基于高通量測序分析番茄自然發(fā)酵過程中的真菌多樣性

秦宇蒙，周笑犁 ，管慶林，劉云寒，吳承木

（1. 貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州 貴陽 550005；2. 貴州省普通高等學校功能食品重點實驗室，貴州 貴陽 550005）

0 引言

【研究意義】番茄（Lycopersicon esculentumM iller）為管狀花目（Tubiflorae）、茄科（Solanaceae）、番茄屬（Lycopersicon）的一種一年生或多年生草本植物，色澤鮮艷，生熟皆宜食用。它含有豐富的番茄紅素、維生素E、維生素C、類胡蘿卜素、類黃酮和酚類等多種活性物質(zhì)[1]，對人體健康起著非常重要的作用。尤其是其富含的番茄紅素具有抗氧化、降血脂、抗癌、提高機體免疫力等功效[2]。而近些年我國逐漸出現(xiàn)了番茄的滯銷現(xiàn)象，這不僅給果農(nóng)的收益帶來影響，還造成營養(yǎng)物質(zhì)的大量浪費，從而困擾了番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此加強番茄深加工力度和開辟新的利用途徑對其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有一定的現(xiàn)實意義。酵素是以植物、動物、菌類等為原料，由微生物發(fā)酵后制得的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品[3]，其不僅含有乳酸菌、酵母菌等多種微生物，還有著豐富的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗氧化、提高免疫力、保護心血管以及抑制肥胖等作用[4]。目前，大多數(shù)酵素產(chǎn)品多以自然發(fā)酵為主，但是這種發(fā)酵方式易受環(huán)境氣候等條件影響，且質(zhì)量較難控制。因此，解析酵素自然發(fā)酵過程中的微生物群落變化規(guī)律，可以為篩選發(fā)酵優(yōu)勢菌株奠定理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】目前，人們對于酵素的研究大多集中在功效酶活性、代謝產(chǎn)物、抗氧化活性等方面[5?7]以及發(fā)酵過程中酵母菌、乳酸桿菌的分離鑒定[3,4,8]。但是基于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分離得到的微生物十分有限，而且耗時耗力，因此為了更加高效、準確地解析發(fā)酵過程中微生物的組成及其多樣性變化規(guī)律，越來越多的免培養(yǎng)技術(shù)被廣泛應(yīng)用。高通量測序技術(shù)因其具有快捷、準確、高效的特點，近年來逐漸成為國內(nèi)外研究菌群多樣性特征的新手段。丁建才等[9]使用高通量測序分析了河北昌黎產(chǎn)區(qū)干紅葡萄酒發(fā)酵過程中真菌群落， 共鑒定出128個屬，分布在漢遜酵母屬、釀酒酵母屬、未被鑒定的屬、短梗霉屬、被孢霉屬等。康曉樂等[10]采用宏基因組技術(shù)分析得出，蘋果自然發(fā)酵過程中優(yōu)勢細菌屬為乳桿菌屬和葡萄糖酸桿菌屬，優(yōu)勢真菌屬為接合酵母屬和漢遜酵母屬。張琪等[11]利用高通量測序分析沙棘酵素自然發(fā)酵過程中的細菌多樣性，發(fā)現(xiàn)藍藻細菌門為發(fā)酵過程中的絕對優(yōu)勢菌門?！颈狙芯壳腥朦c】筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，天然發(fā)酵的成熟紅番茄具有良好的抗氧化活性，隨著發(fā)酵時間的延長，總酚等生物活性物質(zhì)在發(fā)酵過程中也有所增加[12]，并從發(fā)酵液中分離得到了3株畢赤酵母菌[13]，而對自然發(fā)酵過程中真菌群落多樣性方面的研究還有待進一步探索。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過高通量測序技術(shù)，進一步分析番茄自然發(fā)酵不同時期中真菌的多樣性及其群落動態(tài)變化規(guī)律，同時對其發(fā)酵過程中理化指標進行測定，為后續(xù)深入研究番茄酵素中菌落結(jié)構(gòu)及其在自然發(fā)酵中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮小番茄、白砂糖購自沃爾瑪超市；E.Z.N.A.?soil試 劑 盒，美 國Omega Bio-tek公 司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，美國Axygen公司；Tris-HCl緩沖液，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫酸（分析純），太倉滬試劑有限公司；無水乙醇（分析純），天津市富宇精細化工有限公司；蘇丹I色素（分析純），天津市科密歐化學試劑有限公司；甲苯（分析純），重慶川東化工有限公司；重鉻酸鉀（分析純），金山化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T100PCR擴增儀，美國BIO-RAD公司；YXQLS-50SII立式高壓滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1G單人超凈工作臺，上海力辰邦西儀器科技有限公司；高速冷凍離心機，德國艾本德；AUW 120D電子分析天平，日本島津公司；PHS-3C pH計，儀電科學儀器（上海）有限公司；移液槍，興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司；BSM 120.4分析天平，卓精電子科技（上海）有限公司；JYL-Y5九陽高速破壁調(diào)理機，九陽股份有限公司；PAL-BX手持型糖酸一體機，日本Atago公司；UV-2550紫外可見光分光光度計，濟南海能儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備 選取大小相近，無病蟲害，外表光澤無破損，顏色鮮紅的新鮮小番茄，去蒂、自來水清洗2次、無菌水清洗3次、無菌風干并切分。將番茄與白砂糖以質(zhì)量比3∶1的比例放入滅菌發(fā)酵瓶中室溫避光發(fā)酵90 d，發(fā)酵前期每天上下翻轉(zhuǎn)搖晃玻璃瓶使白砂糖均勻融化，定期排氣防止脹罐，設(shè)置兩個批次進行發(fā)酵。

1.3.2 樣品采集 于第0、10、20、30、60、90 d從兩批次的番茄發(fā)酵瓶中3個位點（底部、中部和上層）取樣50 m L放入滅菌的離心管中，依次編號為G1、G2、G3、G4、G5和G6，置于?80 ℃超低溫冰箱保存，用于后續(xù)分析。

1.3.3 理化指標分析檢測

（1） pH：用pH計測定不同時期的番茄發(fā)酵液，待數(shù)據(jù)穩(wěn)定后記錄數(shù)據(jù)。

（2） 可溶性固形物：使用手持糖量計測定不同時期的番茄發(fā)酵液，讀數(shù)并記錄。

（3） 酒精度：參考李嶺卓等[14]的方法稍加改變，取5 m L樣品液依次加入10 m L重鉻酸鉀、5 m L H2SO4混勻并用錫紙封口，使其充分反應(yīng)10 m in，在波長610 nm下測吸光度。以乙醇標準曲線方程y=1.034 3x+0.008，R2=0.999 7得出酒精度。

（4） 番茄紅素：采用分光光度法[15]檢測不同時期發(fā)酵液中番茄紅素的含量，取5 g去除黃色素的番茄發(fā)酵渣，向渣中加入少許甲苯，攪拌、過濾，重復多次至濾液無色為止，用25 m L棕色容量瓶收集濾液并用甲苯定容，于485 nm下測吸光度值。番茄紅素含量以蘇丹I色素為標準物，按標準曲線方程y=1.0657x+0.0028，R2=0.9981得出番茄紅素含量。

1.3.4 DNA提 取、PCR擴 增 和 高 通 量 測 序 利用DNA提取試劑盒提取番茄發(fā)酵液中微生物基因組DNA，提取步驟根據(jù)說明書進行；以基因組DNA為模板，根據(jù)真菌ITS區(qū)通用引物進行PCR擴增；利用Illum ina M iSeq對擴增成功的產(chǎn)物進行高通量測序和分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 高通量測序數(shù)據(jù)通過上海生物工程股份有限公司多樣性測序及分析平臺完成。通過barcode區(qū)分樣品序列，并對各樣本序列進行質(zhì)控和過濾；將多條序列根據(jù)其序列之間的距離來進行聚類，再通過相似性在97%以上的序列進行OTU聚類和物種分類分析。通過繪制Shannon-W iener曲線、多樣性指數(shù)、分類學信息等進行番茄自然發(fā)酵液中真菌群落結(jié)構(gòu)分析統(tǒng)計。

理化指標均重復測定3次，數(shù)據(jù)用平均數(shù)值±標準差值表示，采用單因素方差分析（ANOVA）和SPSS 25.0軟件進行單次實驗統(tǒng)計檢驗數(shù)據(jù)性狀分析，采用Duncan's多重極差法進行統(tǒng)計檢驗，確定各試驗數(shù)據(jù)性狀的顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄自然發(fā)酵過程中理化指標分析

番茄自然發(fā)酵過程中理化指標變化見圖1。由圖1可知，隨著發(fā)酵的進行，pH值和可溶性固形物均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢（P＜0.05），說明隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵體系中的碳源逐步被微生物菌群利用產(chǎn)生有機酸等代謝產(chǎn)物，從而使得體系的酸度增大，以致pH逐漸減小，形成良好的相互佐證。而酒精度與番茄紅素呈現(xiàn)的變化趨勢相近，在發(fā)酵初期顯著下降（P＜0.05），這可能是由于一般果蔬原料中均帶有大量微生物，包括有害菌等作為初始時的優(yōu)勢菌群利用了這些物質(zhì)，且初期產(chǎn)酒精的菌群還未生長等。隨后酒精度和番茄紅素迅速增加后又下降，這可能是由于隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵中期乳桿菌占主導地位，利用蔗糖、葡萄糖、果糖等可發(fā)酵糖進行異型發(fā)酵，酵母菌也逐步成為優(yōu)勢真菌，可將番茄中的糖類轉(zhuǎn)化成乙醇和二氧化碳，以及一些次級代謝產(chǎn)物，如短鏈的醇、脂肪酸和酯類等，使得微生物處于缺氧的環(huán)境，同時微生物代謝產(chǎn)生的有機酸使pH逐漸下降，酒精度逐漸上升，在這種不適宜微生物生長的條件下，會抑制絕大部分微生物尤其是初期有害菌的生長繁殖，這也與后續(xù)真菌多樣性的測序結(jié)果一致。并且，酵母菌代謝產(chǎn)生的醇類與乳酸菌代謝產(chǎn)生的有機酸可反應(yīng)生成酯類，這可能與發(fā)酵果蔬的風味相關(guān)。

圖1 發(fā)酵過程中理化指標的變化情況Fig. 1 Changes in physiochem ical properties of broth during ferm entation

2.2 番茄自然發(fā)酵過程中真菌豐富性和多樣性分析

2.2.1 A lpha多樣性分析 稀釋曲線趨于平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量的OTU，反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU[16]。從6組番茄發(fā)酵液樣品中共獲得705 309條有效序列，再依據(jù)97%相似性水平下的OTU信息進行聚類分析，共獲得4 499個OTU。從圖2-a、b可以看出，隨著測序量的增大，香農(nóng)曲線趨于平緩，說明盡管增加測序量樣品微生物的多樣性已經(jīng)不再隨之發(fā)生變化；各個樣品的稀釋曲線接近平臺期達到飽和，說明主要真菌基本能覆蓋，各組樣品中的物種多樣性豐富程度高。

圖2 真菌群落OTU稀疏曲線（a）和Shannon指數(shù)稀疏曲線（b）Fig. 2 Rarefaction curves on OTU （a） and Shannon index （b） of fungal community

基于在97%相似度水平的OTU數(shù)，各樣品A lpha多樣性指數(shù)值如表1所示。Coverage指數(shù)表明各樣品文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列沒有被測出的概率越低，反映了測序結(jié)果是否代表樣本的真實情況[17]。由表1可知，番茄不同發(fā)酵時期每組的Coverage值均在0.998以上，表明測序深度良好，覆蓋率高，可以真實展示樣品中真菌的多樣性。Chao1和Ace指數(shù)在生態(tài)學中常用來估計物種總數(shù)，其數(shù)值越大則表明菌群豐富度越高[18]。如表1所示，發(fā)酵初始時（0 d）樣品具有較低的真菌豐富度和多樣性；隨著發(fā)酵周期的延長，真菌的豐富度呈先上升后下降再上升的趨勢，說明豐富的真菌不僅來自番茄樣品本身，還與發(fā)酵環(huán)境有著很大的聯(lián)系，良好的發(fā)酵環(huán)境有利于微生物的生長；G3時期的豐富度顯著下降可能是由于此時酒精度迅速升高。如，在大頭菜發(fā)酵過程中，隨著食鹽量的逐漸增加，導致不耐鹽真菌逐漸消失，真菌群落的豐富度和多樣性下降[19]。Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)常用來估算樣品中微生物的多樣性。Shannon指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高，而Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低[20]。由表1可知，番茄自然發(fā)酵過程中真菌多樣性呈動態(tài)變化，且各組樣品的Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)變化趨勢呈反比關(guān)系，所反映的發(fā)酵過程中真菌群落多樣性變化與Chao1及Ace指數(shù)呈現(xiàn)的變化規(guī)律基本一致。G4組的Shannon指數(shù)最大且Simpson指數(shù)最低，說明該組的菌群多樣性最高，而G3時期卻最低；說明在番茄的天然發(fā)酵過程中，真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的波動。本課題組在此之前對番茄自然發(fā)酵過程中細菌多樣性的分析發(fā)現(xiàn)，其物種數(shù)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，可能是由于優(yōu)勢發(fā)酵菌群的形成、營養(yǎng)物質(zhì)的消耗、代謝產(chǎn)物的積累，從而抑制其他菌群的生長[21]。

表1 樣本信息和多樣性指數(shù)Table 1 In form ation and diversity index on sam p les

2.2.2 Beta多樣性分析 Beta多樣性用于比較不同樣本微生物群落構(gòu)成的差異。樣本聚類樹圖可以通過樹枝結(jié)構(gòu)直觀反映多個樣品間的相似性和差異關(guān)系。如圖3所示，各組番茄發(fā)酵液樣品分為兩大支，分別代表發(fā)酵前和發(fā)酵后，發(fā)酵初始聚集在下方，開始發(fā)酵后的樣品分為三大組聚集在上方，其中又可分為三大類，其中G2和G3、G4和G5，以及G6樣品組分別聚為一類。由此可以將自然發(fā)酵過程大致分為發(fā)酵初期、發(fā)酵中期和發(fā)酵后期3個時期。說明在發(fā)酵的相同階段，真菌群落組成結(jié)構(gòu)相似；發(fā)酵時期不同，真菌的菌群結(jié)構(gòu)存在一定差異。

圖3 OTU水平上樣本真菌群落聚類分析Fig. 3 Cluster analysis on fungal comm unities of sam p les atOTU level

2.3 番茄自然發(fā)酵過程中真菌群落組成分析

2.3.1 Venn 圖 分 析 Venn圖 直觀展 現(xiàn) 出 樣 品OTU數(shù)目的組成相似性及重疊情況，前述6組樣品共產(chǎn)生了4 499條OTU，從圖4中可以看出各組樣品共同擁有的OTU數(shù)量為87，約占各組樣品OTU數(shù)量的19.6%～29.1%，說明各組樣品間均有一定數(shù)量的相似真菌。各個組間未重疊的OTU數(shù)分別為104、150、138、192、272和283，說明各組樣品含有不同于其他組樣品特有的OTU。隨著發(fā)酵周期的延長，各組獨有OTU數(shù)量的增加說明自然發(fā)酵的環(huán)境有利于真菌的增殖，而相似種類較少，這說明番茄自然發(fā)酵的不同時期既有相同又存在一定的差異。

圖4 OTU韋恩圖Fig. 4 Venn diagram of OTUs

2.3.2 真菌在門類水平上的分類和比較 番茄自然發(fā)酵過程中各組樣品的微生物群落在門分類水平上具有較高的多樣性，由圖5可知，分析番茄發(fā)酵液各時期樣品在門水平上的真菌群落組成，去除未分類的真菌后，樣品中真菌群落包含11個門，主要有子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、隱真菌門（Rozellomycota）、壺 菌 門（Chytridiomycota）等。其中，子囊菌門始終在整個發(fā)酵過程中占絕對的主導地位，其次為擔子菌門，它們在不同發(fā)酵時期的相對豐度差異較大，占比分別為22.43%～75.27%和0.48%～7.10%；子囊菌門在G1-G3時期呈下降趨勢，而此時擔子菌門逐漸上升，直至G4時期開始，子囊菌門逐漸上升，在發(fā)酵后期占絕對優(yōu)勢，擔子菌門的相對豐度迅速減少，到后期時更低，二者呈現(xiàn)交替消長的現(xiàn)象。研究表明，子囊菌門和擔子菌門中的微生物均為土壤中的優(yōu)勢菌種，能夠分解大多數(shù)有機物質(zhì)和植物殘骸[22]，這與本研究結(jié)果一致；它們中有著多種發(fā)酵菌種屬，如酵母菌屬、畢赤酵母菌屬、漢遜酵母屬等，這與屬水平相對含量圖分析相似。說明果蔬原料中帶著大量微生物，包括乳酸菌、酵母菌等，且通過這些真菌和細菌共同參與發(fā)酵。這同黑果枸杞發(fā)酵液[23]、四川泡菜母水[24]及酸湯[25]等發(fā)酵制品中在門水平上發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢菌群相似，說明不同時期的番茄發(fā)酵液樣品在門分類水平上群落結(jié)構(gòu)多樣性相近，且分布廣泛，對發(fā)酵食品起著極大的作用[26]，代謝產(chǎn)物還能夠起到抗菌、抗腫瘤的作用[27]。而泡菜母水[24]中卻還含有接合菌門（Zygomycota）、黑果枸杞酵素[23]中還有被孢霉菌門（Mortierellomycota）等優(yōu)勢菌，這說明不同發(fā)酵制品中有相同的真菌，也有其特有的菌，不同菌在發(fā)酵中的作用還有待深入研究。

圖5 門水平上真菌群落組成分析Fig. 5 Com position of fungal community at phylum level

2.3.3 真菌屬類水平比較 由圖6可知，番茄自然發(fā)酵過程中不同時期真菌群落在屬分類水平上共檢測出31種已知的真菌屬。真菌的菌群結(jié)構(gòu)簡單可能由多方面因素造成，如酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的酒精會對自身和其他真菌有毒害作用，優(yōu)勢乳酸菌、酵母菌屬等微生物代謝產(chǎn)生的有機酸也會使真菌的生長環(huán)境發(fā)生改變，使其不宜生長繁殖。在G1時期樣品中主要優(yōu)勢真菌為青霉屬（Penicillium），相對豐度為37.51%，其次為雙足囊菌屬（Dipodascus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、輪枝菌屬（Verticillium）；隨后，青霉屬的相對豐度迅速減少，在G2-G5時期，真菌的種類較復雜，輪枝菌屬占據(jù)了優(yōu)勢，相對豐度為6.67%～22.92%，其次為威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、念珠菌屬（Candida）、鐮刀菌屬和曲霉菌屬（Aspergillus）；在G6時期，樣品中漢遜酵母屬（Hanseniaspora）豐度大大提高，其占比為33.55%，成為該時期的優(yōu)勢菌屬，其次為接合酵母屬（Zygosaccharomyces）。表明在番茄發(fā)酵過程中，其表面附著的微生物參與發(fā)酵，隨著發(fā)酵時間延長，微生態(tài)環(huán)境變化使得部分真菌的繁殖受到抑制，降低了物種的多樣性，如發(fā)酵初期的諸多優(yōu)勢菌屬不能在高酸度，高乙醇濃度及厭氧環(huán)境下生存而逐漸消亡。而后期酵母屬等會消耗體系中的營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)酯、產(chǎn)醇、產(chǎn)有機酸等風味物質(zhì)，主要起生香作用，并且漢遜酵母屬還會利用部分酒精，這也同前述酒精度在G4期后顯著下降這一結(jié)果一致。結(jié)合在前期對番茄自然發(fā)酵過程中細菌多樣性的分析，由此推斷番茄自然發(fā)酵過程存在酵母菌和乳酸菌兩類發(fā)酵，它們分別利用發(fā)酵環(huán)境中的糖產(chǎn)生酒精和有機酸，以及其他風味物質(zhì)等，并抑制不耐酸菌或雜菌生長。果蔬自然發(fā)酵過程中微生物的種類十分豐富，蘋果自然發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌屬有接合酵母屬和漢遜酵母屬[10]；桑葚酵素發(fā)酵過程中的優(yōu)勢真菌為未分類酵母屬（Saccharomycetales）、漢遜酵母屬[28]；這均與本試驗番茄自然發(fā)酵末期的優(yōu)勢真菌屬相似。而高慶超[23]發(fā)現(xiàn)黑果枸杞酵素的優(yōu)勢真菌屬有鏈格孢屬（Alternaria）、球腔菌屬（Mycosphaerella）、黑粉菌屬（Filobasidium）、酵母屬（Saccharomy）和鎖瑚菌屬（Membranomyces）；紅樹莓發(fā)酵液中前期優(yōu)勢菌種屬為釀酒酵母屬（Saccharomyces），中后期優(yōu)勢菌種屬為漢遜酵母屬、Kazachstania[29]。這說明發(fā)酵不同時期以及不同果蔬發(fā)酵過程中的優(yōu)勢真菌存在差異，體現(xiàn)出微生物群落對不同果實營養(yǎng)成分具有一定的偏好，由于不同果實生長環(huán)境和氣候不同，導致其原生的真菌群落不盡相同。

圖6 屬水平上真菌群落組成分析Fig. 6 Com position of fungal community at genus level

2.3.4 物種豐度熱圖 Heatmap可以用顏色變化來反映群落分布的豐度信息，可以直觀地將群落分布豐度值用定義的顏色深淺表示。圖中每一列代表一組樣本，行代表群落結(jié)構(gòu)，顏色塊代表相對物種豐度值，顏色越紅表示相對豐度越高，顏色越藍反之[30]。由圖7可見，番茄自然發(fā)酵液在不同分類水平上均表現(xiàn)出一定的多樣性，不同時期的發(fā)酵液中優(yōu)勢菌群和相對豐度也各不相同；其中G1與其他組樣品差距較大，G2和G3相似，G4-G6基本接近，說明隨著發(fā)酵番茄的成熟，各組樣品之間的微生物差異性減少，物種豐度越來越相似。由于番茄原料原始附著的微生物在發(fā)酵初期占據(jù)主導地位參與自然發(fā)酵，但其中青霉屬等在發(fā)酵過程中容易引起腐敗變質(zhì)，不利于發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)；隨著發(fā)酵的持續(xù)發(fā)生，底物中的糖類等營養(yǎng)物質(zhì)逐步被微生物利用，發(fā)酵產(chǎn)生乙醇、二氧化碳及一些次級代謝產(chǎn)物，輪枝菌屬在發(fā)酵中期顯示較高的豐度；漢遜酵母屬和接合酵母屬在發(fā)酵末期占主導地位，它在發(fā)酵過程中能夠利用糖類進行生長代謝，產(chǎn)生或者催化產(chǎn)生酒石酸、氨基酸等[29]，以及代謝產(chǎn)生的醇類與乳酸菌代謝產(chǎn)生的有機酸可反應(yīng)生成酯類，這與風味物質(zhì)的形成可能存在一定的關(guān)聯(lián)。但各菌株之間的相互作用機理及其在不同時期發(fā)揮的作用還有待進一步探究。

圖7 屬水平上真菌群落組成熱圖Fig. 7 Heatm ap of fungal comm unities at genus level

3 討論與結(jié)論

本研究采用高通量測序技術(shù)對番茄自然發(fā)酵過程中真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)進行分析，從不同發(fā)酵時期的樣品中共獲得705 309條有效序列，再依據(jù)97%相似性水平下的OTU信息進行聚類分析，共獲得4 499個OTU。經(jīng)樣本聚類分析可以將整個發(fā)酵過程大致分為發(fā)酵初始（0 d）、發(fā)酵初期（10～20 d）、發(fā)酵中期（30～60 d）和發(fā)酵后期（90 d）。隨著發(fā)酵時間的延長，真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化，去除未分類的真菌后，各組樣品中真菌群落包含11個門，其優(yōu)勢真菌門類為子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）；屬分類水平上，共檢測出31個屬，青霉屬（Penicillium）為發(fā)酵初期的優(yōu)勢真菌屬，隨后演替為輪枝菌屬（Verticillium），最后漢遜酵母屬（Hanseniaspora）和接合酵母屬（Zygosaccharomyces）占據(jù)了優(yōu)勢。隨著發(fā)酵時間的延長，酵母菌屬逐步成為優(yōu)勢真菌，可將番茄中的糖類轉(zhuǎn)化成乙醇以及一些次級代謝產(chǎn)物，使得微生物處于缺氧的環(huán)境，同時發(fā)酵體系的可溶性固形物逐漸減少，微生物代謝產(chǎn)生的有機酸使pH逐漸下降，酒精度和番茄紅素含量逐漸上升，在這種不適宜微生物生長的條件下，抑制了絕大部分微生物尤其是初期有害菌的生長繁殖。本研究嘗試系統(tǒng)地揭示自然發(fā)酵番茄的真菌多樣性和群落組成，為番茄酵素發(fā)酵過程中菌群的調(diào)控提供方向，也為評價果蔬發(fā)酵制品對機體健康的影響奠定基礎(chǔ)，以期開發(fā)出高附加值的番茄產(chǎn)品及其發(fā)酵制品。