• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    柑橘CLas 和CYVCV 雙重PCR 檢測體系的建立及應(yīng)用

    2022-01-04 02:52:06王培育
    武夷科學(xué) 2021年2期
    關(guān)鍵詞:泳道黃化黃龍

    王培育, 楊 學(xué)

    (三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 福建沙縣365051)

    柑橘(Citrus reticulataBlanco)又名寬皮橘、黃橘,是蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus)的常綠小喬木。 柑橘廣泛種植于北緯35°以南的區(qū)域,目前中國是柑橘最大的生產(chǎn)國,廣西是中國最大的柑橘產(chǎn)區(qū)(劉印璇,2019)。 柑橘營養(yǎng)豐富,色香味兼優(yōu),既可鮮食又可加工成以果汁為主的各種加工制品(沈曉暉,2018)。 柑橘易受多種病害的影響,其中以柑橘黃龍病和黃化脈明病最為常見。

    柑橘黃龍病是一種由韌皮部桿菌(CandidatusLiberibacter)引起的,對柑橘具有毀滅性的病害,可嚴(yán)重影響柑橘產(chǎn)量和品質(zhì),甚至造成柑橘樹枯死,能夠侵染包括柑橘屬、枳屬、金柑屬和九里香在內(nèi)的多種蕓香科植物(Guzet al,2020)。 我國的柑橘黃龍病主要是由柑橘黃龍病菌亞洲種(CandidatusLiberibacter asiaticus,CLas)引起的。 柑橘木虱和帶病苗木或帶病接穗是遠(yuǎn)距離傳病的主因,往往使無病的新區(qū)變成病區(qū),而柑橘長期以來通過扦插或嫁接的方式進(jìn)行種苗繁育,極易造成大面積帶病植株的傳播。 在商業(yè)化種植過程中,通常在柑橘發(fā)現(xiàn)病害時,將整株植株直接銷毀(Dinget al,2020;Zhou,2020;肖翠等,2019)。 柑橘黃化脈明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)屬于印度柑橘病毒屬(Mandarivirus),雖然80%的植物病毒病依賴于媒介昆蟲傳播,但前期研究未發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)該病毒在柑橘間進(jìn)行傳播的昆蟲(劉翠花等,2016;劉惠芳,2018)。 有研究發(fā)現(xiàn),該病一旦發(fā)生,可在短時間內(nèi)迅速傳播,主要傳播方式是嫁接傳播,且傳毒效率較高,苗木帶毒可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離傳播(張艷慧,2018)。 因此,培育不含CLas和CYVCV 的柑橘苗,并及早發(fā)現(xiàn)含有CLas 和CYVCV 的柑橘植株,是防控柑橘黃龍病和黃化脈明病的關(guān)鍵。

    雖然受CLas 和CYVCV 感染的柑橘植株可表現(xiàn)出明顯特征,但并不排除表型良好的植株不含有CLas 和CYVCV,染病植株需經(jīng)過長短不一的潛伏期后才表現(xiàn)癥狀,待其癥狀明顯時,防治難度及經(jīng)濟(jì)損失增大(Zhou,2020;劉翠花等,2015)。 目前,對柑橘黃龍病和黃化脈明病已有大量研究,但其檢測技術(shù)仍較為復(fù)雜,且存在假陰性和假陽性現(xiàn)象(胡浩等,2006)。 本研究通過同時檢測CLas 和CYVCV,可大大提高檢測效率,縮短檢測時間和檢測成本,并且通過對特異性引物的目的片段進(jìn)行檢測,能夠排除檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性和假陽性的產(chǎn)生。 研究結(jié)果可為柑橘田間病毒的快速檢測和后期病害防治及脫毒技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)位于三明市尤溪柑橘園,選取5 年生以上的柑橘植株, 采集感染有柑橘黃龍病菌(CLas)、柑橘黃化脈明病毒(CYVCV)以及健康柑橘苗的葉片,其中以PCR 檢測后呈現(xiàn)陰性的健康柑橘苗葉片為陰性對照。 采集的柑橘葉樣品均經(jīng)液氮處理后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 引物設(shè)計(jì)

    根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中已登錄的CLas 16S 和CYVCV 外殼蛋白(coat protein,CP)以及內(nèi)參CTACT基因的保守核苷酸序列,使用DNAMAN 軟件設(shè)計(jì)CLas 16S 和CYVCV 的特異性引物各2 對,內(nèi)參CTACT基因的特異性引物1 對(表1),以上引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

    表1 引物序列和預(yù)期目的片段大小Table 1 Primer sequence and expected target fragment size

    1.3 總RNA 的提取及cDNA 的合成

    采用王培育等(2018)改良的Trizol UP RNA 方法提取葉片RNA,用酶標(biāo)儀檢測RNA 濃度,利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 質(zhì)量,使用Prime ScriptTMRT-PCR Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TAKARA 生物公司)合成cDNA,反轉(zhuǎn)錄后將各模板樣品稀釋至10 ng·L-1,保存于4 ℃冰箱備用。

    1.4 供試樣品PCR 擴(kuò)增

    PCR 擴(kuò)增體系參照王培育等(2019)的研究方法,取25 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行檢測,以健康柑橘苗葉片作為陰性對照,于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后拍照保存。

    1.5 靈敏度檢測

    采用1.4 中的PCR 體系對柑橘樣品進(jìn)行檢測,樣品的cDNA 原液按10 倍梯度進(jìn)行稀釋,依次稀釋cDNA 原液濃度為100~10-5。 隨后在PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增,檢測其靈敏度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 感病和健康柑橘樣品表型

    采集的柑橘樣品,對其健康和感病葉片拍照記錄。 如圖1 所示,圖1A 為健康的柑橘葉片,葉片平整,脈絡(luò)清晰,葉色翠綠且有光澤度。 圖1B 為感染柑橘黃龍病的葉片,出現(xiàn)斑駁黃化、均勻黃化及缺錳、鋅狀黃化;其果小、畸形,著色異常如紅鼻子果、青頭果等,表面無光澤。而在光照條件下,可以觀察到圖1C 為感染黃化脈明病的柑橘葉片,葉脈發(fā)黃透亮,周邊葉肉有黃斑,后期葉片皺縮;有些柑橘品種感病后還常伴隨著褪綠、花葉等。 該病在新葉上表現(xiàn)出癥狀,且表現(xiàn)的脈明癥狀會隨著葉片的老化逐漸減弱。 圖1D 為同時感染了柑橘黃龍病和黃化脈明病的柑橘葉片,表現(xiàn)出葉片斑駁黃化,葉脈明顯且葉片皺縮現(xiàn)象。

    圖1 健康和感病柑橘葉片表型Figure 1 Phenotype of healthy and susceptible in Citrus leaf

    2.2 應(yīng)用PCR 檢測柑橘CLas 和CYVCV 的感病情況

    PCR 擴(kuò)增約2 h 后,將擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后觀察拍照,結(jié)果如圖2 所示。 1 號泳道以H2O 為模板,無條帶擴(kuò)增;2 號泳道為2 對CLas 和1 對CTACT特異引物組合,以感染黃龍病病葉cDNA 為模板,同時擴(kuò)增得到840、748 bp CLas 特異片段和120 bp 內(nèi)參CTACT基因片段;3 號泳道為2 對CYVCV 和1 對CTACT特異引物組合,以感染黃化脈明病病葉cDNA 為模板,同時擴(kuò)增得到447、325 bp CYVCV 特異片段和120 bp 內(nèi)參CTACT基因片段;4 號泳道為2 對CLas、2 對CYVCV 和1 對CTACT特異引物組合,以同時感染黃龍病和黃化脈明病病葉cDNA 為模板,除擴(kuò)增出120 bp 內(nèi)參CTACT基因片段,還同時擴(kuò)增得到840、748 bp CLas 特異片段和447、325 bp CYVCV 特異片段;5 號泳道以健康葉片cDNA 為模板(陰性對照),使用表1 所述的5 組引物組合,采用1.4 中PCR 反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件,并進(jìn)行雙重檢測,只擴(kuò)增出120 bp 的內(nèi)參條帶,排除了假陽性和假陰性產(chǎn)生的可能。 結(jié)果表明,待測葉片感染了 CLas 和 CYVCV。

    圖2 PCR 檢測柑橘CLas 和CYVCVFigure 2 PCR detection of citrus CLas and CYVCV

    2.3 靈敏度檢測

    分別以100~105稀釋倍數(shù)的cDNA 液為模板進(jìn)行目標(biāo)片段PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測。 檢測結(jié)果如圖3 所示,以CLas 16S F118、CLas 16S R866、CLas 16S R958 組合分別可以擴(kuò)增出 748 和 840bp 特異性條帶;CYVCV CP F41、CYVCV CP F163、CYVCV CP R488 組合分別可以擴(kuò)增出447 和325 bp 特異性條帶;CTACTF460、CTACTR580組合可擴(kuò)增出120 bp 特異性條帶。 結(jié)果表明,待測樣品含有CLas 和CYVCV 且cDNA 合成質(zhì)量可用。 圖 3 中泳道 1~5 分別為待測樣品 cDNA 在原液及稀釋 101、102、103、104倍條件下擴(kuò)增出的CLas、CYVCV 及CTACT目的條帶;泳道6 為待測樣品cDNA 在稀釋105倍條件下還能擴(kuò)增出CYVCV 目的條帶。 結(jié)果表明,該特異性引物組合不僅能夠排除假陽性和假陰性產(chǎn)生,還具有高度靈敏性。

    圖3 PCR 檢測柑橘CLas 和CYVCVFigure 3 PCR detection of citrus CLas and CYVCV

    3 結(jié)論與討論

    柑橘產(chǎn)業(yè)深受病害問題的困擾。 迄今為止,我國的柑橘病害有300 多種,分為侵染性病害和非侵染性病害兩大類。 在病菌類病害中,以黃龍病最嚴(yán)重,曾造成大批柑橘園毀害,使用常用藥劑防治,效果不佳(Bove 等,2011)。 培育脫毒柑橘母本樹和苗木以及進(jìn)行抗病品種選育工作時,對其進(jìn)行病原菌檢測,在病害防治過程中起到至關(guān)重要的作用。 PCR 檢測方法雖然具有較高的特異性和靈敏度,但其檢測技術(shù)復(fù)雜、效率低,具有一定的局限性。 因此,多重PCR技術(shù)在植物病原菌檢測方面得到大力地推廣應(yīng)用(張婧穎,2016)。 劉歡等(2016)利用多重PCR 技術(shù)一次性擴(kuò)增出番茄煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、番茄斑萎病毒(TSWV)和馬鈴薯X 病毒(PVX)的特異性片段;匡云波等(2018)運(yùn)用多重PCR 技術(shù)建立PCR檢測方法,可快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確地檢測太子參蠶豆萎蔫病毒(BBWV2)和蕪菁花葉病毒(TuMV);焦楠等(2019)建立了西番蓮夜來香花葉病毒(TeMV)和黃瓜花葉病毒(CMV)的雙重 PCR 檢測體系。 本方法利用雙重PCR 技術(shù)進(jìn)行CLas 和CYVCV 檢測,大大提高檢測效率,縮短檢測時間和檢測成本;同時,對CLas 和CYVCV 特異性引物的目的片段進(jìn)行檢測,可排除假陽性的產(chǎn)生,對內(nèi)參基因CTACT特異性引物的目的片段進(jìn)行檢測,能夠排除檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性。

    本試驗(yàn)在前人研究基礎(chǔ)上,首次建立起能同時檢測柑橘CLas 和CYVCV 的測體系。 以單一PCR 檢測為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)特異性引物,對樣品柑橘進(jìn)行檢測,靈敏度試驗(yàn)顯示建立的PCR 體系具有較高的靈敏性,能夠檢測到10-5mg 的組織量,這是PCR 技術(shù)在柑橘病原菌檢測上的應(yīng)用,對培育脫毒柑橘母本樹和苗木以及進(jìn)行抗病品種的選育具有重要意義。

    猜你喜歡
    泳道黃化黃龍
    得分一瞬
    睿士(2023年9期)2023-09-20 05:47:07
    等價轉(zhuǎn)化
    特約撰稿專家 黃龍光 編審
    黃化安全性保障
    家蠶色氨酸羥化酶 (TRH) 基因的克隆及表達(dá)特性分析
    黃龍河川道
    文苑(2018年22期)2018-11-15 03:24:23
    嶺石葉面鐵肥 缺鐵黃化
    黃龍核桃
    陜西畫報(2016年1期)2016-12-01 05:35:30
    游泳池里的航母
    淺析溫室番茄黃化曲葉病毒病的防治
    中國果菜(2016年9期)2016-03-01 01:28:47
    国产精品久久久久久久久免| 黄片播放在线免费| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 亚洲激情五月婷婷啪啪| 一个人看视频在线观看www免费| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲精品成人av观看孕妇| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲伊人久久精品综合| 蜜臀久久99精品久久宅男| 大陆偷拍与自拍| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 99久久精品一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 波野结衣二区三区在线| 精品人妻在线不人妻| 婷婷色av中文字幕| 一级毛片我不卡| 午夜免费鲁丝| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产 一区精品| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲精品一二三| 内地一区二区视频在线| 水蜜桃什么品种好| 精品国产国语对白av| 亚洲情色 制服丝袜| 一区二区av电影网| av在线观看视频网站免费| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲欧美色中文字幕在线| 久热久热在线精品观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| a级毛片免费高清观看在线播放| 一区二区av电影网| 精品久久久噜噜| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 最近手机中文字幕大全| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| av在线观看视频网站免费| 男的添女的下面高潮视频| 久久女婷五月综合色啪小说| 日韩一区二区视频免费看| 在线 av 中文字幕| 夫妻午夜视频| 国产精品无大码| 亚洲第一区二区三区不卡| 免费大片黄手机在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲不卡免费看| 欧美日韩亚洲高清精品| 日韩亚洲欧美综合| 91精品国产国语对白视频| 久久久精品94久久精品| 日韩三级伦理在线观看| 最黄视频免费看| 街头女战士在线观看网站| 男女边摸边吃奶| 亚洲第一区二区三区不卡| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲,欧美,日韩| 人妻 亚洲 视频| 男人添女人高潮全过程视频| 99热这里只有精品一区| 久久久久国产精品人妻一区二区| 久久 成人 亚洲| 国国产精品蜜臀av免费| 视频区图区小说| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲国产欧美在线一区| 色吧在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 91久久精品国产一区二区三区| 少妇人妻久久综合中文| 99久久中文字幕三级久久日本| 日韩三级伦理在线观看| 精品一区在线观看国产| 一边亲一边摸免费视频| 久久久精品94久久精品| 久久久久久久精品精品| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产成人免费无遮挡视频| 一级二级三级毛片免费看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 有码 亚洲区| 亚洲内射少妇av| 精品久久久久久久久av| av免费在线看不卡| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲av福利一区| 美女主播在线视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久99精品国语久久久| 寂寞人妻少妇视频99o| 99视频精品全部免费 在线| 色网站视频免费| 欧美三级亚洲精品| 永久免费av网站大全| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 成人手机av| 交换朋友夫妻互换小说| 日韩一本色道免费dvd| 国产黄频视频在线观看| 一区在线观看完整版| 日韩中字成人| 最黄视频免费看| 我的女老师完整版在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产精品 国内视频| 国产成人精品无人区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 性高湖久久久久久久久免费观看| 色5月婷婷丁香| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 天堂中文最新版在线下载| 两个人的视频大全免费| 国产极品天堂在线| 亚洲av中文av极速乱| 国产成人精品无人区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 五月开心婷婷网| 岛国毛片在线播放| 国产日韩欧美在线精品| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲不卡免费看| 久久久久久久亚洲中文字幕| videos熟女内射| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 午夜影院在线不卡| 亚洲综合色惰| 精品久久蜜臀av无| 国产成人精品婷婷| 午夜激情久久久久久久| 一级毛片 在线播放| 中国三级夫妇交换| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 少妇人妻久久综合中文| 99热国产这里只有精品6| 精品久久蜜臀av无| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲av二区三区四区| 老司机影院毛片| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 久久99热6这里只有精品| 熟女人妻精品中文字幕| 国产 精品1| 欧美精品亚洲一区二区| videossex国产| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 国产片内射在线| 亚洲精品国产色婷婷电影| 婷婷色综合大香蕉| 26uuu在线亚洲综合色| 午夜av观看不卡| 视频区图区小说| 777米奇影视久久| 777米奇影视久久| 黑人猛操日本美女一级片| 精品少妇久久久久久888优播| 在线观看免费高清a一片| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | av电影中文网址| 一区二区三区免费毛片| 免费观看的影片在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲精品国产av成人精品| 精品卡一卡二卡四卡免费| 婷婷色综合www| 老司机影院成人| 51国产日韩欧美| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 午夜av观看不卡| 日韩大片免费观看网站| 国产片内射在线| 一本一本综合久久| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲精品日本国产第一区| 国产高清三级在线| 亚洲三级黄色毛片| 久久精品人人爽人人爽视色| 中文天堂在线官网| 桃花免费在线播放| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品国产国语对白av| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产精品久久久久久久久免| 国产午夜精品一二区理论片| 免费看光身美女| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产免费现黄频在线看| 一区在线观看完整版| 少妇人妻久久综合中文| 夫妻午夜视频| 精品国产国语对白av| a 毛片基地| 久久久久久人妻| 99久久人妻综合| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美日韩亚洲高清精品| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 新久久久久国产一级毛片| 久久久国产欧美日韩av| 日韩电影二区| 国产精品99久久久久久久久| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲第一区二区三区不卡| 成人免费观看视频高清| .国产精品久久| 成人毛片60女人毛片免费| 久久久亚洲精品成人影院| 街头女战士在线观看网站| 日本vs欧美在线观看视频| 五月玫瑰六月丁香| 搡老乐熟女国产| 久久 成人 亚洲| 能在线免费看毛片的网站| 国产精品久久久久久精品电影小说| 少妇 在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 亚洲av日韩在线播放| 永久免费av网站大全| 免费人妻精品一区二区三区视频| 99热国产这里只有精品6| 日本午夜av视频| 最黄视频免费看| 制服丝袜香蕉在线| 99国产综合亚洲精品| 边亲边吃奶的免费视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 有码 亚洲区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 人妻系列 视频| 在线观看一区二区三区激情| 色94色欧美一区二区| 2022亚洲国产成人精品| 九色成人免费人妻av| av不卡在线播放| 2021少妇久久久久久久久久久| 久久久精品区二区三区| 欧美97在线视频| 一个人看视频在线观看www免费| 国产av精品麻豆| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 丁香六月天网| 91精品三级在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 久久久午夜欧美精品| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 午夜免费鲁丝| 男人爽女人下面视频在线观看| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 成人亚洲欧美一区二区av| 制服诱惑二区| 日日爽夜夜爽网站| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲少妇的诱惑av| 精品少妇黑人巨大在线播放| 满18在线观看网站| 欧美日韩视频精品一区| 欧美国产精品一级二级三级| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产综合精华液| 我要看黄色一级片免费的| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 精品一品国产午夜福利视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 91aial.com中文字幕在线观看| 精品久久久久久久久av| 2021少妇久久久久久久久久久| 新久久久久国产一级毛片| 十八禁网站网址无遮挡| 久久久亚洲精品成人影院| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 18禁在线播放成人免费| 日韩亚洲欧美综合| 成年av动漫网址| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲国产av影院在线观看| 精品久久蜜臀av无| 搡老乐熟女国产| 国产片特级美女逼逼视频| 在线观看人妻少妇| 久久鲁丝午夜福利片| 18在线观看网站| 日韩三级伦理在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 91精品国产九色| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| videosex国产| 亚洲熟女精品中文字幕| 男女高潮啪啪啪动态图| 午夜福利影视在线免费观看| 美女视频免费永久观看网站| 热99久久久久精品小说推荐| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 最黄视频免费看| 免费大片18禁| 简卡轻食公司| 国产日韩欧美在线精品| 久久国产精品大桥未久av| 91aial.com中文字幕在线观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 伊人久久国产一区二区| www.av在线官网国产| 在线观看免费日韩欧美大片 | 成年人午夜在线观看视频| 日本91视频免费播放| av有码第一页| 国产熟女午夜一区二区三区 | 涩涩av久久男人的天堂| 久久鲁丝午夜福利片| 一区二区三区精品91| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 高清欧美精品videossex| 免费黄网站久久成人精品| 91精品三级在线观看| 国产精品国产三级专区第一集| 久久人人爽人人爽人人片va| 插阴视频在线观看视频| 九九爱精品视频在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲欧洲日产国产| 日本欧美国产在线视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产精品.久久久| 国产极品天堂在线| 男女高潮啪啪啪动态图| 成年人午夜在线观看视频| 久久久国产欧美日韩av| 免费高清在线观看日韩| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 在线免费观看不下载黄p国产| 精品人妻在线不人妻| av网站免费在线观看视频| 精品久久蜜臀av无| 精品卡一卡二卡四卡免费| 免费黄网站久久成人精品| 伦精品一区二区三区| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美 日韩 精品 国产| 大陆偷拍与自拍| 极品人妻少妇av视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| tube8黄色片| 寂寞人妻少妇视频99o| 有码 亚洲区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产一区二区三区av在线| 校园人妻丝袜中文字幕| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产成人av激情在线播放 | 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 99视频精品全部免费 在线| 大码成人一级视频| 欧美日韩av久久| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产一区二区三区av在线| 亚洲高清免费不卡视频| 在线观看一区二区三区激情| 伊人亚洲综合成人网| 久久久久人妻精品一区果冻| 嘟嘟电影网在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 99九九在线精品视频| 久久狼人影院| 中文天堂在线官网| 伦理电影免费视频| 久久精品夜色国产| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 天堂8中文在线网| 高清毛片免费看| 高清午夜精品一区二区三区| 精品久久蜜臀av无| 国产 精品1| 亚洲欧美成人精品一区二区| 男人操女人黄网站| 一级毛片我不卡| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲精品视频女| 色视频在线一区二区三区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲av二区三区四区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 老司机影院成人| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 午夜福利网站1000一区二区三区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 婷婷色av中文字幕| 国产av码专区亚洲av| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| av不卡在线播放| 蜜桃国产av成人99| 黄色配什么色好看| 亚洲综合色惰| 午夜福利影视在线免费观看| 久热这里只有精品99| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 精品少妇内射三级| 日本91视频免费播放| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 久久97久久精品| 高清在线视频一区二区三区| 国产成人精品无人区| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产精品 国内视频| 国产精品女同一区二区软件| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产亚洲最大av| 欧美成人精品欧美一级黄| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 夫妻午夜视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 永久网站在线| 亚洲国产精品一区三区| 老熟女久久久| 国产精品 国内视频| 91在线精品国自产拍蜜月| videos熟女内射| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产精品一区二区在线不卡| 99热这里只有精品一区| 久久99一区二区三区| 99九九线精品视频在线观看视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品熟女少妇av免费看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 2021少妇久久久久久久久久久| 免费少妇av软件| 婷婷色麻豆天堂久久| 卡戴珊不雅视频在线播放| 精品一区二区三卡| 黄片无遮挡物在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 秋霞伦理黄片| av免费观看日本| 亚洲四区av| 国产伦理片在线播放av一区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日韩 亚洲 欧美在线| 少妇高潮的动态图| 2018国产大陆天天弄谢| 国产一级毛片在线| 国产av码专区亚洲av| av天堂久久9| av黄色大香蕉| 国产精品国产三级专区第一集| 丝袜美足系列| h视频一区二区三区| 亚洲天堂av无毛| 在线 av 中文字幕| 免费看光身美女| xxx大片免费视频| 国产一级毛片在线| 在线看a的网站| 国产黄片视频在线免费观看| 能在线免费看毛片的网站| 国产色爽女视频免费观看| 国产精品国产三级专区第一集| 国产免费一区二区三区四区乱码| 精品人妻在线不人妻| 亚洲av成人精品一二三区| 精品人妻熟女av久视频| 伦理电影大哥的女人| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 在线观看免费高清a一片| 午夜视频国产福利| 极品人妻少妇av视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| av.在线天堂| 99久久综合免费| 亚洲久久久国产精品| 各种免费的搞黄视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲成人av在线免费| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产日韩欧美在线精品| 哪个播放器可以免费观看大片| 在现免费观看毛片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 亚洲国产日韩一区二区| 国产精品免费大片| 伊人久久国产一区二区| 日本与韩国留学比较| 亚洲国产色片| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲国产精品一区三区| 少妇的逼水好多| 亚洲av国产av综合av卡| 午夜激情av网站| 欧美日韩成人在线一区二区| 秋霞在线观看毛片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 大陆偷拍与自拍| 我要看黄色一级片免费的| 熟女电影av网| 免费日韩欧美在线观看| 男的添女的下面高潮视频| 熟女人妻精品中文字幕| 男女免费视频国产| 国产精品久久久久久av不卡| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产成人免费无遮挡视频| 国产精品.久久久| 国产精品女同一区二区软件| 国产一区二区三区综合在线观看 | 精品国产国语对白av| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲国产精品成人久久小说| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 日本爱情动作片www.在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 中国三级夫妇交换| 亚洲人成网站在线播| 91aial.com中文字幕在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 在线看a的网站| av电影中文网址| 国产高清不卡午夜福利| 久久韩国三级中文字幕| 色5月婷婷丁香| 精品一区在线观看国产| 在线观看一区二区三区激情| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 晚上一个人看的免费电影| 国产黄频视频在线观看| 51国产日韩欧美| 在线看a的网站| 高清欧美精品videossex| 色网站视频免费| 丝袜美足系列| 伦理电影大哥的女人| 久久精品久久精品一区二区三区| a级片在线免费高清观看视频| 国国产精品蜜臀av免费| 在线观看免费视频网站a站| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲av在线观看美女高潮| 最新中文字幕久久久久| 热re99久久精品国产66热6| 国产精品国产三级专区第一集| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲av欧美aⅴ国产| 简卡轻食公司| 男的添女的下面高潮视频| 精品一区二区三区视频在线| 伊人亚洲综合成人网| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲av中文av极速乱| 麻豆乱淫一区二区| 国产精品国产三级专区第一集| 99热全是精品| 亚洲精品,欧美精品| 久久久精品区二区三区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 99热这里只有是精品在线观看| 国产精品成人在线| 91精品国产九色| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 最后的刺客免费高清国语| 人体艺术视频欧美日本| av在线播放精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 性高湖久久久久久久久免费观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产在线免费精品| av卡一久久| 99精国产麻豆久久婷婷| av不卡在线播放| 久久久久久久久久久久大奶| 三级国产精品片| 制服诱惑二区| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国产亚洲一区二区精品| 黄片无遮挡物在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久久久久人妻| 日日撸夜夜添| 夜夜爽夜夜爽视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 麻豆成人av视频| 热re99久久国产66热| 成人免费观看视频高清|