番茄細(xì)菌性髓部壞死病病原細(xì)菌的鑒定

陳梅春，肖榮鳳，陳燕萍，鄭雪芳，朱育菁，王階平，劉 波

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州350003）

0 引言

【研究意義】番茄是世界主要經(jīng)濟(jì)作物之一，但其極易受到病害威脅，而且番茄病害種類(lèi)多、為害嚴(yán)重，極大地制約了番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。開(kāi)展番茄病害病原分離鑒定研究，可為番茄病害發(fā)生規(guī)律探究和病害防治提供參考。【前人研究進(jìn)展】目前已發(fā)現(xiàn)的番茄病害包括真菌病害、細(xì)菌病害、病毒病、線蟲(chóng)病害和生理病害等，其中細(xì)菌性病害主要危害植株的葉片和莖[1?3]。細(xì)菌病害發(fā)生后，一般減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重時(shí)甚至造成絕收。番茄細(xì)菌性病害主要包括青枯病[4]、潰瘍病[5]、髓部壞死病[6]、瘡痂病[7]、葉斑病[8]，這些病害的病原菌都可以通過(guò)傷口入侵和雨水傳播，尤其在田間或棚內(nèi)濕度大時(shí)極易擴(kuò)展蔓延。其中，引起番茄髓部壞死病的病原菌包括假單胞菌屬和果膠桿菌屬的8種病菌，如菊苣假單胞菌（Pseudomonas cichorii）[9]、皺紋假單胞菌（P. corrugata）[10]、熒光假單胞菌（P. fluorescens）[11]、果膠桿菌（Pectobacterium atrosepticum）[12]等。番茄細(xì)菌性髓部壞死呈現(xiàn)癥狀包括植物莖表面出現(xiàn)黃色、棕色或黑色的病斑，莖髓部出現(xiàn)水浸狀、褪色、空心或軟腐，維管束組織呈黃化或褐變[13]。目前已報(bào)道的番茄髓部壞死病主要發(fā)生在我國(guó)山東、浙江、湖北、內(nèi)蒙古、廣東、江蘇及河北等地[6]。2017–2019年，福建泉州、浙江瑞安等地大棚番茄出現(xiàn)一種病害，該病發(fā)生于花期和果期，大棚內(nèi)濕度高，打杈抹枝后容易發(fā)病，且發(fā)病速度很快，從發(fā)病到整株死亡大概20 d，發(fā)病率達(dá)15%～30%，給種植戶(hù)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】發(fā)病的番茄植株莖部表面病斑為褐色長(zhǎng)條形水漬狀；橫剖發(fā)現(xiàn)病莖維管束褐變，莖桿髓部壞死；因維管束受阻，葉片失水后萎蔫，但仍保持綠色；地上部癥狀與青枯病類(lèi)似，但地下根部無(wú)癥狀。上述癥狀顯示該病可能為番茄上的一種新病害，病原種類(lèi)未知，亟待探明?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)病原菌分離、致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)、16S rDNA測(cè)序、生理生化及質(zhì)譜等方法以期對(duì)上述病害病原類(lèi)型進(jìn)行鑒定，為該病害的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

番茄發(fā)病植株于2017–2019年采集于福建泉州、浙江瑞安等地番茄大棚的發(fā)病田塊。

1.2 病原菌的分離與培養(yǎng)

番茄發(fā)病植株莖部用自來(lái)水清洗后，用75%的酒精表面消毒，剝?nèi)ネ鈱颖砥ぃ腥∏o桿病健交界處的病組織，大小約3mm3，不同樣品各切取10片，置于75%酒精中浸泡2～5 s，再放入1%次氯酸鈉溶液中消毒5 m in，取出用無(wú)菌蒸餾水沖洗3次，置于3m L無(wú)菌蒸餾水浸泡1 h以上。取0.1μL浸泡液涂布于NA固體培養(yǎng)基（3 g·L?1牛肉膏、5 g·L?1蛋白胨、17 g·L?1瓊脂）上，30℃培養(yǎng)48 h后，挑選單菌落，連續(xù)純化2次后，用20%甘油于?80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌的致病力測(cè)定

采用1月齡（20～30 cm高）番茄盆栽苗檢測(cè)病原菌致病力。接種病原菌于LB液體培養(yǎng)基（牛肉膏5 g·L?1、蛋白胨5 g·L?1）中，30℃搖瓶培養(yǎng)48 h后，用無(wú)菌水稀釋為1×107CFU·m L?1的菌體懸浮液。處理組1：將番茄的第4個(gè)分叉枝切除，于傷口處注射接種10 m L的病原菌懸浮液，用無(wú)菌水潤(rùn)濕的紗布覆蓋傷口保濕，并用封口膜包裹，2 d后拆除。每個(gè)處理均以接種LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理組共30株苗。處理組2：將番茄植株根部浸泡于病原菌懸浮液中1 h后，取出種于栽培基質(zhì)中；將盆栽苗置于光照培養(yǎng)箱中（溫度：25～30℃；濕度：70%～80%；光照：16 h·d?1），每天觀察植株發(fā)病情況。番茄植株發(fā)病后，取病變植株重新分離病原菌，并與接種菌株進(jìn)行比較。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定利用普通光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察菌落/體形態(tài)，并測(cè)量菌體大小。1.4.2 Biolog分析采用Gen IIIM icrostation微生物鑒定進(jìn)行Biolog分析，病原菌接種于Biolog專(zhuān)用BUG+B培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，稀釋菌懸液至OD600值為0.2～0.3，于BiologGN微孔板上加入150μL菌懸液，置于30℃培養(yǎng)48 h后，觀察菌液利用96種碳源的顏色反應(yīng)。根據(jù)Biolog M icrologi數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)確定病原菌種屬。1.4.3 16S rDNA基因序列測(cè)定利用W izard基因組DNA純化試劑盒（Promega，Madison，W I）提取病原菌DNA。16SrDNA基因引物為FD1（AGAGTTT GATCCTGGCTCAG）和RD1（AAGGAGGTGATCCA GCC）。利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL（10×PCR buffer 5μL、dNTP 1μL、FD1 2μL、FD2 2 μL、Tag酶 1 μL、模板DNA 2 μL、dd H2O 37 μL），擴(kuò)增條件為：94℃5 m in；94℃30 s，55℃1m in，72℃90 s，29個(gè)循環(huán)；72℃1min；10℃20m in。

將菌株的16S rDNA基因測(cè)序結(jié)果于NCBI網(wǎng)站上用BLAST軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，初步判斷病原菌的種屬歸類(lèi)，利用MEGA 6.0的鄰接法（Neighborjoining，NJ）分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并將菌株FJAT-46819和FJAT-47134的16S rDNA基 因 序 列 上 傳至NCBI，NCBI號(hào)分別為MW 512876和MW 512877。1.4.4 MALDI-TOF-MS測(cè)定病原菌于LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48 h后，挑選單個(gè)菌落并將其重懸于無(wú)菌水中，加入乙醇后，通過(guò)乙腈/甲酸法提取蛋白質(zhì)。利用Bruker Daltonik UltrafleXtreme MALDITOF系統(tǒng) 采集蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。取1μL蛋白質(zhì)提取物點(diǎn)到鋼靶板上，放干后點(diǎn)上1μL的α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)溶液。利用FlexControl軟件（版本3.4）以自動(dòng)模式以隨機(jī)采樣模式采集光譜數(shù)據(jù)：采集模式，線性正離子；質(zhì)量范圍，2～20 kDa；氮激光波長(zhǎng)，335 nm；激光頻率，2000 Hz；加速電壓，25 kV。應(yīng)用BioTyper分析軟件對(duì)所獲取的質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，通過(guò)匹配值的大小對(duì)細(xì)菌種類(lèi)鑒定結(jié)果進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄細(xì)菌性病害的田間癥狀

植株發(fā)病初期萎蔫，似青枯病癥狀，后期葉片枯死（圖1-a），莖部表面初期黃褐色，后期顏色加深，從發(fā)病部位向四周擴(kuò)散，莖部剖面可見(jiàn)維管束褐變，髓部組織腐爛、空心（圖1-b、c）。根據(jù)發(fā)病癥狀初步診斷為番茄細(xì)菌性病害。

圖1 田間番茄細(xì)菌病害癥狀Fig.1 Sym p tom s of tomato bacterial pith necrosisdiseases in the field

2.2 病原菌分離與培養(yǎng)特性

從不同病組織上分離純化出菌落形態(tài)一致的菌落，選擇2株代表性菌株FJAT-46819和FJAT-47134進(jìn)行后續(xù)研究。菌落呈橢圓形、平滑均勻，乳白色（圖2）。革蘭氏染色觀察表明2株菌株均呈革蘭氏陰性，菌體在透射電鏡中呈橢圓形至短桿狀，大小為1.42（1.02～1.58）μm×0.81（0.74～0.88）μm，無(wú)芽孢。

圖2 病菌形態(tài)Fig.2 M orphological characteristics of bacterial isolates

2.3 病原菌致病力測(cè)定

將代表性菌株FJAT-46819和FJAT-47134回接到健康番茄盆栽苗上，結(jié)果表明：空白對(duì)照組番茄植株無(wú)發(fā)病癥狀；處理組1（采用分叉枝切除傷口接種）番茄植株，接種7 d后接種口周?chē)M織褐變（圖3-a），接種17～20 d時(shí)整株萎蔫枯死，與田間番茄髓部壞死病病癥一致（圖3-b）。處理組2（采用浸根接種病原菌）番茄植株無(wú)發(fā)病癥狀；從發(fā)病植株重新分離病原菌，其形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀與接種菌株一致。根據(jù)柯赫氏法則，初步判斷接種上述2株病原菌對(duì)番茄具有較強(qiáng)的致病性，侵染番茄植株后都能引發(fā)番茄髓部壞死病。

圖3 室內(nèi)病菌回接番茄植株的髓壞死病癥狀Fig.3 Sym ptom sof bacterial pith necrosison inocu lated tom ato p lants in greenhouse

2.4 病原菌的Biolog分析

病原菌FJAT-46819和FJAT-47134的biolog鑒定結(jié)果和系統(tǒng)參數(shù)如表1所示。根據(jù)Biolog系統(tǒng)規(guī)定[14]，當(dāng)SIM值＞0.75時(shí)，鑒定的種名結(jié)果可靠；當(dāng)SIM值小于0.75或0.5時(shí)，鑒定的屬名可靠。本研究中2個(gè)菌株FJAT-46819和FJAT-47134的SIM均小于0.75，因此2個(gè)菌株FJAT-46819和FJAT-47134均鑒定為腸桿菌屬（Enterobacterspp.）菌株。

表1 Biolog分析結(jié)果Table 1 Results of biology analysis

2.5 病原菌的分子鑒定

菌 株FJAT-46819（MW 512876）和FJAT-47134（MW 512877）的16SrDNA序 列 分 別 為1403 bp和1407 bp。經(jīng)BLAST分析，這2株菌的16S rDNA序列與腸桿菌屬（Enterobacter）的序列同源性較高。圖4為利用MEGA 6.0軟件的NJ法建立的腸桿菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示，菌株FJAT-46819和FJAT-47134與 阿 氏 腸 桿 菌（Enterobacter asburiaeATCC 35953T）16S rDNA序列聚在一起，它們的同源性最高。

圖4 菌株FJAT-46819和FJAT-47134的16 S rDNA基因進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic tree based on partial 16S rDNA gene sequencesof FJAT-46819 and FJAT-47134

2.6 病原菌的質(zhì)譜鑒定

利 用MALDI-TOF-MS采 集 菌 株FJAT-46819和FJAT-47134的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，生成肽指紋圖譜，與數(shù)據(jù)庫(kù)中微生物進(jìn)行檢索匹配，結(jié)果如表2所示，菌株FJAT-46819和FJAT-47134與數(shù)據(jù)庫(kù)中的阿氏腸桿菌匹配值分布于2.3～3.0。因此，將這2株菌鑒定為阿氏腸桿菌，該鑒定結(jié)果與分子鑒定結(jié)果一致，且2株菌的可信度分值差異小于0.1，說(shuō)明它們的相似度極高。

表2菌株FJAT-46819和FJAT-47134的MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果Table 2 Results of MALDI-TOF-MS analysis on FJAT-46819 and FJAT-47134

3 討論與結(jié)論

番茄細(xì)菌性髓部壞死病是2017–2019年發(fā)生于福建和浙江種植的大棚番茄上的病害。通過(guò)對(duì)發(fā)生該病的病株莖部病健交接處病菌分離、16S rDNA分子鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析及MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定、致病性測(cè)定等系列試驗(yàn)，確定引起福建和浙江大棚番茄髓部壞死病的病原菌為腸桿菌屬的阿氏腸桿菌（E.asburiae）。這是在番茄上發(fā)現(xiàn)的一種新病害，還未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道。

腸桿菌屬包括21個(gè)種與2個(gè)亞種，廣泛存在于自然界中，在嬰幼兒配方奶、臨床標(biāo)本、植物等材料中均可檢出。與植物有關(guān)的腸桿菌包括阿氏腸桿菌、生癌腸桿菌（E.cancerogenus）、陰溝腸桿菌（E.cloacae）、陰溝腸桿菌溶解亞種（E.cloacae subsp.dissolvens）、溶解腸桿菌（E.dissolvens）、中間 腸 桿 菌（E.intermedius）、超 壓 腸 桿 菌（E.nimipressuralis）、水稻腸桿菌（E.oryzae）、梨形腸桿菌（E. pyrinus）、桑腸桿菌（E.mori）、阪崎腸桿菌（E. sakazakii）、E.radicincitans、E.ludwigii等[15?17]。一些腸桿菌屬菌株則會(huì)侵染植物引起寄主發(fā)病，但宿主范圍很狹窄，傾向于侵染木本植物。研究報(bào)道，可引起植物致病的腸桿菌屬菌株主要有以下8個(gè)種：引起白楊樹(shù)潰瘍病的生癌腸桿菌，導(dǎo)致玉米稈腐敗病的溶解腸桿菌，引起榆樹(shù)濕心病的超壓腸桿菌，引起梨樹(shù)葉片褐斑病的梨形腸桿菌，引起木瓜果實(shí)黃化病的阪崎腸桿菌，引起多種作物（椰子萎蔫病、榆樹(shù)濕心病、番木瓜果肉黃化病、洋蔥腐爛病、生姜莖腐病、夏威夷果灰果仁病、桑樹(shù)和辣椒枯萎落葉性?。┎『Φ年帨夏c桿菌，桑樹(shù)枯萎落葉性病害的阿氏腸桿菌和桑腸桿菌等[16,18?25]。腸桿菌屬通過(guò)分泌一些化學(xué)物質(zhì)使宿主植物發(fā)病，但不同的菌株其致病機(jī)理不一樣[26]。

阿氏腸桿菌是一類(lèi)革蘭氏陰性、周生鞭毛、厭氧發(fā)酵型桿狀細(xì)菌，具有腸桿菌的普遍特征。腸桿菌屬菌株具有豐富的種群和基因遺傳多態(tài)性，菌株的多態(tài)性與菌株來(lái)源有關(guān)，但是菌株的遺傳結(jié)構(gòu)和致病力與多態(tài)性不存在相關(guān)性[25]。目前，由阿氏腸桿菌引起的植物細(xì)菌性病害僅在桑樹(shù)上被發(fā)現(xiàn)[25,27]，該病原菌引起桑樹(shù)葉片黃化、枯萎、落葉和枝條頂端壞死，使植株產(chǎn)生枯萎和維管束褐變癥狀。本研究在番茄上發(fā)現(xiàn)阿氏腸桿菌會(huì)引起番茄細(xì)菌性髓部壞死病，其引發(fā)番茄發(fā)病的機(jī)理還不清楚，有待于進(jìn)一步研究。目前該病只在福建和浙江有發(fā)現(xiàn)，其他省區(qū)是否發(fā)生尚不清楚。因此，應(yīng)嚴(yán)格監(jiān)控阿氏腸桿菌的動(dòng)態(tài)，控制病害的傳播蔓延，對(duì)保證我國(guó)番茄安全生產(chǎn)具有重要現(xiàn)實(shí)意義。