復(fù)方甘草酸苷調(diào)控miR-155對尋常型銀屑病表皮細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

曾 芬 饒美榮 張佳音 鐘 咪（江南大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，無錫 214000）

銀屑?。ㄒ卜Q為牛皮癬）是最常見的免疫介導(dǎo)的慢性皮膚疾病之一，其特征為過度增生的角質(zhì)形成細(xì)胞和免疫細(xì)胞浸潤導(dǎo)致皮膚調(diào)節(jié)異常［1］。銀屑病臨床表現(xiàn)主要為銀白色鱗片覆蓋的清晰紅斑，大部分出現(xiàn)于肢體伸肌表面、頭皮、腰部和肚臍處［2］。尋常型銀屑病是最常見的疾病類型。目前尚無針對銀屑病的治療方法，且社會、醫(yī)學(xué)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)逐步增加。因此，有必要分析與尋常型銀屑病發(fā)展相關(guān)的危險(xiǎn)因素，并確定其發(fā)展過程，以針對性地進(jìn)行預(yù)防和控制。復(fù)方甘草酸苷具有治療銀屑病的功效，可通過調(diào)控銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞炎癥反應(yīng)抑制細(xì)胞增殖［3-5］。但其具體作用機(jī)制研究鮮有報(bào)道。因此，本研究采用不同濃度復(fù)方甘草酸苷處理尋常型銀屑病表皮細(xì)胞，評估其對細(xì)胞周期的作用，并探討其潛在分子機(jī)制，為銀屑病治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料Defined K-SFM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；D-Hanks液購自北京Solarbio公司；復(fù)方甘草酸苷購自日本米諾發(fā)源制藥公司；LipofectamineTM2000試劑購自美國Invitrogen公司；antimiR-155、anti-miR-NC購自上海吉瑪公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒、二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司；兔抗細(xì)胞周期蛋白A（CyclinA）、兔抗CyclinB1、兔抗CyclinD1、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購自英國Abcam公司；PrimeScript RT Master Mix試劑盒和SYBR Green Master試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分離與培養(yǎng) 取經(jīng)江南大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科經(jīng)病理學(xué)確診為銀屑病的患者皮損組織18例，參照李欣等［6］方法進(jìn)行銀屑病表皮細(xì)胞分離和培養(yǎng)。本研究經(jīng)所有患者知情同意，并經(jīng)江南大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。取銀屑病皮損組織塊（1.5 cm×1.0 cm），無菌環(huán)境下加入DispaseⅡ酶分離真皮和表皮組織，收集真皮組織，加入0.25%胰蛋白酶消化9 min，過濾，離心，棄上清，獲得細(xì)胞懸液。加入Defined K-SFM培養(yǎng)基37℃、5%CO2孵育。2～3次/周、更換培養(yǎng)基。細(xì)胞80%融合時(shí)依次采用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶消化3～5 min，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將銀屑病表皮細(xì)胞接種于6孔板（1×105個(gè)/孔），培養(yǎng)24 h，細(xì)胞70%融合時(shí)，按照LipofectamineTM2000試劑說明書，將anti-miR-155及其陰性對照anti-miR-NC轉(zhuǎn)染至銀屑病表皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4～6 h時(shí)更換為新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。復(fù)方甘草酸苷影響銀屑病表皮細(xì)胞周期的實(shí)驗(yàn)共分為4組：對照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組和實(shí)驗(yàn)3組，對照組細(xì)胞未進(jìn)行任何處理，實(shí)驗(yàn)1、2、3組細(xì)胞分別給予0.05、0.1、0.2 ng/ml復(fù)方甘草酸苷處理48 h。干擾miR-155影響銀屑病表皮細(xì)胞周期的實(shí)驗(yàn)分為2組：anti-miR-155組和anti-miR-NC組，細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染anti-miR-155及anti-miR-NC 48 h。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 按照細(xì)胞周期檢測試劑盒說明，收集不同方法處理的銀屑病表皮細(xì)胞1×106個(gè)，4℃下加入500μl 70%冷乙醇固定過夜，PBS洗去固定液，加入500μl碘化丙啶（propidium iodide，PI）/RNase A染色工作液（RNase A∶PI按1∶9配制為染色工作液），室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀記錄488 nm處紅色熒光。

1.2.4 Western blot檢測CyclinA、CyclinB1、CyclinD1蛋白表達(dá) 采用RIPA裂解液提取各組銀屑病表皮細(xì)胞蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒進(jìn)行蛋白定量。吸取20μg蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入CyclinA、CyclinB1、CyclinD1、GAPDH抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜。TBST充分洗膜，37℃下將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5 000）孵育2 h，TBST充分洗膜，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯色顯影，以GAPDH為對照，分析CyclinA、CyclinB1、CyclinD1蛋白條帶灰度值。

1.2.5 qRT-PCR檢測miR-155表達(dá) 采用TRIzol試劑提取各組銀屑病表皮細(xì)胞，采用PrimeScript RT Master Mix試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以U6為內(nèi)參，采用SYBR Green Master試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列為miR-155 F：5'-ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATCGTGATA-3'，R：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6 F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。反應(yīng)結(jié)束后，收集Ct值，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-155水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以±s表示。兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)，多組間差異比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方甘草酸苷對銀屑病表皮細(xì)胞周期的影響 與對照組相比，實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組銀屑病表皮細(xì)胞G0期細(xì)胞占比明顯提高，S期細(xì)胞占比顯著降低，且呈濃度依賴性（P＜0.05），而G2期細(xì)胞占比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 復(fù)方甘草酸苷對銀屑病表皮細(xì)胞周期的影響（±s）Tab.1 Effect of compound glycyrrhizin on cell cycle of psoriasis epidermis（±s）

表1 復(fù)方甘草酸苷對銀屑病表皮細(xì)胞周期的影響（±s）Tab.1 Effect of compound glycyrrhizin on cell cycle of psoriasis epidermis（±s）

Note：1）P＜0.05 vs Control group.

Groups Control Experiment 1 Experiment 2 Experiment 3 F P G0 32.49±3.41 36.83±3.591）39.91±3.631）44.63±4.071）17.355 0.000 S 34.58±3.63 30.62±3.381）27.88±3.031）23.59±2.711）18.724 0.000 G2 32.93±3.54 32.55±3.73 32.21±3.04 31.78±3.01 0.193 0.900

2.2 復(fù)方甘草酸苷對銀屑病表皮細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組銀屑病表皮細(xì)胞CyclinA、CyclinB1和CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低，均呈濃度依賴性（P＜0.05，圖1、表2）。

表2 復(fù)方甘草酸苷對銀屑病表皮細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響（±s）Tab.2 Effect of compound glycyrrhizin on expressions of cyclin proteins of psoriasis epidermis（±s）

表2 復(fù)方甘草酸苷對銀屑病表皮細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響（±s）Tab.2 Effect of compound glycyrrhizin on expressions of cyclin proteins of psoriasis epidermis（±s）

Note：1）P＜0.05 vs Control group.

Groups Control Experiment 1 Experiment 2 Experiment 3 F P CyclinA 0.67±0.06 0.52±0.051）0.37±0.041）0.25±0.031）139.081 0.000 CyclinB1 0.83±0.07 0.68±0.061）0.47±0.051）0.26±0.031）186.958 0.000 CyclinD1 0.72±0.06 0.56±0.051）0.35±0.041）0.23±0.021）211.111 0.000

圖1 細(xì)胞周期蛋白表達(dá)Fig.1 Expressions of cyclin proteins

2.3 復(fù)方甘草酸苷對銀屑病表皮細(xì)胞miR-155表達(dá)的影響 與對照組相比，實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組銀屑病表皮細(xì)胞miR-155表達(dá)顯著降低，且呈濃度依賴性（P＜0.05，表3）。

表3 復(fù)方甘草酸苷對銀屑病表皮細(xì)胞miR-155表達(dá)的影響（±s）Tab.3 Effect of compound glycyrrhizin on miR-155 expression of psoriatic epidermal cells（±s）

表3 復(fù)方甘草酸苷對銀屑病表皮細(xì)胞miR-155表達(dá)的影響（±s）Tab.3 Effect of compound glycyrrhizin on miR-155 expression of psoriatic epidermal cells（±s）

Note：1）P＜0.05 vs Control group.

Groups Control Experiment 1 Experiment 2 Experiment 3 FP miR-155 1.00±0.06 0.78±0.051）0.53±0.041）0.28±0.031）405.593 0.000

2.4 干擾miR-155對銀屑病表皮細(xì)胞周期的影響與anti-miR-NC組（1.01±0.06）相比，anti-miR-155組銀屑病表皮細(xì)胞miR-155表達(dá)（0.20±0.02）明顯減少（P＜0.05）。與anti-miR-NC組相比，anti-miR-155組銀屑病表皮細(xì)胞G0期細(xì)胞占比明顯升高，S期細(xì)胞占比顯著降低（P＜0.05），但G2期細(xì)胞占比無明顯變化（P＞0.05，表4）。

表4 干擾miR-155對銀屑病表皮細(xì)胞周期的影響（±s）Tab.4 Effects of miR-155 interference on cell cycle of psoriasis epidermis（±s）

表4 干擾miR-155對銀屑病表皮細(xì)胞周期的影響（±s）Tab.4 Effects of miR-155 interference on cell cycle of psoriasis epidermis（±s）

Note：1）P＜0.05 vs anti-miR-NC group.

Groups anti-miR-NC anti-miR-155 t P G0 32.48±3.42 42.04±3.891）5.537 0.000 S 34.57±3.61 25.53±2.481）6.192 0.000 G2 32.95±3.56 32.43±3.30 0.321 0.752

2.5 干擾miR-155對銀屑病表皮細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-155組銀屑病表皮細(xì)胞CyclinA、CyclinB1和CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05，圖2、表5）。

表5 干擾miR-155對銀屑病表皮細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響（±s）Tab.5 Effect of miR-155 interference on cyclin proteins expressions of psoriasis epidermis（±s）

表5 干擾miR-155對銀屑病表皮細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響（±s）Tab.5 Effect of miR-155 interference on cyclin proteins expressions of psoriasis epidermis（±s）

Note：1）P＜0.05 vs anti-miR-NC group.

GroupsCyclinACyclinB1CyclinD1 anti-miR-NC0.66±0.060.82±0.070.73±0.06 anti-miR-1550.30±0.031）0.38±0.031）0.29±0.031）t 16.10017.33219.677 P 0.0000.0000.000

圖2 細(xì)胞周期蛋白表達(dá)Fig.2 Expressions of cyclin proteins

2.6 miR-155可逆轉(zhuǎn)復(fù)方甘草酸苷對銀屑病表皮細(xì)胞周期的影響 與實(shí)驗(yàn)3+miR-NC組相比，實(shí)驗(yàn)3+miR-155組銀屑病表皮細(xì)胞G0期細(xì)胞占比明顯降低，S期細(xì)胞占比顯著升高（P＜0.05），但G2期細(xì)胞占比無明顯變化（P＞0.05），且CyclinA、CyclinB1和CyclinD1蛋白水平顯著升高（P＜0.05，表6、圖3）。

圖3 miR-155可逆轉(zhuǎn)復(fù)方甘草酸苷對銀屑病表皮細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響Fig.3 miR-155 can reverse effect of compound glycyrrhizin on cyclin expression of psoriatic epidermal cells

表6 miR-155可逆轉(zhuǎn)復(fù)方甘草酸苷對銀屑病表皮細(xì)胞周期的影響（±s）Tab.6 miR-155 can reverse effect of compound glycyrrhizin on psoriasis epidermis cell cycle（±s）

表6 miR-155可逆轉(zhuǎn)復(fù)方甘草酸苷對銀屑病表皮細(xì)胞周期的影響（±s）Tab.6 miR-155 can reverse effect of compound glycyrrhizin on psoriasis epidermis cell cycle（±s）

Note：1）P＜0.05 vs Experiment 3+miR-NC group.

Groups Experiment 3+miR-NC Experiment 3+miR-155 t P G0 44.61±4.05 35.67±3.661）4.913 0.000 S 23.58±2.75 32.71±3.271）6.411 0.000 G2 31.81±3.08 31.62±3.14 0.130 0.899 CyclinA 0.25±0.03 0.56±0.051）15.949 0.000 CyclinB1 0.26±0.03 0.68±0.061）18.783 0.000 CyclinD1 0.23±0.02 0.61±0.061）18.025 0.000

3 討論

作為一種慢性炎癥性皮膚病，銀屑病治療和預(yù)防是目前皮膚病學(xué)的主要研究內(nèi)容之一［7］。全世界約有1.2億人患有銀屑病，其中80%～90%為尋常型銀屑?。?］。銀屑病是由多種因素引起的復(fù)雜疾病，遺傳因素是其影響因素，其他誘導(dǎo)因素，如外部環(huán)境因素，在其發(fā)病機(jī)制中也起重要作用，涉及細(xì)胞包括角質(zhì)形成細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞［9-10］。但其具體病因及發(fā)病機(jī)制尚未闡明。目前采用藥物抑制表皮細(xì)胞增殖和分化是治療尋常型銀屑病的重要手段。

甘草酸苷是傳統(tǒng)中藥甘草的主要活性成分之一，而復(fù)方甘草酸苷則是以甘草酸苷為主要成分，輔以鹽酸半胱氨酸和甘氨酸等制成的復(fù)方制劑，具有抗炎、抗病毒、抗過敏等藥理活性［11-13］。甘草酸苷可作為副激素促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化，誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生，活化天然殺傷細(xì)胞，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞分化，減輕黑素細(xì)胞損傷，恢復(fù)黑素細(xì)胞功能并恢復(fù)正常膚色［14］。此外，復(fù)方甘草酸苷還可降低外周血IL-17水平，因此也可用于治療免疫相關(guān)疾病［15］。本研究中，不同濃度復(fù)方甘草酸苷能夠以濃度依賴方式提高銀屑病表皮細(xì)胞G0期細(xì)胞占比，降低S期細(xì)胞占比，并抑制CyclinA、CyclinB1、CyclinD1蛋白表達(dá)，引起銀屑病表皮細(xì)胞周期阻滯。說明復(fù)方甘草酸苷可通過阻滯表皮細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)揮一定的銀屑病治療作用，與既往研究結(jié)論相符［3-5］。

在真核生物中廣泛發(fā)現(xiàn)的微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一組約19～24個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過特異性抑制啟動子區(qū)域翻譯與相應(yīng)靶基因?qū)е禄虺聊?，并在基因調(diào)控中起關(guān)鍵作用［16］。越來越多miRNAs被證實(shí)與銀屑病病理機(jī)制相關(guān)，如miR-125a、miR-210、miR-744-3p等［17-19］。miR-155作為一種miRNAs，具有多種功能，包括在炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用［20-22］。miR-155可作為致癌miRNA促進(jìn)多種腫瘤進(jìn)展［23-24］。既往研究證實(shí)，miR-155在尋常型銀屑病中高表達(dá)，參與銀屑病發(fā)病機(jī)制與進(jìn)展［25-26］。甲氨蝶呤和窄帶紫外線B光療均可顯著下調(diào)銀屑病病變皮膚中miR-155表達(dá)，提示調(diào)控miR-155是部分藥物發(fā)揮銀屑病治療作用的重要途徑之一［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，0.05、0.1、0.2 ng/ml復(fù)方甘草酸苷以濃度依賴方式抑制銀屑病表皮細(xì)胞中miR-155表達(dá)，說明miR-155可能與復(fù)方甘草酸苷影響銀屑病表皮細(xì)胞周期的過程密切相關(guān)。為進(jìn)一步探究miR-155在銀屑病表皮細(xì)胞周期中的作用，本研究將anti-miR-155轉(zhuǎn)染至銀屑病表皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)顯著低于轉(zhuǎn)染anti-miR-NC的細(xì)胞，說明成功干擾miR-155在銀屑病表皮細(xì)胞中的表達(dá)。功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾miR-155提高銀屑病表皮細(xì)胞G0期細(xì)胞占比，并降低S期細(xì)胞占比、CyclinA、CyclinB1和CyclinD1蛋白表達(dá)。此外，miR-155可逆轉(zhuǎn)復(fù)方甘草酸苷對銀屑病表皮細(xì)胞周期的影響，表明干擾miR-155可通過調(diào)控CyclinA、CyclinB1和CyclinD1表達(dá)誘導(dǎo)銀屑病表皮細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯于G0期，提示miR-155參與復(fù)方甘草酸苷治療銀屑病的分子機(jī)制。

綜上所述，復(fù)方甘草酸苷可阻滯銀屑病表皮細(xì)胞周期，在0.05、0.1、0.2 ng/ml濃度下呈現(xiàn)濃度依賴性，其作用機(jī)制與下調(diào)miR-155表達(dá)有關(guān)，為復(fù)方甘草酸苷用于銀屑病治療提供了新的方向。