茶樹MYC轉(zhuǎn)錄因子家族的全基因組鑒定及表達(dá)分析

鄭玉成，谷夢雅，畢婉君，胡清財，王鵬杰，葉乃興，孫 云

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點實驗室，福建 福州350002）

0 引言

【研究意義】茶Camellia sinensis（L.）O.Kuntze是重要的經(jīng)濟(jì)作物，以其獨特的風(fēng)味而聞名。前人研究表明，茉莉酸在茶葉加工過程中香氣的形成起到了重要作用[1]。髓細(xì)胞組織增生蛋白（Myelocytomatosis proteins，MYC）是植物茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要轉(zhuǎn)錄因子。因此，對茶樹MYC家族進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析，預(yù)測各成員潛在功能，研究其在不同組織及不同脅迫處理下的表達(dá)模式，對茶葉品質(zhì)的改善具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】MYC轉(zhuǎn)錄因子是bHLH家族成員中的一個亞族，具有bHLH和bHLH_MYC_N兩個十分保守的結(jié)構(gòu)域?？膳cG-box（CACGTG）順式作用元件結(jié)合并與其突變體（5′-CACATG-3′、5′-CAC-GTG-3′）表現(xiàn)出較高親和性[2]。前人研究表明，MYC轉(zhuǎn)錄因子作為轉(zhuǎn)錄激活因子在茉莉酸觸發(fā)的級聯(lián)信號反應(yīng)中起重要作用[3]。正常條件下，植物體內(nèi)茉莉酸保持在相對較低的水平，Jasmonate ZIM-domain（JAZ）抑制子與MYC2相互結(jié)合并抑制下游脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)[4]。當(dāng)植物響應(yīng)損傷脅迫或生物脅迫時，植物細(xì)胞中會大量積累茉莉酸，并被COI1感知。隨后，JAZ蛋白被COI1介導(dǎo)的E3泛素化降解從而釋放MYC轉(zhuǎn)錄因子，激活下游茉莉酸（Jasmonic acid，JA）響應(yīng)基因的表達(dá)[5]。另外，擬南芥中AtMYC3與AtMYC4被發(fā)現(xiàn)可與AtMYC2形成同源和異源二聚體來結(jié)合G-box元件參與茉莉酸信號調(diào)控[6]。大量研究發(fā)現(xiàn)，MYC轉(zhuǎn)錄因子還參與了茉莉酸與其他植物激素的串?dāng)_網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)植物生命活動。在擬南芥中，MYC2可與Ethylene-insensitive3（EIN3）相互作用，抑制JA的傷口反應(yīng)及草食誘導(dǎo)基因表達(dá)，調(diào)節(jié)茉莉酸和乙烯信號的拮抗作用。MYC2同樣也可以作為脫落酸依賴性干旱的轉(zhuǎn)錄激活因子，并且是水楊酸依賴性防御所必需的[7]。除了參與茉莉酸信號通路，MYC轉(zhuǎn)錄因子也廣泛參與了植物葉片衰老、根毛發(fā)育等生命活動及花青素、芥子油苷、和萜類等次級代謝物的合成[8–10]。擬南芥AtMYC1基因參與調(diào)控種子萌發(fā)[11]；水稻OsMYC2與櫻花素的生物合成密切相關(guān)，在MEP萜類合成途徑中，4個合成異戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）基因受到OsMYC2調(diào)控[12–13]；在玉米中，ZmMYC7在抵抗禾谷鐮孢和玉米大斑剛毛座腔菌的侵染中起到了關(guān)鍵作用[14]；煙草NtMYC2可參與尼古丁及相關(guān)生物堿合成；長春花Catharanthus roseusCrMYC2可有效激活A(yù)P2/ERF結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子ORCA3的表達(dá)，參與長春花萜類化合物的合成[9]。目前，該家族已經(jīng)在擬南芥、水稻、紅豆杉、玉米等多個物種中被鑒定。【本研究切入點】茶產(chǎn)品的獨特風(fēng)味依賴于其豐富的次級代謝產(chǎn)物。植物MYC家族廣泛參與植物生長發(fā)育和次級代謝合成，但有關(guān)植物MYC基因家族的研究主要集中在模式植物中，在茶樹中進(jìn)行全基因組范圍內(nèi)的鑒定及初步預(yù)測MYC各成員的潛在功能還鮮有報道。另外，隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，高質(zhì)量茶樹基因組的發(fā)布為本研究提供基礎(chǔ)[15]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用生物信息學(xué)手段鑒定茶樹MYC基因家族所有成員，系統(tǒng)分析了該家族成員的基本結(jié)構(gòu)特點，利用前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及qRT-PCR技術(shù)研究在不同組織、不同脅迫處理下的表達(dá)情況，為進(jìn)一步探明茶樹MYC各成員功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗于2020年3～11月在福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院茶學(xué)重點實驗室進(jìn)行。

1.1 供試材料

2年生鐵觀音（C. sinensiscv.Tieguanyin）以相同的栽種條件（盆栽土培）種植在福建農(nóng)林大學(xué)試驗基地，選取長勢良好、生長一致的茶樹植株分別進(jìn)行下述處理：

干旱脅迫：將茶樹從盆土中取出，用純水將根部土壤沖凈后，迅速置入10%（m/V）PEG-6000溶液中。

低溫脅迫：將在正常溫度（24±2℃）下生長的茶樹植株連盆轉(zhuǎn)移至4℃的生長室。

脫落酸（ABA）及茉莉酸甲酯（MeJA）處理：用新鮮制備的100μmol·L?1ABA和MeJA分別噴灑不同茶樹植株葉片。

收集以上處理后6 h的一芽二葉（無病害）及未處理的葉片（對照），每個處理3次重復(fù)，包入錫箔紙后，迅速置于液氮中固樣，?80℃冷凍保存，用于后續(xù)RNA提取。

1.2 茶樹MYC基因家族成員鑒定

為了準(zhǔn)確鑒定所有的茶樹MYC成員，結(jié)合使用Blast比對和HMMER搜索兩種方法。從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫下載所有AtMYC成員氨基酸序列作為誘餌，在茶樹基因組網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對（http://pcsb.ahau.edu.cn，BLASTP，E value≤1×10?5）[15]；從Pfam數(shù)據(jù)庫中下載MYC蛋白的隱馬爾可夫模型（Pfam accessions:PF14215 and PF00010，http://pfam.xfam.org/），并利用HMMER 3.0在茶樹蛋白數(shù)據(jù)集中搜索潛在MYC序列（Hmmsearch, E value≤1×10?5）[16]。最后，使用CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）網(wǎng)站進(jìn)一步確認(rèn)鑒定到的潛在MYC基因是否具有完整的bHLH和bHLH_MYC_N保守結(jié)構(gòu)域。

1.3 染色體定位及共線性分析

使用互惠Blast將草圖中的基因與染色體級別的基因進(jìn)行一一比對以獲得相應(yīng)的染色體位置信息。茶樹染色體位置信息在茶樹基因組數(shù)據(jù)庫下載，使用在線網(wǎng)站MG2C（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）繪制CsMYC基因家族染色體位置信息圖；利用TBtools軟件進(jìn)行MYC基因共線性分析，其中葡萄基因組數(shù)據(jù)下載自ensembl數(shù)據(jù)庫（http://plants.ensembl.org/index.htm l）。

1.4 多序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

使用R包ggmsa進(jìn)行多序列比對分析；使用ggtree構(gòu)建茶樹CsMYC系統(tǒng)進(jìn)化樹，建樹方法為鄰接法（NJ），boostrap值設(shè)定為1 000重復(fù)。數(shù)據(jù)來源方面，水稻MYC家族成員蛋白序列來自網(wǎng)站TIGR（http://www.tigr.org/tdb/e2k1/），擬 南 芥MYC家 族成員蛋白序列來自網(wǎng)站TIAR（http://www.arabidopsis.org/），云杉MYC家族成員蛋白序列來自網(wǎng)站NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），其余物種MYC家族成員蛋白序列均下載自JGI（http://genome.jgi-psf.org/）。

1.5 CsMYC基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析

從茶樹基因組網(wǎng)站（http://tpdb.shengxin.ren/）下載茶樹基因組注釋文件，使用MEME在線網(wǎng)站（http://meme-suite.org/tools/meme）對茶樹CsMYC進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。使用TBtools軟件進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域可視化。

1.6 茶樹CsMYC基因激素處理、干旱脅迫及組織特異性表達(dá)分析

根據(jù)實驗室前期的方法[17]，從SRA（Sequence read archive）網(wǎng)站下載茶樹8個組織原始RNA-seq數(shù)據(jù)（登錄號：PRJNA381277），使用TopHat2[18]將質(zhì)控后的數(shù)據(jù)比對到茶樹基因組，使用HTseq[19]軟件計算基因FPKM值。從茶樹基因組網(wǎng)站（http://tpdb.shengxin.ren/）下載茉莉酸甲酯及冷脅迫處理后的茶樹葉片表達(dá)譜。使用TBtools軟件進(jìn)行熱圖繪制。

1.7 實時熒光定量PCR分析

使用天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取上述試驗樣總RNA，使用全式金Easyscript One-step gDNA Removaland cDNA synthesis superM ix試劑盒合成cDNA用于實時熒光定量PCR。茶樹MYC家族成員引物設(shè)計在primer3plus網(wǎng)站上進(jìn)行（表1）。qRTPCR反應(yīng)在CFX 96 Touch熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系參照Transstart?Tip green qPCR superM ix試劑盒方法，反應(yīng)程序為94℃30 s；94℃5 s；60℃30 s；40個循環(huán)。使用2?△△Ct方法計算基因相對表達(dá)量[20]，并使用TBtools進(jìn)行熱圖繪制。內(nèi)參基因CsGAPDH登錄號為GE651107。

1.8 茶樹CsMYC成員潛在功能預(yù)測分析

為了進(jìn)一步預(yù)測茶樹MYC各成員的功能，使用茶樹茉莉酸甲酯處理后茶樹葉片表達(dá)譜數(shù)據(jù)（下載自茶樹基因組網(wǎng)站，http://tpdb.shengxin.ren/），提取出CsMYC成員在處理后各時期的FPKM值，使用R包corrplot計算MYC各成員與其他所有基因的皮爾森相關(guān)系數(shù)及P值，默認(rèn)相關(guān)性r≥±0.9且P≤0.05的基因與MYC有潛在調(diào)控關(guān)系。使用ClusterProfil包對與MYC各成員有潛在調(diào)控關(guān)系的基因集進(jìn)行KEGG富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsMYC家族成員的鑒定

為了全面鑒定茶樹中所有的MYC家族成員，結(jié)合使用BlsatP比對和Hmmsearch搜索兩種方法，手動刪除冗余序列后，將鑒定到的所有潛在茶樹MYC成員提交到CDD和SMART網(wǎng)站再次驗證是否具有完整的保守結(jié)構(gòu)域。最后，在茶樹基因組中總共鑒定得到9個MYC家族成員，分別命名為CsMYC1～CsMYC9（表2）。CsMYCs的ORF氨基酸長度為442～1 003 aa，分子量為49.39（CsMYC9）～110.27 kDa（CsMYC5）。對茶樹MYC家族的理論等電點及親水性平均水平進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，所有成員理論等電點小于7，親水性平均水平小于0，說明茶數(shù)MYC家族成員均為酸性親水蛋白。對MYC家族成員的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CsMYC家族成員主要定位在細(xì)胞核中。

表1茶樹CsMYC家族成員引物序列Table1 Primer sequence of CsMYC s in tea p lant

表2 茶樹CsMYC家族成員特征Table 2 Information on CsMYC in tea plant

2.2 CsMYC成員的系統(tǒng)發(fā)育和分類分析

為了解MYC蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系，來自7個典型物種的53個MYC蛋白被用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，包括小立碗蘚Physcomitrella patens（苔蘚類植物）、中華卷柏Selaginella moellendorffii（蕨類植物）、云杉Picea sitchensis（裸子植物）、水稻Oryza sativa和高粱Sorghum bicolor（單子葉植物）以及擬南芥Arabidopsis thaliana和茶樹Camellia sinensis（雙子葉植物）（圖1）。值得注意的是，在對幾個典型的藻類（紅藻類、綠藻類及褐藻類）進(jìn)行MYC同源基因鑒定時，并未發(fā)現(xiàn)MYC成員，說明MYC家族可能起源于陸生植物。進(jìn)化樹結(jié)果顯示，MYC家族總共可以被分為8個保守亞家族（a～h）。其中，a與g亞族只包含苔蘚類植物，b亞族只包含卷柏類植物，說明MYC在陸生植物進(jìn)化過程中，苔蘚類與卷柏類植物各自形成特有的亞族。茶樹MYC成員主要分布在3個亞家族中（e、f和h），這3個亞家族中只包含種子植物，推測茶樹MYC成員與較古老的苔蘚類植物與蕨類植物產(chǎn)生明顯的功能分化。前人研究表明，f亞族中的A tMYC2、AtMYC3和AtMYC4以及e亞族中的AtMYC10（bHlH14）功能冗余參與到茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中[5]，表明該亞族中的茶樹MYC家族成員CsMYC2、5以及CsMYC1、6、9可能在茶樹中行使相似功能。

圖1 MYC家族系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of MYC fam ily

2.3 CsMYC成員的結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

為了更好地了解茶樹MYC家族成員之間的結(jié)構(gòu)多樣性，分析CsMYC各成員的外顯子、內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，保守結(jié)構(gòu)域分布情況以及構(gòu)建CsMYC成員之間的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖2-a所示，CsMYC成員之間自然地分為2個亞組（Ⅰ～Ⅱ），其中CsMYC2、5、1、6、9被歸為Ⅱ亞組。同時，發(fā)現(xiàn)Ⅰ亞組與Ⅱ亞組之間9號模體的所在位置出現(xiàn)了漂移。另外，CsMYC6、9上丟失了7號模體。CsMYC2、5、6、9上發(fā)現(xiàn)了可能發(fā)揮功能的潛在模體。以上結(jié)果表明，茶樹MYC在進(jìn)化過程中模體出現(xiàn)了漂移和丟失，這可能是導(dǎo)致茶樹MYC家族功能分化的重要原因。對茶樹CsMYC家族基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)（圖2-b），CsMYCs基因結(jié)構(gòu)較為簡單，只含有1～3個內(nèi)含子。另外，對CsMYC家族成員的保守結(jié)構(gòu)域蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)（圖2-c），CsMYCs具有保守bHLH和bHLH_MYC_N兩個結(jié)構(gòu)域。其中，bHLH結(jié)構(gòu)中含有高度保守的H4-V5-E8-R9-R11-R13序列，其中第9位和第11位精氨酸是與E-box（CANNTG）或G-box（CACGTG）結(jié)合的必需位點。

2.4 CsMYC染色體定位及共線性分析

全基因組加倍事件和基因串聯(lián)重復(fù)事件是基因家族成員加倍的主要方式[21]。CsMYCs家族成員分布在5條染色體上，其中12號染色體上的3個成員和13號染色體上的兩個成員距離均大于1 M，說明CsMYC家族成員不存在基因串聯(lián)重復(fù)事件（圖3-a）。對茶樹MYC家族成員與葡萄（雙子葉）、水稻（單子葉）的種間進(jìn)行共線性分析（圖3-b）。結(jié)果顯示，茶樹中有8個MYC成員與葡萄中4個基因存在共線性，表明茶樹與單子葉植物葡萄的分化時間較短，MYC成員在功能上也更為相似。

圖3 CsMYC成員染色體定位及共線性分析。Fig.3 Chromosom e location and collinearity analysis of CsMYC s

2.5 CsMYC成員在茶樹不同組織中的表達(dá)分析

為了更好了解CsMYC基因各成員在茶樹生長發(fā)育中的潛在作用，下載8種具有代表性的茶樹組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以研究其不同表達(dá)模式。如圖4所示，除了CsMYC2和CsMYC9外，其他成員在芽和葉中表達(dá)量較高（FPKM＞10），推測CsMYC家族成員在茶樹芽葉發(fā)育中發(fā)揮重要作用。另外，CsMYC各成員在不同組織中也顯示出特異表達(dá)模式，CsMYC1在成熟葉和莖中有較高表達(dá)；CsMYC7在莖中有較高表達(dá)；CsMYC4、5和8在花中顯著表達(dá)；CsMYC2和CsMYC3在老葉中轉(zhuǎn)錄水平顯著增加。同時，CsMYC2在花中被顯著抑制表達(dá)，CsMYC4在茶樹老葉和果實中被顯著抑制。以上結(jié)果顯示，茶樹MYC各成員在茶樹的生長發(fā)育過程中發(fā)揮不同的作用。

圖4 CsMYC基因在8個代表性茶樹組織中的表達(dá)模式熱圖Fig.4 CsMYC expression patterns in 8 rep resentative tea p lant tissues

2.6 CsMYC家族響應(yīng)非生物脅迫處理的表達(dá)分析

為了初步了解CsMYC基因家族成員對非生物脅迫的響應(yīng)模式，利用q-RT-PCR技術(shù)測定了包括低溫處理（4℃）、干旱處理（PEG）、赤霉素和茉莉酸處理下所有CsMYC成員的相對表達(dá)量。如圖5所示，所有MYC成員在茉莉酸處理后的6 h，均明顯上調(diào)表達(dá)（倍數(shù)變化＞2）。在低溫處理下，CsMYC4、CsMYC5和CsMYC7的轉(zhuǎn)錄水平明顯提高，而CsMYC6被抑制表達(dá)。在干旱處理6 h后，CsMYC2、CsMYC3和CsMYC9轉(zhuǎn)錄本數(shù)量明顯增加，說明這3個成員可能參與茶樹干旱脅迫響應(yīng)。在赤霉素處理后，CsMYC2、CsMYC4和CsMYC7的表達(dá)量明顯提高。以上結(jié)果表明，茶樹MYC各成員在茶樹響應(yīng)非生物脅迫中扮演了重要角色。

圖5 CsMYC基因響應(yīng)非生物脅迫的表達(dá)模式熱圖Fig.5 Expression patterns of CsMYC s in response to abiotic stresses

2.7 CsMYC家族成員功能預(yù)測

利用前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對與CsMYC各成員有潛在調(diào)控關(guān)系的基因集（r≥0.9且P≤0.05）進(jìn)行KEEG富集分析。結(jié)果如圖6所示，發(fā)現(xiàn)MYC各成員廣泛參與到茶樹的次級代謝的生物合成與降解的途徑中。這可能與茉莉酸作為植物的生物與非生物脅迫響應(yīng)信號有關(guān)。一些CsMYC家族成員與茶樹的揮發(fā)性香氣物質(zhì)有關(guān)，例如，與CsMYC8和CsMYC9相關(guān)的基因集被顯著富集到茶樹萜類代謝途徑；而與CsMYC4、CsMYC6和CsMYC9相關(guān)的基因集被顯著富集到茶樹脂肪酸合成代謝途徑。大量研究表明茉莉酸作為茶葉加工過程中損傷脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，表明這些CsMYC成員可能參與了茶樹加工過程中的香氣形成[1]。CsMYC1、CsMYC4和CsMYC7和茶樹脅迫響應(yīng)下的黃酮生物合成有關(guān)；CsMYC1、CsMYC3、CsMYC5和CsMYC8則和茶樹脅迫響應(yīng)下的光合作用有關(guān)。同時，我們發(fā)現(xiàn)除CsMYC4和CsMYC2外，其余7個成員均與茶樹的氨基酸合成代謝有關(guān)，預(yù)示氨基酸在茶樹響應(yīng)脅迫中發(fā)揮了重要作用。

圖6 CsMYC成員潛在調(diào)控基因集的KEGG富集分析Fig. 6 KEGG enrichment analysison gene clusters w ith potential role in regulatory function relating to CsMYC

3 討論

前期大量研究表明，MYC蛋白廣泛參與了植物生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)，并在水楊酸與茉莉酸、乙烯與茉莉酸、生長素與茉莉酸的串?dāng)_網(wǎng)絡(luò)（Crosstalk）中發(fā)揮了重要作用[22]。目前，已經(jīng)在草莓中鑒定到2個MYC成員[23]，水稻和短柄草中鑒定到7個MYC成員[24]，玉米中鑒定到8個MYC成員[25]。然而，有關(guān)茶樹MYC家族成員數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能卻了解較少。本研究基于茶樹基因組數(shù)據(jù)，總共鑒定到了9個CsMYC成員。

3.1 茶樹MYC家族的進(jìn)化

內(nèi)含子和外顯子可以通過獲得或丟失（gain/loss）和插入或刪除（insertion/deletions）在基因家族的多樣性和進(jìn)化中扮演了重要的角色[26]。前人研究表明，MYC家族成員經(jīng)歷了兩次內(nèi)含子丟失事件，一次是蕨類和苔蘚類植（6～13個內(nèi)含子）到種子植物，另一次是種子植物自身發(fā)生內(nèi)含子丟失事件（0～3和3～6個內(nèi)含子）[27]。在本研究中，茶樹MYC成員數(shù)量介于0～3個內(nèi)含子，說明茶樹MYC成員在進(jìn)化過程中可能經(jīng)歷了兩次內(nèi)含子丟失事件。最新研究認(rèn)為基因中較少的內(nèi)含子可以使植物更快速地應(yīng)對環(huán)境變化[28]。因此，作為茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，MYC基因家族成員內(nèi)含子丟失事件是茶樹MYC家族進(jìn)化的有效機(jī)制，可能使茶樹可以更快速響應(yīng)環(huán)境脅迫。

與前人研究結(jié)果相似，在對藻類基因組進(jìn)行檢索時，并未發(fā)現(xiàn)MYC家族成員[27]，說明MYC家族可能起源于陸生植物。使用鄰接法對53個MYC成員構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示了一些具有譜系特異性（Lineage-specific）的MYC亞組。如，a與b亞組中只包含了小立碗蘚MYC家族成員；b亞組中只包含了卷柏MYC家族成員；e亞組中只包含了雙子葉植物（茶樹與擬南芥）；f亞組中只包含了種子植物。表明MYC家族可能在陸地植物基因組中經(jīng)歷了譜系特異性分化事件。對于茶樹MYC成員，CsMYC1、CsMYC6和CsMYC9與雙子葉植物直接聚為一類；CsMYC3、CsMYC4、CsMYC7和CsMYC8直接與被子植物聚為一類；CsMYC2和CsMYC5與種子植物直接聚為一類。以上結(jié)果表明，在漫長的進(jìn)化過程中，茶樹MYC家族成員可能經(jīng)歷了全基因組復(fù)制事件。

3.2 茶樹MYC家族成員在不同茶樹組織及非生物脅迫中的差異表達(dá)

MYC對植物的生長發(fā)育至關(guān)重要。8個不同茶樹組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示CsMYC家族成員在茶樹的生長發(fā)育過程中起到了不同作用。前人研究表明，擬南芥AtMYC5在調(diào)控植物葉片衰老中起到了重要作用[29]。在本研究中，CsMYC2和CsMYC3在老葉中具有較高的表達(dá)水平。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，CsMYC3與AtMYC5被歸為同一個亞族。以上結(jié)果顯示CsMYC2和CsMYC3可能參與了茶樹葉片衰老的過程。另外，植物MYC轉(zhuǎn)錄因子也參與了根生長、毛狀體萌生及花發(fā)育等過程[30?31]。通過茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明，大部分CsMYC成員在茶樹嫩芽葉中的表達(dá)水平極高；CsMYC4、5和8的轉(zhuǎn)錄本水平在茶樹花中顯著積累；CsMYC8在茶樹根中表現(xiàn)出較高水平的表達(dá)量。結(jié)果表明CsMYC各成員協(xié)同或特異性參與了茶樹的生長發(fā)育過程。

MYC作為茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)非生物脅迫中同樣發(fā)揮了重要作用。據(jù)報道，擬南芥兩個MYC成員可以與ICE1相互作用以調(diào)控擬南芥的耐寒性[32]。玉米兩個MYC成員ZmbHLH103和ZmbHLH104在干旱脅迫下顯著上調(diào)[33]。熒光定量結(jié)果顯示，所有CsMYC成員均響應(yīng)茉莉酸處理；CsMYC2、CsMYC3和CsMYC9明顯響應(yīng)干旱脅迫處理；CsMYC4、CsMYC5和CsMYC7響應(yīng)低溫處理。預(yù)示茶樹MYC家族成員同樣參與到茶樹的各種非生物脅迫響應(yīng)中。

3.3 茶樹MYC成員的潛在功能

MYC可以通過調(diào)控植物各種次級代謝物的生成來響應(yīng)生物或非生物脅迫。擬南芥MYC3和MYC4參與了黃酮化合物的調(diào)控[8]。在水稻黃酮合成途徑中，?；o酶A合成酶OsACS、查爾酮合成酶OsCHS及查爾酮異構(gòu)酶OsCHI可由OsMYC2激活并顯著提高黃酮類化合物的積累[13]。另外，水稻芳樟醇合成酶AtLIS、倍半萜合成酶同樣可以通過OsMYC2由JA上調(diào)，調(diào)控水稻萜類化合物的合成[12]。最近的研究表明，水稻OsMYC2與擬南芥AtMYC2具有相似的功能，都可以增強(qiáng)整個JA合成途徑來進(jìn)一步放大JA信號，如激活脂氧合酶LOX及脂肪酸氫過氧化物裂解酶HPL的表達(dá)[34]。本研究中，通過使用皮爾森相關(guān)系數(shù)對與茶樹各CsMYC成員有顯著相關(guān)性的基因集進(jìn)行KEGG富集分析。結(jié)果顯示，茶樹MYC家族成員主要涉及了茶樹的次級代謝過程及植物光合作用相關(guān)通路。例如，與茶樹CsMYC4、6、8、9顯著相關(guān)的基因集被顯著富集到揮發(fā)物相關(guān)通路；與CsMYC1、4和7顯著相關(guān)的基因集被顯著富集到黃酮合成相關(guān)通路。這預(yù)示著以上茶樹MYC成員可能與茶樹脅迫響應(yīng)下次級代謝物的生成有關(guān)。在逆境脅迫下，植物可以通過提高體內(nèi)氨基酸含量及光合速率來提高植物對逆境的適應(yīng)性。如通過提高植物體內(nèi)脯氨酸含量可以增強(qiáng)對鹽脅迫的適應(yīng)性[35]；組氨酸被發(fā)現(xiàn)與植物抵抗重金屬有關(guān)[36]。在逆境脅迫下，植物通過提高光合速率加速能量的貯存，有助于減少逆境對植物的傷害。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)除CsMYC4和CsMYC2外，其余7個成員均與茶樹在茉莉酸脅迫下的氨基酸合成代謝有關(guān)；CsMYC1、3、5和8與茶樹光合作用相關(guān)通路顯著相關(guān)。以上結(jié)果表明，在逆境脅迫下，茉莉酸信號可能通過MYC來改變茶樹體內(nèi)氨基酸含量及光合效率，從而提高逆境脅迫下茶樹的適應(yīng)性。在今后的研究中，將重點關(guān)注CsMYC4、6、8、9這4個潛在參與茶樹揮發(fā)物形成的候選成員，并進(jìn)一步探究這些MYC成員在烏龍茶搖青過程中揮發(fā)性香氣組分的形成的作用。

4 結(jié)論

本研究在茶樹中總共鑒定到9個CsMYC家族成員，可分為3個亞族，每個成員均具有保守的bHLH和bHLH_MYC_N結(jié)構(gòu)域；9個成員不均等分布在5條染色體上；各成員可能發(fā)生了內(nèi)含子丟失事件，CsMYC具有組織表達(dá)特異性且在響應(yīng)茶樹茉莉酸等非生物脅迫中發(fā)揮了重要作用。另外，在今后的研究中，我們將重點關(guān)注CsMYC4、6、8、9這4個潛在參與茶樹揮發(fā)物形成的候選成員，并進(jìn)一步探究這些MYC成員在烏龍茶搖青過程中揮發(fā)性香氣組分的形成的作用。