腫瘤蛋白53靶基因1靶向微小RNA-33a對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

李小萌，喬潛林

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占腦 腫瘤的40%～60%［1］。膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖較快、侵襲性較強(qiáng)，雖然神經(jīng)腫瘤學(xué)已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但膠質(zhì)瘤病人預(yù)后較差、死亡率仍然居高不下［2-3］。深入探索膠質(zhì)瘤發(fā)生分子機(jī)制，尋找可靠診斷和治療靶點(diǎn)是當(dāng)前亟待解決的重要問(wèn)題。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNAs）是蛋白編碼功能缺失但長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的RNA，隨著對(duì)lncRNAs和腫瘤相關(guān)性研究的不斷深入，lncRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用被不斷揭示［4］。近年來(lái)研究顯示，在非小細(xì)胞肺癌中腫瘤蛋白53靶基因1（tumor protein 53 target gene 1，TP53TG1）表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)TP53TG1可增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞順鉑敏感性、促進(jìn)細(xì)胞凋亡［5］；在胰腺癌中，TP53TG1表達(dá)上調(diào)，下調(diào)TP53TG1抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］。在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，TP53TG1表達(dá)下調(diào)［7］，但TP53TG1對(duì)膠質(zhì)瘤生物行為的影響及其機(jī)制尚未完全闡明。因此，本研究從2019年1—6月開(kāi)展體外實(shí)驗(yàn)，通過(guò)觀察TP53TG1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性行為的影響，初步探索其分子機(jī)制，以期為基于TP53TG1防治膠質(zhì)瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞HA和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251購(gòu)于上海斯信生物科技有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Promega公司；MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC∕PI試劑盒、TRIzol購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司；Western blotting相關(guān)試劑購(gòu)于生工生物工程有限公司；pcDNA3.1、pcDNA3.1-TP53TG1、TP53TG1的小干擾RNA（si-TP53TG1）、TP53TG1野生型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（WT-TP53TG1）、miRNA模擬物陰性對(duì)照（miR-NC）、miR-33a模 擬 物（mimics）、si-NC和TP53TG1突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（MUTTP53TG1）的構(gòu)建和測(cè)序以及PCR引物均由上海英駿生物公司提供；兔源細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）抗體、兔源細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑（P21）抗體、兔源B細(xì)胞淋巴瘤（Bcl-2）抗體、兔源Bcl相關(guān)x蛋白（Bax）多抗體、兔源基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2）抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）羊抗鼠及羊抗兔抗體購(gòu)于Abcam公司；鼠源E鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體購(gòu)于Santa Cruz公司；Transwell小室和Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)于Corning公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組HA和U251細(xì)胞均采用DMEM培養(yǎng)基（胎牛血清含量為10%）在37℃、含5%二氧化碳、培養(yǎng)箱孵育。將對(duì)數(shù)期U251細(xì) 胞 以2×105個(gè)∕孔 接 種6孔 板，利 用LipofectamineTM2000將pcDNA3.1、pcDNA3.1-TP53TG1分別轉(zhuǎn)染至匯合度為60%的U251細(xì)胞，依次標(biāo)記為pcDNA3.1組、pcDNA3.1-TP53TG1組，培養(yǎng)24～72 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

為驗(yàn)證TP53TG1是通過(guò)調(diào)控miR-33a表達(dá)進(jìn)而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為，把miR-33a mimics分別與pcDNA3.1或pcDNA3.1-TP53TG1共轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞，依次標(biāo)記為pcDNA3.1-TP53TG1+miRNC組和pcDNA3.1-TP53TG1+miR-33a組，檢測(cè)U251細(xì)胞的增殖、遷移侵襲以及凋亡情況。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)用TRIzol試劑分離總RNA。首先合成cDNA模板，再按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。采用2-ΔΔCt法計(jì)算TP53TG1相對(duì)表達(dá)量（GAPDH為內(nèi)參）。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)利用生物信息學(xué)軟件在線(xiàn)預(yù)測(cè)TP53TG1靶基因發(fā)現(xiàn)，TP53TG1與miR-33a存在連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建野生型WT-TP53TG1和突變型MUT-TP53TG1熒光素酶報(bào)告載體，將miR-33a mimics和miR-NC分別與WT-TP53TG1或MUT-TP53TG1同時(shí)轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞，測(cè)定培養(yǎng)48 h后各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力取對(duì)數(shù)期U251細(xì)胞按照2×103個(gè)∕孔接種于96孔板，按照1.2進(jìn)行相應(yīng)處理后，每培養(yǎng)24 h取出一組平板，每孔加入MTT試劑20 μL，孵育4 h后，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，再孵育2 h溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處各孔的OD值。

1.6 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力侵襲實(shí)驗(yàn)：經(jīng)胰酶消化轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×106∕mL。向包被Matrigel基質(zhì)膠的Transwell上室、24孔板下室分別加入200 μL細(xì)胞懸液、500 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，用甲醇固定Transwell膜下表面30 min，0.5%結(jié)晶紫溶液染色10 min。自來(lái)水沖洗去除多余染液，在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照、計(jì)數(shù)，取均值表示細(xì)胞侵襲數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)不用Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室，其余步驟同上。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡加入適量的1×Binding Buffer懸浮轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞使其濃度達(dá)到1×106個(gè)∕mL。向流式管內(nèi)加入100 μL懸液，然后依次加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL的PI，室溫避光孵育15 min，加入PBS液至500 μL，混合均勻后于1 h之內(nèi)用流式細(xì)胞儀評(píng)估細(xì)胞凋亡。

1.8 Western blotting檢測(cè)RIPA裂解法提取總蛋白，取適量蛋白煮沸3 min使其變性。每組用30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，濕法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。Western封閉液阻斷膜，洗膜后，分別加入已稀釋的抗Cyclin D1（1∶500）、P21（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶500）、MMP-2（1∶500）、E-cadherin（1∶500）和GAPDH（1∶2 500）的Ⅰ抗4℃孵育過(guò)夜。再次洗膜后，加入Ⅱ抗稀釋液室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光顯色后拍照，成像掃描分析系統(tǒng)測(cè)定目的條帶相對(duì)于GAPDH的灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，本研究中所有計(jì)量資料均采用±s表示，兩組間比較時(shí)采用t檢驗(yàn)，多組間比較時(shí)采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞HA和U251中TP53TG1的表達(dá)情況與人正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞HA相比，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中TP53TG1的表達(dá)顯著降低，（1.03±0.10）比（0.28±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.551，P＜0.001）。

2.2 過(guò)表達(dá)TP53TG1對(duì)細(xì)胞U251增殖、凋亡的影響與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-TP53TG1組TP53TG1的表達(dá)顯著升高，P21和Bax蛋白的表達(dá)顯著升高，Cyclin D1和Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞活力顯著降低，凋亡率顯著升高（P＜0.001）。表明，過(guò)表達(dá)TP53TG1可抑制U251細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 過(guò)表達(dá)腫瘤蛋白53靶基因1（TP53TG1）對(duì)細(xì)胞U251增殖、凋亡的影響

表1 過(guò)表達(dá)TP53TG1對(duì)細(xì)胞U251增殖的影響∕±s

表1 過(guò)表達(dá)TP53TG1對(duì)細(xì)胞U251增殖的影響∕±s

注：TP53TG1為腫瘤蛋白53靶基因1，pcDNA3.1為空載體質(zhì)粒，pcDNA3.1-TP53TG1為T(mén)P53TG1的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。

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2.3 過(guò)表達(dá)TP53TG1對(duì)細(xì)胞U251遷移、侵襲的影響與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-TP53TG1組U251細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)減少［（138±14.01）個(gè) 比（72±7.26個(gè)）、（126±12.54）個(gè) 比（65±6.63）個(gè)，t=12.548、12.901，均P＜0.001］，MMP-2蛋白水平降低［（0.63±0.06）比（0.21±0.02），t=19.922，P＜0.001］，Ecadherin蛋白水平升高［（0.33±0.03）比（1.02±0.10），t=19.827，P＜0.001］，過(guò)表達(dá)TP53TG1可抑制U251細(xì)胞遷移和侵襲。見(jiàn)圖2。

圖2 過(guò)表達(dá)TP53TG1對(duì)細(xì)胞U251 E-cadherin、MMP-2蛋白表達(dá)的影響

2.4 TP53TG1靶向調(diào)控miR-33a表達(dá)生物信息學(xué)軟件在線(xiàn)預(yù)測(cè)到TP53TG1和miR-33a存在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖3。與miR-NC、WT-TP53TG1共轉(zhuǎn)染組相比，miR-33a、WT-TP53TG1共轉(zhuǎn)染組U251細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低［（1.04±0.10）比（0.32±0.03），t=20.689，P＜0.001］；與miR-NC、MUT-TP53TG1共轉(zhuǎn)染組相比，miR-33a、MUT-TP53TG1共轉(zhuǎn)染組U251細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)顯著變化［（1.02±0.10）比（1.06±0.10），t=0.849，P=0.409］。與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-TP53TG1組U251細(xì) 胞miR-33a的 表達(dá)水平顯著降低，（1.03±0.10）比（0.43±0.04），t=16.713，P＜0.05；與si-NC組 比 較，si-TP53TG1組U251細(xì)胞miR-33a的表達(dá)水平顯著升高，（1.04±0.10）比（1.76±0.18），t=10.490，P＜0.001。以上結(jié)果表明，TP53TG1靶向負(fù)調(diào)控miR-33a表達(dá)。

圖3 腫瘤蛋白53靶基因1（TP53TG1）靶向miR-33a

2.5 過(guò)表達(dá)miR-33a能逆轉(zhuǎn)TP53TG1對(duì)細(xì)胞U251增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-TP53TG1組U251細(xì)胞活力、miR-33a表達(dá)以及Cyclin D1、Bcl-2和MMP-2蛋白水平降低，凋亡率以及P21、Bax和E-cadherin蛋白水平升高，遷移數(shù)和侵襲數(shù)減少；與pcDNA3.1-TP53TG1+miR-NC組 比 較，pcDNA3.1-TP53TG1+miR-33a組U251細(xì)胞細(xì)胞活力、miR-33a表達(dá)以及Cyclin D1、Bcl-2和MMP-2蛋白水平升高，凋亡率以及P21、Bax和E-cadherin蛋白水平降低，遷移數(shù)和侵襲數(shù)增多（P＜0.001）。以上結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-33a能夠逆轉(zhuǎn)TP53TG1對(duì)細(xì)胞U251增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響。見(jiàn)圖4，表2。

表2 過(guò)表達(dá)miR-33a能逆轉(zhuǎn)腫瘤蛋白53靶基因1（TP53TG1）對(duì)細(xì)胞U251細(xì)胞活性的影響∕±s

表2 過(guò)表達(dá)miR-33a能逆轉(zhuǎn)腫瘤蛋白53靶基因1（TP53TG1）對(duì)細(xì)胞U251細(xì)胞活性的影響∕±s

注：①與pcDNA3.1組比較，P＜0.05。②與pcDNA3.1-TP53TG1+miR-NC組比較，P＜0.05。

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圖4 過(guò)表達(dá)miR-33a能逆轉(zhuǎn)TP53TG1對(duì)細(xì)胞U251凋亡及Cyclin D1、P21、Bax、Bcl-2、E-cadherin、MMP-2蛋白表達(dá)的影響：A為過(guò)表達(dá)miR-33a能逆轉(zhuǎn)TP53TG1對(duì)細(xì)胞U251凋亡的影響；B為過(guò)表達(dá)miR-33aCyclin D1、P21、Bax、Bcl-2、E-cadherin、MMP-2蛋白的表達(dá)

3 討論

膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤［8］。盡管有手術(shù)和放化療等治療手段，膠質(zhì)瘤的發(fā)病率和死亡率仍然很高［1］。闡明膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，開(kāi)發(fā)更有效的診治療方法，對(duì)改善膠質(zhì)瘤病人預(yù)后，提高生存率具有重大意義。

lncRNA是活躍的生物分子，在許多腫瘤中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。多項(xiàng)研究表明，lncRNA參與調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和耐藥等多種生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控［9-11］。TP53TG1是p53誘導(dǎo)的lncRNA，在人類(lèi)癌癥的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。本研究探索了TP53TG1在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中的作用，結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TP53TG1表達(dá)下調(diào)，這與包雯等［12］的研究結(jié)論相吻合，可能與TP53TG1啟動(dòng)子CpG島高甲基化有關(guān)，TP53TG1表達(dá)的恢復(fù)與結(jié)腸直腸癌和胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力降低相關(guān)［13］。Cyclin D1是重要的細(xì)胞周期蛋白，主要通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期發(fā)揮細(xì)胞增殖正性調(diào)控作用，而P21則發(fā)揮相反的作用［14］。Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡中具有重要作用，促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的比例是細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵［15］。E-cadherin是上皮細(xì)胞標(biāo)志物，腫瘤細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)下調(diào)，而MMP-2表達(dá)上調(diào)則通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［16］。本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)TP53TG1在抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲誘導(dǎo)凋亡，伴隨著P21、E-cadherin和Bax蛋白水平的增加以及Cyclin D1、MMP-2和Bcl-2蛋白水平的下降。提示TP53TG1在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮抑癌基因作用。

近年來(lái)，lncRNA通過(guò)與miRNA相互作用調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制被廣泛報(bào)道。為揭示TP53TG1調(diào)控膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-33a是TP53TG1的潛在靶基因。隨后的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了TP53TG1和miR-33a的靶向關(guān)系，并通過(guò)Western blotting證實(shí)在膠質(zhì)瘤中miR-33a的表達(dá)到受到TP53TG1的負(fù)性調(diào)控。miR-33a是一種內(nèi)含子miRNA，位于固醇反應(yīng)原件結(jié)合蛋白基因SREBF2的內(nèi)含子序列中，在調(diào)節(jié)膽固醇和脂肪酸代謝中發(fā)揮重要作用［17］。研究顯示，miR-33a在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，高表達(dá)miR-33a的膠質(zhì)瘤病人腫瘤體積較大、生存率較低，敲除miR-33a可抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)［18］。此外，miR-33a高表達(dá)還可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自我更新［19-20］。于是，本研究推測(cè)TP53TG1通過(guò)負(fù)性調(diào)控miR-33a表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。為證實(shí)TP53TG1的抗膠質(zhì)瘤作用依賴(lài)于miR-33a表達(dá)下調(diào)，本研究將pcDNA3.1-TP53TG1和miR-33a mimics共轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-33a可顯著逆轉(zhuǎn)TP53TG1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力、遷移數(shù)、侵襲數(shù)、凋亡率以及對(duì)應(yīng)蛋白水平的影響。

綜上所述，TP53TG1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)TP53TG1通過(guò)靶向miR-33a抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，TP53TG1有望成為膠質(zhì)瘤的潛在診療靶點(diǎn)。