鼠尾靜脈注射裝載腦抗原的納米粒子治療手術(shù)腦損傷的實驗研究

田 震 朱 能 李子林 張新華 陳永忠（湖北省腫瘤醫(yī)院微創(chuàng)介入中心，武漢 430079）

中樞神經(jīng)系統(tǒng)被認(rèn)為是免疫特惠器官，神經(jīng)外科手術(shù)在治療疾病的同時引起血腦屏障破壞導(dǎo)致非疾病本身的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，稱為“手術(shù)腦損傷（surgical brain injury，SBI）”［1］。研究表明，SBI破壞血腦屏障，導(dǎo)致許多大分子物質(zhì)釋放至細(xì)胞外，通過受損的血腦屏障進入血液循環(huán)，引起機體免疫系統(tǒng)針對腦抗原產(chǎn)生大量抗體，導(dǎo)致腦水腫、神經(jīng)元損害及神經(jīng)細(xì)胞凋亡，引起不可逆的神經(jīng)功能損傷［2］。目前治療SBI后繼發(fā)性炎癥反應(yīng)的方法包括脫水降顱壓、類固醇激素抗炎、營養(yǎng)神經(jīng)、亞低溫療法以及免疫抑制劑等，這些療法會抑制免疫系統(tǒng)功能，易誘發(fā)感染及腫瘤的發(fā)生［3］。因此，尋求一種高效、安全、精準(zhǔn)的保護神經(jīng)方法成為現(xiàn)代神經(jīng)外科的研究熱點。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中第一道也是最主要的免疫防線。SBI后致繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，固有的小膠質(zhì)細(xì)胞快速分裂并清除損傷區(qū)域瀕死的細(xì)胞碎片、重塑損傷區(qū)腦組織及預(yù)防神經(jīng)元的損傷。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出高度的形態(tài)可塑性，可從靜息態(tài)轉(zhuǎn)變成激活狀態(tài)的阿米巴狀，這一過程又被稱為“功能可塑性”過程［4］。SBI后小膠質(zhì)細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物離子鈣結(jié)合銜接分子-1（ionized calcium binding adaptor molecule-1，Iba-1）蛋白表達量增加，檢測Iba-1蛋白的表達量可反映小膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度。

髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的含量僅次于髓鞘蛋白脂蛋白，約占髓鞘蛋白總量的30%，中樞性MBP由少突膠質(zhì)細(xì)胞合成和分泌，蛋白質(zhì)含量最高，MBP含有多種抗原物［5］。因此，本實驗通過鼠尾靜脈注射裝載MBP的納米粒子誘導(dǎo)免疫耐受，減輕SBI引起的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 無特定病原體級雄性SD大鼠30只，體重250～270 g（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心），適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、對照組及實驗組，每組10只。

1.1.2 主要試劑與儀器 試劑：普魯蘭多糖（分子量200 kD）、聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA，分子量20 kD）、聚-（β氨基酯）（PBAE，分子量以聚苯乙烯為標(biāo)準(zhǔn)28 kD，濟南岱罡生物工程有限公司）；MBP（瑞士Enzo Life Sciences公司）；IL-2、IL-4 ELISA試劑盒（武漢博士德生物公司）；異硫氰酸熒光素（FITC）抗-CD3、別藻藍(lán)蛋白（APC）抗-CD4、藻紅蛋白（PE）-CD8a抗體及同型對照抗體（美國BD公司）；Iba-1抗體（英國Abcam公司）。儀器：粒徑及電位分析儀（英國Zetasizer Nano ZS公司）；透射電子顯微鏡（日本Hitachi HT7700公司）；酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）；CantoⅡ流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 PVA/PBAE/PLGA/MBP納米粒子的制備參照文獻［6］提供的方案制備納米粒子。首先，采用乳化溶劑揮發(fā)法制備裝載MBP的PLGA/PBAE納米粒子核。如下：將4 mg PBAE和20 mg PLGA分別溶于1 ml二氯甲烷，攪拌混勻后加入100μl MBP（1.0 mg/ml），4℃冰浴條件下攪拌，通過超聲細(xì)胞粉碎儀調(diào)節(jié)超聲功率為200 W對其超聲乳化處理3 min，形成一種水/油（W/O）納米乳化液。然后以含有支鏈普魯蘭多糖的聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）修飾PBAE/PLGA納米核的表面。如下：將100 mg PVA和100 mg普魯蘭多糖溶于10 ml超純水，獲得1%的PVA，將上述PBAE/PLGA初乳滴加至4 ml的PVA溶液中，超聲乳化處理后形成一種水/油/水（W/O/W）納米乳化液，將其添加至5 ml的2%異丙醇溶液中，在室溫通風(fēng)下持續(xù)800 r/min攪拌2 h去除二氯甲烷。納米粒子經(jīng)反復(fù)離心、水洗，即獲得乳化狀裝載MBP的PVA/PBAE/PLGA納米粒子。PVA/PBAE/PLGA/MBP納米粒子以0.5 mg/ml分散于超純水中。采用動態(tài)激光散射法檢測其粒徑，Zeta電位測定儀檢測表面電位，觀察其表面荷電性質(zhì)；采用透射電子顯微鏡觀察納米粒子的形貌。

1.2.2 大鼠SBI模型制備 參照文獻［7］所述方法構(gòu)建大鼠SBI模型：腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛麻醉（0.3 ml/100 g體重）。全麻誘導(dǎo)后，備皮暴露皮膚，大鼠固定于立體定向儀，頭部碘伏常規(guī)消毒3次。無菌條件下矢狀位切開頭皮，棉球壓迫止血，拉鉤牽開頭皮并固定，暴露右側(cè)額骨，于顱骨矢狀縫右側(cè)2 mm，冠狀縫后1 mm交點處，磨鉆開骨窗4 mm；手術(shù)尖刀切開硬腦膜后銳性切除大小約2 mm×3 mm×3 mm腦組織，確切止血后逐層縫合傷口。隨后，對照組和實驗組分別經(jīng)鼠尾靜脈注射200μl裝載NS和裝載MBP的納米粒子。假手術(shù)組以同樣方法開骨窗，但保持硬腦膜完整。

1.2.3 神經(jīng)系統(tǒng)行為學(xué)評分 分別于SBI后1、7、14、21 d，參照文獻［8］制定的神經(jīng)功能缺損評分量表（modified neurological severity score，MNSS）對大鼠進行神經(jīng)功能缺陷評分，評分包括5個方面：提尾反射（0～3分）、行走測試（0～3分）、感覺測試（0～2分）、平衡測試（0～6分）、反射缺失和反常運動（0～4分），大鼠缺失1項反射或不能完成測試即計相應(yīng)分?jǐn)?shù)，分?jǐn)?shù)越高，損傷越重。

1.2.4 大鼠血清IL-2、IL-4濃度檢測和CD4+/CD8+T細(xì)胞比值 分別于SBI后1、7、14、21 d，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛麻醉（0.3 ml/100 g體重），仰臥位固定，經(jīng)心臟穿刺取血1 ml，取其中800μl血室溫置于促凝管中，10 min后3 500 r/min離心15 min，取上層血清于EP管中儲存于-80℃，根據(jù)ELISA試劑盒檢測大鼠血清中IL-2和IL-4濃度；取剩余的200μl血室溫置于EDTA抗凝管中后，分別取100μl滴加于2支流式管底部，每管加入2 ml紅細(xì)胞裂解液，按照流式細(xì)胞抗體試劑盒說明書，利用流式細(xì)胞儀檢測CD4+T、CD8+T細(xì)胞，并計算CD4+/CD8+T細(xì)胞比值。

1.2.5 小膠質(zhì)細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色 在SBI后第21天，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛麻醉（0.3 ml/100 g體重）后仰臥位固定，打開胸腔后經(jīng)心臟灌注PBS溶液100 ml，再灌注4%多聚甲醛200 ml后開顱取腦組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定后進行石蠟包埋，選取SBI邊緣旁1 mm左右處切片。利用二甲苯及乙醇脫蠟，將玻片放入檸檬酸鈉修復(fù)液中加熱水浴修復(fù)，加入Iba-1抗體在4℃條件下孵育12 h，滴加DAB顯色液，蘇木紫復(fù)染，顯微鏡觀察并選取5個不同視野拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計圖由Graphpad prism software（version 5.01）繪制。數(shù)據(jù)用±s表示，呈正態(tài)分布的多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）處理數(shù)據(jù)，組間比較采用SNK法，P＜0.05即為統(tǒng)計學(xué)差異具有顯著性的界值。

2 結(jié)果

2.1 納米粒子的物理特性 制備裝載MBP和NS的納米粒子粒徑分別為266.4 nm和287.5 nm，各納米粒子的多分散指數(shù)均小于0.2，說明粒徑分布較為均勻；Zeta電位分別為14.2 mV和9.7 mV，見表1；電鏡下納米粒子呈規(guī)則的球形和典型的“核-殼”結(jié)構(gòu)，見圖1。

圖1 裝載不同抗原的納米粒子的電鏡形態(tài)、粒徑及電荷特征Fig.1 Transmission electron microscopic morphology，particle size and Zeta potential of nanoparticles loaded with different antigens

表1 裝載不同抗原的PVA/PBAE/PLGA納米粒子的特性Tab.1 Characteristics of PVA/PBAE/PLGA nanoparticles loaded with different antigens

2.2 改良神經(jīng)系統(tǒng)行為學(xué)評分 大鼠SBI后各組神經(jīng)功能均有不同程度的缺陷，與假手術(shù)組相比，對照組和實驗組術(shù)后出現(xiàn)明顯神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失。術(shù)后7、14、21 d，實驗組MNSS得分低于對照組，術(shù)后1、7、14、21 d，對照組和實驗組高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。見表2。

表2 SBI后大鼠MNSS比較（±s，分）Tab.2 MNSS comparison of rats after SBI（±s，Score）

表2 SBI后大鼠MNSS比較（±s，分）Tab.2 MNSS comparison of rats after SBI（±s，Score）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with control group，2）P＜0.05.

Groups Sham operation Control Experimental F P Time after SBI（d）1 5.12±0.96 6.75±1.041）6.52±0.831）36.91＜0.05 7 3.97±0.45 6.01±1.581）2）5.03±0.651）2）15.86＜0.01 14 3.08±0.53 5.64±0.931）2）4.26±0.511）2）26.39＜0.01 21 1.63±0.64 3.89±0.541）2）2.53±0.481）2）12.52＜0.01

2.3 大鼠血清IL-2和IL-4濃度SBI術(shù)后7、14 d，實驗組和假手術(shù)組IL-2濃度低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。見表3。術(shù)后7、14 d，假手術(shù)組和對照組IL-4濃度低于實驗組，假手術(shù)組IL-4濃度低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。見表4。

表3 SBI后大鼠血清中IL-2濃度比較（±s，pg/ml）Tab.3 Comparison of IL-2 concentration in serum of rats after SBI（±s，pg/ml）

表3 SBI后大鼠血清中IL-2濃度比較（±s，pg/ml）Tab.3 Comparison of IL-2 concentration in serum of rats after SBI（±s，pg/ml）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with control group，2）P＜0.05.

Groups Sham operation Control Experimental F P Time after SBI（d）1 44.7±55.51 43.1±34.12 41.4±24.21 1.91＞0.05 7 29.26±3.31 40.77±5.461）31.68±3.262）15.36＜0.01 14 27.39±5.24 31.81±4.921）28.18±4.842）16.19＜0.01 21 26.66±3.72 27.48±4.54 26.42±3.75 1.52＞0.05

表4 SBI后大鼠血清中IL-4濃度比較（±s，pg/ml）Tab.4 Comparison of IL-4 concentration in serum of rats after SBI（±s，pg/ml）

表4 SBI后大鼠血清中IL-4濃度比較（±s，pg/ml）Tab.4 Comparison of IL-4 concentration in serum of rats after SBI（±s，pg/ml）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with control group，2）P＜0.05.

Groups Sham operation Control Experimental F P Time after SBI（d）1 15.11±1.78 15.46±2.06 15.91±2.15 2.41＞0.05 7 14.24±2.19 15.09±1.351）18.64±2.341）2）9.78＜0.01 14 16.38±1.35 16.89±2.531）19.27±2.131）2）24.42＜0.01 21 16.12±2.64 16.31±2.14 17.18±1.62 1.21＞0.05

2.4 外周血CD4+/CD8+T細(xì)胞比值 術(shù)后7、14、21 d，假手術(shù)組CD4+/CD8+T細(xì)胞比值低于對照組，術(shù)后7、14 d，實驗組低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。見表5。

表5 SBI后大鼠外周血CD4+/CD8+T細(xì)胞比值比較（±s）Tab.5 Comparison of CD4+/CD8+T cell in peripheral blood of rats after SBI（±s）

表5 SBI后大鼠外周血CD4+/CD8+T細(xì)胞比值比較（±s）Tab.5 Comparison of CD4+/CD8+T cell in peripheral blood of rats after SBI（±s）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with control group，2）P＜0.05.

Groups Sham operation Control Experimental F P Time after SBI（d）1 1.67±0.16 1.73±0.24 1.70±0.23 3.41＞0.05 7 1.71±0.25 2.11±0.381）1.81±0.351）2）5.38＜0.01 14 1.66±0.23 2.46±0.331）1.61±0.112）6.82＜0.01 21 1.73±0.21 1.81±0.241）1.74±0.18 2.52＜0.05

2.5 神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色 術(shù)后第21天腦組織切片神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞Iba-1的表達，實驗組明顯低于對照組，實驗組及對照組均高于假手術(shù)組。見圖2。

圖2 神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞Iba-1表達Fig.2 Expression of Iba-1 in microglia

3 討論

顱腦創(chuàng)傷及神經(jīng)外科手術(shù)都會破壞血腦屏障導(dǎo)致大量混合腦抗原暴露于免疫系統(tǒng)，進而使血清中抗腦抗原抗體含量明顯升高，通過抗原抗體反應(yīng)激發(fā)自身免疫引起腦組織的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)進一步加重腦腫脹、腦水腫、神經(jīng)元損害、神經(jīng)細(xì)胞凋亡，引起不可逆的神經(jīng)功能損傷［9］。既往研究表明，建立免疫耐受能夠有效抑制繼發(fā)性的炎癥反應(yīng)進而達到治療SBI的目的［10］。

神經(jīng)系統(tǒng)行為學(xué)功能評分能直接反應(yīng)神經(jīng)功能狀況，SBI后大鼠將出現(xiàn)各種神經(jīng)功能障礙，因此采用神經(jīng)系統(tǒng)行為學(xué)評分作為客觀評價治療預(yù)后的指標(biāo)。T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫的重要組成部分，尤其是CD4+T和CD8+T細(xì)胞。YILMAZ等［11］研究發(fā)現(xiàn)在大腦缺血-再灌注損傷的腦組織中，CD4+T細(xì)胞增多，CD8+T細(xì)胞減少，外周血CD4+T/CD8+T增高。輔助性CD4+T細(xì)胞可分化為Th1和Th2。細(xì)胞因子是淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)運的重要調(diào)節(jié)因子，IL-2是細(xì)胞免疫重要的促炎因子，IL-2主要由活化的Th1產(chǎn)生，且IL-2可加強T淋巴細(xì)胞活化，因此，IL-2的表達反映了Th1的活化水平［12］。IL-4具有免疫調(diào)節(jié)作用，主要由Th2產(chǎn)生，是Th2特征性的細(xì)胞因子，又誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分化。此外，WALSH等［13］研究發(fā)現(xiàn)，IL-4對損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護和促進恢復(fù)的功能。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的單核/巨噬細(xì)胞，占神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的5%～20%。小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)分為分枝狀和阿米巴狀，正常情況下小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，表現(xiàn)為胞體較小、突起較長的分枝狀。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害后，繼發(fā)性炎癥反應(yīng)發(fā)生，刺激小膠質(zhì)細(xì)胞被迅速激活，形態(tài)上表現(xiàn)為胞體變大、突起回縮的阿米巴狀，發(fā)揮吞噬作用。Iba-1是小膠質(zhì)細(xì)胞特異性的鈣結(jié)合蛋白，參與激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的皺褶形成和吞噬作用?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞一方面發(fā)揮吞噬作用，分泌生長因子促進神經(jīng)修復(fù)；另一方面也能分泌一些炎癥因子，加重繼發(fā)性炎癥反應(yīng)。MIYAMOTO等［14］研究發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物Iba-1蛋白表達增加，檢測這種蛋白的表達量可反映小膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度。本實驗探究小膠質(zhì)細(xì)胞在SBI后的反應(yīng)、激活的形態(tài)特點，精確調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)，以減少細(xì)胞毒性物質(zhì)的釋放，治療神經(jīng)損傷。

有研究表明，可通過肝門靜脈注射單一或混合腦抗原誘導(dǎo)建立特異性免疫耐受降低繼發(fā)性炎癥反應(yīng)治療SBI，然而在臨床上肝門靜脈注射需要開腹或腹腔鏡來協(xié)助進行，不僅操作難度大，而且增加手術(shù)并發(fā)癥［15］。因此，本試驗設(shè)計了一種免疫原性低的納米粒子作為MBP的載體，通過鼠尾靜脈途徑注射裝載MBP的納米粒子，并對SBI后小鼠的行為學(xué)評分、血液免疫指標(biāo)、小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況進行綜合評估，證實了無創(chuàng)的外周靜脈輸液途徑可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫耐受，降低SBI后繼發(fā)性炎癥反應(yīng)。為將來臨床神經(jīng)外科治療SBI引起的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)提供新的方向。