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    ZmCOL3基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)及功能的生物信息學分析

    2022-01-04 07:20:34董柯清王雷立劉青青張嚴玲李安然仝幀翰王翠玲
    福建農(nóng)業(yè)學報 2021年9期
    關(guān)鍵詞:結(jié)構(gòu)域開花元件

    董柯清,王雷立,劉青青,張嚴玲,李安然,仝幀翰,董 哲,王翠玲

    (河南科技大學農(nóng)學院,河南 洛陽471023)

    0 引言

    【研究意義】開花時間是作物重要的農(nóng)藝性狀之一[1],對植物開花時間的調(diào)控是植物繁殖的核心問題[2]。在特定的時間開花是植物由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L的關(guān)鍵步驟,是植物生殖產(chǎn)生后代的重要節(jié)點[3]。玉米(ZeamaysL.)起源于拉丁美洲,是世界主要糧食作物之一,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有極其重要的地位[4]。玉米是短日照作物[5],一些熱帶、亞熱帶玉米品種(系)在非短日照條件下種植時常常出現(xiàn)花期不遇甚至無法進入生殖生長等現(xiàn)象,嚴重限制了玉米育種的進展[6?11]。因此了解玉米的開花調(diào)控機理對于玉米的研究和改良具有十分重要的意義。植物由營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變,與開花基因的表達息息相關(guān)[12]。要清晰玉米開花的分子機理,首先要研究開花調(diào)控基因的作用機制。本研究以與開花相關(guān)的ZmCOL3基因為分析對象,用生物信息學的方法分析其所編碼蛋白的結(jié)構(gòu),預測該基因在玉米開花及其可能參與的調(diào)控網(wǎng)絡,對ZmCOL3基因的潛在功能及其在玉米開花調(diào)控中作用機制的進一步研究具有重要意義。【前人研究進展】在眾多已報道的開花調(diào)控基因中,有一類基因具有多效性,不僅能直接調(diào)控植物早花或晚花,還具有調(diào)控產(chǎn)量及抗逆等生物學功能[13]。由于這類基因都含有CCT結(jié)構(gòu)域,故被稱為CCT 結(jié)構(gòu)域基因[14]。目前已有諸多研究證實CCT基因家族影響植物開花,擬南芥中的開花關(guān)鍵基因CO、TOC1等均屬于CCT基因家族。CCT基因家族的成員較多,目前已知玉米中含有80多個CCT基因家族成員[13],功能也都不盡相同。根據(jù)所含結(jié)構(gòu)域的不同CCT家族可以分為CMF、COL、PRR和TIFY四個亞家族[4],其中COL亞家族成員的結(jié)構(gòu)特征為含有1個CCT結(jié)構(gòu)域和1-2個B-box鋅指結(jié)構(gòu)域[15,16]。COL蛋白是一類植物特異的轉(zhuǎn)錄因子,通常情況下,植物感受光周期誘導的晝夜節(jié)律變化與開花調(diào)控都需要COL蛋白的參與[17,18]。不同COL基因的CCT結(jié)構(gòu)域序列較為保守,B-box結(jié)構(gòu)域的差異比較明顯,CCT結(jié)構(gòu)域約由43個保守的氨基酸組成,一般位于蛋白質(zhì)的C端,是DNA結(jié)合域,具有核定位、核蛋白運輸及調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的功能[19,20],B-box結(jié)構(gòu)域在N端,是蛋白互作的區(qū)域,在COL蛋白與卷曲螺旋蛋白相互作用過程中發(fā)揮重要作用[21,22]。COL3是COL亞家族的一個重要成員,在擬南芥中AtCOL3是光形態(tài)發(fā)生的正向調(diào)節(jié)因子,在COP1酶的下游發(fā)揮作用[23]。水稻中的OsCO3基因含有1個B-box及1個CCT結(jié)構(gòu)域,參與了水稻的光周期開花途徑,是短日照條件下的開花抑制因子[24]。玉米中發(fā)現(xiàn)的ZmCOL3基因是水稻組成型開花抑制因子OsCOL4的同源基因,可以通過調(diào)控ZmCCT基因表達參與玉米光周期途徑,進而調(diào)控玉米的開花期[15,25]?!颈狙芯壳腥朦c】ZmCOL3基因的克隆雖然已經(jīng)完成,但其作為轉(zhuǎn)錄因子應行使的多重功能還未被確定,在生物信息學方面仍有很多值得挖掘的地方,可為該基因的蛋白功能研究提供思路?!緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究用生物信息學方法對玉米ZmCOL3基因編碼的蛋白質(zhì)序列進行了深入分析,獲得了其編碼蛋白的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)以及亞細胞定位的預測結(jié)果,通過同源建模的方法預測ZmCOL3基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu),對ZmCOL3基因的啟動子區(qū)域所包含的順式作用元件進行了分析,利用檢索得到的表達數(shù)據(jù)進行該基因的組織表達分析。本研究預測ZmCOL3基因可能具備的功能,為該基因在玉米開花調(diào)控及其他潛在功能的研究奠定基礎。

    1 材料和方法

    在NCBI網(wǎng)站通過登錄號NP_001147679查詢并下載ZmCOL3基因的序列信息。使用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)進行該基因編碼蛋白序列的理化性質(zhì)分析;使用NCBI的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(CDD-search)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bw rpsb/bw rpsb.cgi)對ZmCOL3的蛋白序列進行保守結(jié)構(gòu)域的查找;在NPS@:HNNsecondarystructureprediction(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.htm l)網(wǎng)站預測該基因編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu);通過SSW ISSMODEL(http://sw issmodel.expasy.org/)中的同源建模預測ZmCOL3基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu);使用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行跨膜結(jié)構(gòu)域預測;在SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽分析;利用Plant-mPLocserver(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi)進行亞細胞定位預測;使用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htm l/)網(wǎng)站進行啟動子的順式作用元件分析;通過MaizeGDB數(shù)據(jù)庫(https://www.maizegdb.org/)檢索獲得ZmCOL3基因在玉米的種子、初生根、節(jié)間、葉、雌穗、和雄穗中的表達數(shù)據(jù),用Excel繪制基因在不同組織中的表達圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 ZmCOL3基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

    使用在線軟件對ZmCOL3基因所編碼蛋白序列進行分析,結(jié)果表明該基因所編碼蛋白的分子式為C1530H2376N452O482S18,相對分子質(zhì)量為35.39 kD,理論等電點為5.04,屬于酸性蛋白;該基因共編碼335個氨基酸,氨基酸組分如圖1所示,含量最高的為A(丙氨酸),共68個,占總體的20.29%,在該蛋白中帶負電荷的氨基酸(Asp+Glu)數(shù)量為51,帶正電荷的氨基酸(Arg+Lys)數(shù)量為34,脂肪族氨基酸指數(shù)為69.04;平均親水性系數(shù)為?0.241,屬于親水性蛋白,不穩(wěn)定系數(shù)為53.72,該蛋白是不穩(wěn)定蛋白。

    2.2 ZmCOL3基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

    使用NCBI的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(CDD-search)對ZmCOL3的氨基酸序列進行保守結(jié)構(gòu)域的查找。如圖2中的結(jié)果顯示,ZmCOL3基因所編碼蛋白含有1個CCT結(jié)構(gòu)域和1個B-box鋅指結(jié)構(gòu)域,證明了其作為CCT基因家族中的COL亞族所含有的蛋白結(jié)構(gòu)特征。

    圖2 Zm COL3蛋白保守結(jié)構(gòu)域的預測Fig.2 Predicted conserved domain of Zm COL3 protein

    2.3 ZmCOL3基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測

    如圖3所示ZmCOL3蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成,含有少量的延伸鏈和β轉(zhuǎn)角。其中占比最大的為無規(guī)則卷曲,有184個氨基酸,占54.93%;其次是α螺旋(108個氨基酸),占32.24%;占比最少的是β轉(zhuǎn)角,僅有9個氨基酸,只在靠近N端和C端的位置有所分布,主要集中在60~70和235~240這2個區(qū)間內(nèi)。

    圖3 Zm COL3蛋白二級結(jié)構(gòu)的預測Fig.3 Predicted secondary structure of Zm COL3 p rotein

    2.4 ZmCOL3基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測

    使用SW ISS-MODEL同源建模的方法進行三級結(jié)構(gòu)預測,結(jié)果如圖4所示。QMEAN值為?0.33,相似度為64.15%,表明該模型與2020年報道的DNA結(jié)合CCT/NF-YB/YC復合物的晶體結(jié)構(gòu)模型[26]相似性較高,并且與前文二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果相符,以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主體形成三級結(jié)構(gòu)。

    圖4 Zm COL3蛋白的三級結(jié)構(gòu)的預測Fig.4 Predicted tertiary structure ofZm COL3 protein

    2.5 ZmCOL3基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽分析

    ZmCOL3基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測結(jié)果如圖5所示,該基因編碼蛋白沒有形成跨膜螺旋,即該蛋白不含有跨膜結(jié)構(gòu)域,且主要分布于細胞膜外,表明該蛋白為非跨膜蛋白。如圖6所示,玉米COL3基因編碼蛋白前70個氨基酸中不存在典型的信號肽趨勢,CS缺陷概率為0,SP(Sec/SPI)概率僅為0.004,相比之下,Other的概率為0.996,表明該基因所編碼蛋白不含有信號肽。

    圖5 Zm COL3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的預測Fig.5 Predicted transm embrane dom ain of Zm COL3 protein

    圖6 Zm COL3蛋白信號肽的預測Fig.6 Predicted signal peptide of ZmCOL3 protein

    2.6 ZmCOL3基因編碼蛋白的亞細胞定位分析

    將獲取的玉米ZmCOL3基因編碼序列提交到PlantmPLoc網(wǎng)站進行亞細胞定位預測,結(jié)果如圖7所示,預測定位在細胞核內(nèi)。而跨膜結(jié)構(gòu)域預測該蛋白為膜外,推測該基因可能在合成后受到某些因子的作用,在細胞核內(nèi)發(fā)揮作用。

    圖7 Zm COL3蛋白的亞細胞定位Fig.7 Subcellular localization of Zm COL3 protein

    2.7 ZmCOL3啟動子順式作用元件分析

    從maize sequence網(wǎng)站獲取ZmCOL3基因ATG上游2300 bp序列,提交到PlantCARE網(wǎng)站進行順式作用元件分析,結(jié)果如表1所示。該基因啟動子除了含有基本的順式作用元件,如TATA-box、CAAT-box等,還含有脫落酸(ABA)響應元件、光響應元件、茉莉酸甲酯(MeJA)響應元件等,表明該基因可能在多重反應調(diào)控網(wǎng)絡中發(fā)揮作用,受到光照和多種激素調(diào)控。

    表1 Zm COL 3啟動子順式作用元件分析Table1 Analysison cisacting elements of Zm COL 3 prom oter

    2.8 ZmCOL3基因在玉米不同組織中的表達

    下載獲得了ZmCOL3基因在玉米的種子、初生根、節(jié)間、葉、雌穗和雄穗6個組織部位中的表達數(shù)據(jù)。分析結(jié)果如圖8所示,ZmCOL3基因在玉米的葉片中表達量最高,雄穗中的表達量次之,在種子中該基因表達量最低,總體上看ZmCOL3基因在葉片中的表達量顯著高于其他組織,其余5個不同組織中的表達量差異較小。

    圖8 ZmCOL3基因在玉米不同組織部位的表達情況Fig.8 Expressions of Zm COL 3 inm aize tissues

    3 討論與結(jié)論

    續(xù)上表

    玉米起源于美洲大陸,在人類的長期馴化和自然選擇下,現(xiàn)今廣泛種植于世界各地,并集糧、飼、經(jīng)三種用途于一體,具有很大的開發(fā)潛力[27]。但由于玉米的光周期敏感性導致熱帶、亞熱帶的玉米種質(zhì)資源在長日照地區(qū)無法正常完成生命周期,限制了現(xiàn)代玉米育種的創(chuàng)新和進步。要改變這一現(xiàn)狀,首先要清晰玉米的開花調(diào)控機制。有研究表明在玉米開花過程中,ZmCOL3的作用主要是通過反式激活調(diào)控玉米開花的關(guān)鍵基因之一ZmCCT的轉(zhuǎn)錄,或者通過干擾生物鐘來抑制玉米開花[4],該基因是玉米開花調(diào)控網(wǎng)絡中不可忽視的一環(huán)。本研究利用生物信息學方法對ZmCOL3基因所編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能進行預測和分析,能進一步挖掘和確認該基因的功能和特點,也為ZmCOL3基因功能的深入研究提供思路。

    對ZmCOL3基因所編碼的蛋白質(zhì)序列進行分析發(fā)現(xiàn)ZmCOL3基因共編碼335個氨基酸,理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示ZmCOL3蛋白相對分子質(zhì)量為35.39 kD,理論等電點為5.04,屬于酸性蛋白,具有親水性和不穩(wěn)定性,沒有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。ZmCOL3蛋白包含2個保守結(jié)構(gòu)域,分別是CCT結(jié)構(gòu)域和B-box鋅指結(jié)構(gòu)域,證明ZmCOL3是CCT家族的成員,具備COL亞族的基本特征。CCT家族基因能影響植物開花,部分基因參與到生物鐘的調(diào)控,ZmCOL3作為該家族成員之一,很可能具備玉米開花調(diào)控的相關(guān)功能,這與金敏亮[15]發(fā)現(xiàn)ZmCOL3是玉米開花抑制子的研究結(jié)果相吻合。亞細胞定位預測該蛋白在細胞核中,這可能是由于ZmCOL3蛋白所含有的CCT結(jié)構(gòu)域具有核定位的功能[28]。該蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲組成,其次是α螺旋,還含有少量的延伸鏈和β轉(zhuǎn)角。通過同源建模對其蛋白三級結(jié)構(gòu)進行預測,QMEAN值為?0.33,同源性高達64.15%。對該基因的啟動子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)其含有光響應元件,這一特點與COL家族基因作為光周期途徑主要調(diào)節(jié)因子的功能相符,同時含有脫落酸(ABA)響應元件、茉莉酸甲酯(MeJA)響應元件等多種激素響應元件,表明該基因可能受到多種激素調(diào)控,暗示其可在多重反應調(diào)控網(wǎng)絡中發(fā)揮作用。ZmCOL3基因在玉米的不同組織中有明顯的差異表達,在玉米的葉片中表達量最高,在種子中該基因表達量最低,該結(jié)果與果天宇等[25]對ZmCOL3啟動子的組織特異性分析結(jié)果存在差異,推測為物種間啟動子片段的置換所造成。

    本文通過生物信息學方法對玉米ZmCOL3基因編碼蛋白的性質(zhì)、亞細胞定位、啟動子順式作用元件及在不同組織間的表達等方面進行分析,可以為后續(xù)研究該基因的功能及參與的調(diào)控通路提供參考。

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