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    柑橘CLas 和CYVCV 雙重PCR 檢測體系的建立及應(yīng)用

    2022-01-04 02:52:06王培育
    武夷科學(xué) 2021年2期
    關(guān)鍵詞:泳道黃化黃龍

    王培育, 楊 學(xué)

    (三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 福建沙縣365051)

    柑橘(Citrus reticulataBlanco)又名寬皮橘、黃橘,是蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus)的常綠小喬木。 柑橘廣泛種植于北緯35°以南的區(qū)域,目前中國是柑橘最大的生產(chǎn)國,廣西是中國最大的柑橘產(chǎn)區(qū)(劉印璇,2019)。 柑橘營養(yǎng)豐富,色香味兼優(yōu),既可鮮食又可加工成以果汁為主的各種加工制品(沈曉暉,2018)。 柑橘易受多種病害的影響,其中以柑橘黃龍病和黃化脈明病最為常見。

    柑橘黃龍病是一種由韌皮部桿菌(CandidatusLiberibacter)引起的,對柑橘具有毀滅性的病害,可嚴(yán)重影響柑橘產(chǎn)量和品質(zhì),甚至造成柑橘樹枯死,能夠侵染包括柑橘屬、枳屬、金柑屬和九里香在內(nèi)的多種蕓香科植物(Guzet al,2020)。 我國的柑橘黃龍病主要是由柑橘黃龍病菌亞洲種(CandidatusLiberibacter asiaticus,CLas)引起的。 柑橘木虱和帶病苗木或帶病接穗是遠(yuǎn)距離傳病的主因,往往使無病的新區(qū)變成病區(qū),而柑橘長期以來通過扦插或嫁接的方式進(jìn)行種苗繁育,極易造成大面積帶病植株的傳播。 在商業(yè)化種植過程中,通常在柑橘發(fā)現(xiàn)病害時,將整株植株直接銷毀(Dinget al,2020;Zhou,2020;肖翠等,2019)。 柑橘黃化脈明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)屬于印度柑橘病毒屬(Mandarivirus),雖然80%的植物病毒病依賴于媒介昆蟲傳播,但前期研究未發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)該病毒在柑橘間進(jìn)行傳播的昆蟲(劉翠花等,2016;劉惠芳,2018)。 有研究發(fā)現(xiàn),該病一旦發(fā)生,可在短時間內(nèi)迅速傳播,主要傳播方式是嫁接傳播,且傳毒效率較高,苗木帶毒可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離傳播(張艷慧,2018)。 因此,培育不含CLas和CYVCV 的柑橘苗,并及早發(fā)現(xiàn)含有CLas 和CYVCV 的柑橘植株,是防控柑橘黃龍病和黃化脈明病的關(guān)鍵。

    雖然受CLas 和CYVCV 感染的柑橘植株可表現(xiàn)出明顯特征,但并不排除表型良好的植株不含有CLas 和CYVCV,染病植株需經(jīng)過長短不一的潛伏期后才表現(xiàn)癥狀,待其癥狀明顯時,防治難度及經(jīng)濟(jì)損失增大(Zhou,2020;劉翠花等,2015)。 目前,對柑橘黃龍病和黃化脈明病已有大量研究,但其檢測技術(shù)仍較為復(fù)雜,且存在假陰性和假陽性現(xiàn)象(胡浩等,2006)。 本研究通過同時檢測CLas 和CYVCV,可大大提高檢測效率,縮短檢測時間和檢測成本,并且通過對特異性引物的目的片段進(jìn)行檢測,能夠排除檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性和假陽性的產(chǎn)生。 研究結(jié)果可為柑橘田間病毒的快速檢測和后期病害防治及脫毒技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)位于三明市尤溪柑橘園,選取5 年生以上的柑橘植株, 采集感染有柑橘黃龍病菌(CLas)、柑橘黃化脈明病毒(CYVCV)以及健康柑橘苗的葉片,其中以PCR 檢測后呈現(xiàn)陰性的健康柑橘苗葉片為陰性對照。 采集的柑橘葉樣品均經(jīng)液氮處理后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 引物設(shè)計(jì)

    根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中已登錄的CLas 16S 和CYVCV 外殼蛋白(coat protein,CP)以及內(nèi)參CTACT基因的保守核苷酸序列,使用DNAMAN 軟件設(shè)計(jì)CLas 16S 和CYVCV 的特異性引物各2 對,內(nèi)參CTACT基因的特異性引物1 對(表1),以上引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

    表1 引物序列和預(yù)期目的片段大小Table 1 Primer sequence and expected target fragment size

    1.3 總RNA 的提取及cDNA 的合成

    采用王培育等(2018)改良的Trizol UP RNA 方法提取葉片RNA,用酶標(biāo)儀檢測RNA 濃度,利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 質(zhì)量,使用Prime ScriptTMRT-PCR Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TAKARA 生物公司)合成cDNA,反轉(zhuǎn)錄后將各模板樣品稀釋至10 ng·L-1,保存于4 ℃冰箱備用。

    1.4 供試樣品PCR 擴(kuò)增

    PCR 擴(kuò)增體系參照王培育等(2019)的研究方法,取25 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行檢測,以健康柑橘苗葉片作為陰性對照,于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后拍照保存。

    1.5 靈敏度檢測

    采用1.4 中的PCR 體系對柑橘樣品進(jìn)行檢測,樣品的cDNA 原液按10 倍梯度進(jìn)行稀釋,依次稀釋cDNA 原液濃度為100~10-5。 隨后在PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增,檢測其靈敏度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 感病和健康柑橘樣品表型

    采集的柑橘樣品,對其健康和感病葉片拍照記錄。 如圖1 所示,圖1A 為健康的柑橘葉片,葉片平整,脈絡(luò)清晰,葉色翠綠且有光澤度。 圖1B 為感染柑橘黃龍病的葉片,出現(xiàn)斑駁黃化、均勻黃化及缺錳、鋅狀黃化;其果小、畸形,著色異常如紅鼻子果、青頭果等,表面無光澤。而在光照條件下,可以觀察到圖1C 為感染黃化脈明病的柑橘葉片,葉脈發(fā)黃透亮,周邊葉肉有黃斑,后期葉片皺縮;有些柑橘品種感病后還常伴隨著褪綠、花葉等。 該病在新葉上表現(xiàn)出癥狀,且表現(xiàn)的脈明癥狀會隨著葉片的老化逐漸減弱。 圖1D 為同時感染了柑橘黃龍病和黃化脈明病的柑橘葉片,表現(xiàn)出葉片斑駁黃化,葉脈明顯且葉片皺縮現(xiàn)象。

    圖1 健康和感病柑橘葉片表型Figure 1 Phenotype of healthy and susceptible in Citrus leaf

    2.2 應(yīng)用PCR 檢測柑橘CLas 和CYVCV 的感病情況

    PCR 擴(kuò)增約2 h 后,將擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后觀察拍照,結(jié)果如圖2 所示。 1 號泳道以H2O 為模板,無條帶擴(kuò)增;2 號泳道為2 對CLas 和1 對CTACT特異引物組合,以感染黃龍病病葉cDNA 為模板,同時擴(kuò)增得到840、748 bp CLas 特異片段和120 bp 內(nèi)參CTACT基因片段;3 號泳道為2 對CYVCV 和1 對CTACT特異引物組合,以感染黃化脈明病病葉cDNA 為模板,同時擴(kuò)增得到447、325 bp CYVCV 特異片段和120 bp 內(nèi)參CTACT基因片段;4 號泳道為2 對CLas、2 對CYVCV 和1 對CTACT特異引物組合,以同時感染黃龍病和黃化脈明病病葉cDNA 為模板,除擴(kuò)增出120 bp 內(nèi)參CTACT基因片段,還同時擴(kuò)增得到840、748 bp CLas 特異片段和447、325 bp CYVCV 特異片段;5 號泳道以健康葉片cDNA 為模板(陰性對照),使用表1 所述的5 組引物組合,采用1.4 中PCR 反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件,并進(jìn)行雙重檢測,只擴(kuò)增出120 bp 的內(nèi)參條帶,排除了假陽性和假陰性產(chǎn)生的可能。 結(jié)果表明,待測葉片感染了 CLas 和 CYVCV。

    圖2 PCR 檢測柑橘CLas 和CYVCVFigure 2 PCR detection of citrus CLas and CYVCV

    2.3 靈敏度檢測

    分別以100~105稀釋倍數(shù)的cDNA 液為模板進(jìn)行目標(biāo)片段PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測。 檢測結(jié)果如圖3 所示,以CLas 16S F118、CLas 16S R866、CLas 16S R958 組合分別可以擴(kuò)增出 748 和 840bp 特異性條帶;CYVCV CP F41、CYVCV CP F163、CYVCV CP R488 組合分別可以擴(kuò)增出447 和325 bp 特異性條帶;CTACTF460、CTACTR580組合可擴(kuò)增出120 bp 特異性條帶。 結(jié)果表明,待測樣品含有CLas 和CYVCV 且cDNA 合成質(zhì)量可用。 圖 3 中泳道 1~5 分別為待測樣品 cDNA 在原液及稀釋 101、102、103、104倍條件下擴(kuò)增出的CLas、CYVCV 及CTACT目的條帶;泳道6 為待測樣品cDNA 在稀釋105倍條件下還能擴(kuò)增出CYVCV 目的條帶。 結(jié)果表明,該特異性引物組合不僅能夠排除假陽性和假陰性產(chǎn)生,還具有高度靈敏性。

    圖3 PCR 檢測柑橘CLas 和CYVCVFigure 3 PCR detection of citrus CLas and CYVCV

    3 結(jié)論與討論

    柑橘產(chǎn)業(yè)深受病害問題的困擾。 迄今為止,我國的柑橘病害有300 多種,分為侵染性病害和非侵染性病害兩大類。 在病菌類病害中,以黃龍病最嚴(yán)重,曾造成大批柑橘園毀害,使用常用藥劑防治,效果不佳(Bove 等,2011)。 培育脫毒柑橘母本樹和苗木以及進(jìn)行抗病品種選育工作時,對其進(jìn)行病原菌檢測,在病害防治過程中起到至關(guān)重要的作用。 PCR 檢測方法雖然具有較高的特異性和靈敏度,但其檢測技術(shù)復(fù)雜、效率低,具有一定的局限性。 因此,多重PCR技術(shù)在植物病原菌檢測方面得到大力地推廣應(yīng)用(張婧穎,2016)。 劉歡等(2016)利用多重PCR 技術(shù)一次性擴(kuò)增出番茄煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、番茄斑萎病毒(TSWV)和馬鈴薯X 病毒(PVX)的特異性片段;匡云波等(2018)運(yùn)用多重PCR 技術(shù)建立PCR檢測方法,可快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確地檢測太子參蠶豆萎蔫病毒(BBWV2)和蕪菁花葉病毒(TuMV);焦楠等(2019)建立了西番蓮夜來香花葉病毒(TeMV)和黃瓜花葉病毒(CMV)的雙重 PCR 檢測體系。 本方法利用雙重PCR 技術(shù)進(jìn)行CLas 和CYVCV 檢測,大大提高檢測效率,縮短檢測時間和檢測成本;同時,對CLas 和CYVCV 特異性引物的目的片段進(jìn)行檢測,可排除假陽性的產(chǎn)生,對內(nèi)參基因CTACT特異性引物的目的片段進(jìn)行檢測,能夠排除檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性。

    本試驗(yàn)在前人研究基礎(chǔ)上,首次建立起能同時檢測柑橘CLas 和CYVCV 的測體系。 以單一PCR 檢測為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)特異性引物,對樣品柑橘進(jìn)行檢測,靈敏度試驗(yàn)顯示建立的PCR 體系具有較高的靈敏性,能夠檢測到10-5mg 的組織量,這是PCR 技術(shù)在柑橘病原菌檢測上的應(yīng)用,對培育脫毒柑橘母本樹和苗木以及進(jìn)行抗病品種的選育具有重要意義。

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