癥中性粒細胞趨化性、白細胞趨化性、淋巴細胞趨化性、調(diào)節(jié)炎癥反應等生物學功能相關；KEGG結(jié)果顯示CCL14參與細胞因子與細胞因子受體的相互作用和趨化因子信號通路（表3）。

表3 CCL14參與癌癥生物學功能和免疫調(diào)節(jié)機制Tab.3 CCL14 is involved in cancer biological function and immune regulation mechanism

圖5 CCL14表達水平與肺腺癌M2巨噬細胞和TAM細胞標志物相關Fig.5 CCL14 expression level is correlated with lung adeno-carcinoma M2 macrophages and TAM cell markers

圖6 CCL14表達水平與肺腺癌DC標志物相關Fig.6 CCL14 expression level correlated with lung adenocarcinoma DC markers

3 討論

肺腺癌是最常見的NSCLC類型之一，與肺鱗癌不同的是，這種癌癥通常發(fā)生在肺的周圍部分，且早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移［1-2，17］。因此，肺腺癌患者預后比肺鱗癌患者預后差。目前，腫瘤微環(huán)境中的非細胞成分，如可溶性蛋白、分子和細胞外基質(zhì)，已成為癌癥發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子［17］。因此，發(fā)現(xiàn)新型生物標志物以預測肺腺癌患者預后，提高患者預后顯得尤為重要。

YANG等［18］報道趨化因子IL-8（CXCL8）在肝癌組織中高表達，其表達上調(diào)與肝癌患者臨床分期和腫瘤浸潤密切相關。CXCL8能刺激肝癌HepG2細胞增殖和遷移能力，并增強細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（phosphorylated extracellular regulated protein kinases，p-ERK）和生存素（survivin）蛋白表達，降低細胞凋亡相關半胱氨酸肽酶caspase-3（CASP3）和B細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，BCL-2）相關X蛋白（BCL2-associated X，Bax）蛋白表達。WANG等［19］報道CXC趨 化因子 配體5（CXC chemokine ligand 5，CXCL5）在肺癌細胞中表達明顯升高。CXCL5表達上調(diào)與NSCLC患者預后不良相關，也是NSCLC患者預后不良的獨立危險因素。干擾CXCL5表達能顯著降低H460細胞增殖和遷移。此外，CXCL5能通過激活MAPK/ERK1/2和PI3K/Akt信號通路促進H460細胞增殖和遷移。LIANG等［20］報道肺癌組織中CXCL16表達水平升高。CXCL16表達升高與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預后相關。沉默CXCL16表達可抑制A549和PC-9細胞增殖和侵襲，還可抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）亞基c-Rel、p105和Rel-B蛋白表達。說明趨化因子在癌癥進展中具有極其重要的作用。

研究發(fā)現(xiàn)CCL14表達水平與上皮卵巢癌患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預后不良相關。CCL14是上皮卵巢癌患者預后不良的獨立危險因素之一［21］。CCL14在乳腺癌組織中的表達水平顯著降低［22］。CCL14在肝癌患者組織中表達降低，其表達下降與肝癌患者OS、疾病特異性生存期（disease-specific survival，DSS）、PFS相關。過表達CCL14能通過影響Wnt/catenin信號通路進而體外抑制肝癌細胞增殖，促進細胞凋亡，體內(nèi)抑制裸鼠腫瘤生長［23-24］。而CCL14在肺腺癌預后和免疫中的作用價值未見相關報道。本研究發(fā)現(xiàn)CCL14在肺腺癌組織中的表達降低。CCL14表達水平與肺腺癌患者臨床分期、性別、吸煙史、組織學亞型和TP53突變相關。Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)CCL14表達水平降低的肺腺癌患者預后較差。

此外，趨化因子在癌癥免疫浸潤中具有重要作用［25-28］。UNVER等［27］報道趨化因子在腫瘤發(fā)展過程中調(diào)節(jié)免疫反應中發(fā)揮不同作用。CXCL7蛋白水平在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)生變化，可作為早期肺癌的一種新型生物標志物。在Lewis肺癌（Lewis lung cancer，LLC）細胞中，上調(diào)LLC細胞中CXCL7表達能增加CD206（+）M2巨噬細胞浸潤，促進腫瘤進展。GAO等［28］報道多烯紫杉醇（Docetaxel，DOC）在腫瘤微環(huán)境中能增強CXCL11表達，進而加強CD8 T細胞招募。DOC能顯著促進高遷移族轉(zhuǎn)移蛋白B1（high mobility group box protein B1，HMGB1）釋放。重組蛋白HMGB1能通過激活NF-κB信號通路以刺激分泌CXCL11。HMGB1和CXCL11表達增加與肺癌患者OS呈正相關。GU等［23］發(fā)現(xiàn)CCL14表達水平與肝癌浸潤B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞和DSc水平具有強相關性。CCL14表達水平與PD-1、TIM-3和CTLA-4表達水平呈負相關。本研究發(fā)現(xiàn)CCL14表達水平與肺腺癌免疫浸潤密切相關。CCL14表達水平與肺腺癌純度、免疫B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、DSc和嗜中性粒細胞相關。在Timer和GEPIA數(shù)據(jù)庫中證實CCL14表達水平與免疫細胞標志物CD3E、CD2、CD19、CD79A、CD86、CSF1R、CCL2、CD68、IL-10、CD163、VSIG4、MS4A4A、IFNG、STAT6、STAT5A等表達水平相關。表明CCL14在肺腺癌免疫浸潤中具有重要的生物學作用。

本研究缺乏臨床肺腺癌組織標本中CCL14的表達情況，這是目前研究的不足之處。本研究結(jié)果初步表明CCL14在肺腺癌組織中的表達下降，上調(diào)CCL14表達水平有望改善肺腺癌患者的預后。CCL14表達水平與肺腺癌免疫浸潤細胞和免疫標志物分子水平顯著相關，提示其在肺腺癌進展過程中具有重要的生物學作用，且為肺腺癌患者的治療提供了新的思路。