超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素、甲硝唑

于浩洋，祁珍禎，朱冰雅，李顏巖

(遼寧省疾病預(yù)防控制中心，沈陽(yáng) 110005)

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素屬于氯霉素類(lèi)抗生素，對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌具有很強(qiáng)的活性，能抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的形成，表現(xiàn)出廣譜抗菌能力，因其良好的抗菌性能，曾被廣泛應(yīng)用到畜牧業(yè)及水產(chǎn)養(yǎng)殖中［1］。當(dāng)人們食用了使用氯霉素類(lèi)抗生素的畜牧業(yè)或水產(chǎn)品后，氯霉素類(lèi)抗生素會(huì)殘留于人體內(nèi)。隨著氯霉素類(lèi)抗生素的大量使用，其不良作用也逐漸表露出來(lái)，可導(dǎo)致粒細(xì)胞缺乏癥、再生障礙性貧血、灰嬰綜合征等，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康［2-3］。當(dāng)前，世界上許多國(guó)家已禁止氯霉素類(lèi)藥用于動(dòng)物食品的生產(chǎn)，并規(guī)定了其在畜產(chǎn)品中最高殘留限量，美國(guó)、歐盟規(guī)定氯霉素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為“零容許量”，即不得檢出［4］。甲砜霉素和氟甲砜霉素抗菌譜與氯霉素相似，較氯霉素毒性有所降低，被廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)，為保障食品安全，我國(guó)、歐盟等均制定了其在動(dòng)物源性食品中的最大殘留限量［5-7］。

甲硝唑(MTZ)屬于硝基咪唑類(lèi)抗生素，被普遍用于預(yù)防和控制蜜蜂孢子蟲(chóng)病，對(duì)厭氧細(xì)菌十分有效［8］。硝基咪唑類(lèi)藥物對(duì)哺乳動(dòng)物具有致癌、致畸、致突變作用和遺傳毒性，通過(guò)食品接觸可能對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成潛在威脅［9-10］。歐盟EEC 2377／90 標(biāo)準(zhǔn)中，甲硝唑被列為禁止添加藥物［11］。我國(guó)農(nóng)業(yè)部最新頒布的第250 號(hào)公告《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留量》［12］中規(guī)定動(dòng)源性食品中不得檢出氯霉素、甲硝唑，動(dòng)物源性食品中甲砜氯霉素的最高殘留限量為50 μg／kg，氟甲砜霉素最高殘留限量（以氟苯尼考與氟苯尼考胺之和計(jì)）為100～3 000 μg／kg。

盡管?chē)?guó)家已頒布了食品中抗生素殘留標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)政策，仍有部分蜂農(nóng)罔顧法紀(jì)，受利益驅(qū)使違規(guī)使用抗生素，近幾年偶有檢出陽(yáng)性蜂產(chǎn)品［13-14］，給消費(fèi)者的身體健康帶來(lái)危害，因此加強(qiáng)對(duì)蜂蜜中抗生素使用的把控與監(jiān)管，保障蜂蜜的食品安全非常必要。蜂蜜中甲硝唑或氯霉素類(lèi)化合物的檢測(cè)方法很多［15-16］，主要有高效液相色譜(HPLC)法［17］、氣相色譜－質(zhì)譜(GC－MS)法［18］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC－MS／MS)法［19-20］。由于甲硝唑與氯霉素類(lèi)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)有較大差異，在溶劑中，氯霉素類(lèi)化合物帶負(fù)電荷，甲硝唑帶正電荷，因此在使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)時(shí)，需要分別采用正離子和負(fù)離子掃描模式進(jìn)行采集，較為繁瑣。目前，同時(shí)測(cè)定甲硝唑和氯霉素類(lèi)化合物的方法報(bào)道較少，張琳等［21］使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物源性食品中氯霉素和甲硝唑，但蜂蜜是一個(gè)高糖分、有機(jī)酸復(fù)雜的樣品，檢測(cè)的干擾性比較大，其沒(méi)有使用內(nèi)標(biāo)或固相萃取柱凈化以消除基質(zhì)干擾。筆者采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以氯霉素-D5和甲硝唑-D4為內(nèi)標(biāo)同時(shí)測(cè)定蜂蜜中甲硝唑、氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的殘留，采用固相萃取柱凈化以達(dá)到消除基質(zhì)干擾的目的，操作簡(jiǎn)便快捷，定性定量準(zhǔn)確，檢出限低，靈敏度高，重現(xiàn)性好，能滿(mǎn)足同時(shí)檢測(cè)蜂蜜中甲硝唑和氯霉素類(lèi)化合物的需要。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：3200QTRAP型，美國(guó)AB 公司。

渦旋振蕩器：Lab Dancer 型，德國(guó)艾卡公司。

高速冷凍離心機(jī)：Thermo ST16R 型，美國(guó)賽默飛世爾公司。

電子天平：BS 110S 型，感量為0.1 mg，德國(guó)賽多利斯公司。

超純水系統(tǒng)：MILLI-Q Gradient 型，法國(guó)默克密理博公司。

高速離心機(jī)：TGL-16A 型，上海安亭科學(xué)儀器廠。

氮吹儀：urboVap LV 型，美國(guó)Caliper Life Science 公司。

固相萃取儀：Vac Elut SPS 24 型，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

超聲波清洗器：KQ5200DB 型，昆山市超聲儀器有限公司。

Pall Corpration Acrodisc 針式濾器：孔徑為0.2 μm，直徑為13 mm，美國(guó)頗爾公司。

固相萃取柱：Oasis MCX 型，柱容積為6 mL,填料質(zhì)量為150 mg，美國(guó)沃特世公司。

氯霉素-D5：編號(hào)為H409107AL，質(zhì)量濃度為100 ng／μL，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司。

氯霉素、甲硝唑-D4、甲硝唑、氟甲砜霉素、甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：編號(hào)分別為G974527、G174488、G133045、G169577、G988144，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為99.8%、98.5%、96.2%、99.9%、99.3%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司。

乙腈、甲醇、乙酸乙酯：色譜純，美國(guó)費(fèi)希爾公司。

甲酸：色譜純，美國(guó)福祿克公司。

乙酸銨：色譜純，德國(guó)CNW 公司。

氨水：分析純，西隴科學(xué)股份有限公司。

鹽酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Kinetex C18柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm，美國(guó)沃特世公司）；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：4 ℃；流動(dòng)相：A 相為乙腈，B 相為5 mmol／L 乙酸銨溶液（含0.05%甲酸）；流量：0.4 mL／min；進(jìn)樣體積：10 μL；梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 色譜分離梯度洗脫條件

1.2.2 串聯(lián)質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；離子噴霧電壓：5 500 V（正離子）～4 500 V（負(fù)離子）；離子源溫度：550 ℃；噴霧氣壓力：413.7 kPa；輔助加熱器壓力：413.7 kPa；氣簾氣壓力：137.9 kPa；掃描方式：甲硝唑、甲硝唑-D4為正離子掃描模式，氯霉素、氯霉素-D5、氟甲砜霉素、甲砜霉素為負(fù)離子掃描模式。4 種抗生素及內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間見(jiàn)表2 所示。

表2 4 種抗生素及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g 蜂蜜（精確至0.01 g）置于50 mL離心管中，向其中加入100 μL 20 ng／mL 的氯霉素-D5應(yīng)用液、100 μL 20 ng／mL 的甲硝唑-D4應(yīng)用液，加入10 mL 水，混勻溶解，再加入10 mL 乙酸乙酯，渦旋提取3 min，以10 000 r／min 離心3 min，吸取乙酸乙酯相5 mL 于10 mL 試管中，40 ℃水浴氮?dú)獯蹈珊螅燃尤?.1 mL 甲醇溶解，再加入1.9 mL 40 mmol／L 鹽酸溶液，渦旋30 s，轉(zhuǎn)入2 mL 離心管，15 000 r／min 離心3 min，上清液待凈化。

先后用6 mL 甲醇、6 mL 水、6 mL 40 mmol／L的鹽酸溶液活化平衡MCX 固相萃取柱，然后將上述上清液轉(zhuǎn)移至MCX 柱內(nèi)，待樣品過(guò)柱后，用6 mL 水淋洗除雜，真空抽干柱內(nèi)液體后加入5 mL 乙酸乙酯洗脫，收集于氮吹管內(nèi)，得到洗脫液1；再用6 mL 甲醇淋洗除雜，真空抽干后用5 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集于氮吹管內(nèi)，得到洗脫液2；洗脫液1 和2 在40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈?，先向其中加?.1 mL 甲醇溶解殘留物，再加入0.9 mL 10%甲醇-水溶液混勻，過(guò)0.22 μm 濾膜后上機(jī)分析。洗脫液1 用于分析氯霉素類(lèi)抗生素，洗脫液2 用于分析甲硝唑。

1.3.2 溶液的配制

氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素、甲硝唑單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取4 種抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各0.010 g(精確到0.000 01 g)，以甲醇溶解并定容至10 mL，得到4 種抗生素質(zhì)量濃度均為1.0 mg／mL的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確移取4 種抗生素單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液500 μL 于50 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，得到4 種抗生素質(zhì)量濃度均為10.0 μg／mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃下保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液：準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液25 μL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，得到4種抗生素質(zhì)量濃度均為25.0 ng／mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，于4 ℃下保存。

氯霉素-D5應(yīng)用液：準(zhǔn)確移取50 μL 質(zhì)量濃度為100 μg／mL 的氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于50 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，得到質(zhì)量濃度為100.0 ng／mL 的氯霉素-D5儲(chǔ)備液，于-20 ℃保存；后用甲醇稀釋至20.0 ng／mL ，于4 ℃保存。

甲硝唑-D4應(yīng)用液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.010 g（精確到0.000 01 g）甲硝唑-D4標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解并定容至100 mL，質(zhì)量濃度為0.1 mg／mL ，于-20 ℃保存；后用甲醇稀釋至20.0 ng／mL，于4 ℃保存。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別吸取25.0 ng／mL抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4 mL，20.0 ng／mL 氯霉素-D5和甲硝唑-D4應(yīng)用液各100 μL，25%乙腈-水溶液，定容至1.0 mL，制備成4 種抗生素的質(zhì)量濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 ng／mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在電噴霧正負(fù)離子模式下對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)氯霉素、氯霉素-D5、甲砜霉素、氟甲砜霉素均能在負(fù)離子條件下電離，Q1 掃描時(shí)出現(xiàn)豐度較高的［M-H］-峰，而甲硝唑和甲硝唑-D4可在正離子條件下電離，Q1 掃描時(shí)出現(xiàn)豐度較高的［M+H］+峰。分別選擇［M-H］-峰作為氯霉素類(lèi)的母離子、［M+H］+峰作為甲硝唑的母離子，對(duì)其進(jìn)行碰撞解離。通過(guò)子離子掃描，得到碎片離子信息，再對(duì)去簇電壓、碰撞電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使分子離子對(duì)的信號(hào)達(dá)到最強(qiáng)，每種化合物選擇2 對(duì)分子離子對(duì)，以響應(yīng)較強(qiáng)的子離子作為定量離子，另一子離子作為定性離子?；衔锏馁|(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

2.2 色譜條件優(yōu)化

由于甲醇和乙腈對(duì)絕大多數(shù)有機(jī)物具有較高溶解度，且二者具有低腐蝕性、低毒性、低粘性的特征，因此在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的使用中多采用甲醇或乙腈作為有機(jī)相。此外，常在流動(dòng)相中加入乙酸銨，可以有效提高目標(biāo)化合物的響應(yīng)并改善峰型［22-23］分別以相同比例的乙腈-5 mmol／L 乙酸銨溶液和甲醇-5 mmol／L 乙酸銨溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在甲醇-5 mmol／L 乙酸銨溶液體系中，氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素響應(yīng)較高，但甲硝唑響應(yīng)偏低；在乙腈-5 mmol／L 乙酸銨溶液體系中，氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素響應(yīng)雖稍有下降，但甲硝唑響應(yīng)值明顯升高，因此選用乙腈-5 mmol／L 乙酸銨溶液作為流動(dòng)相。

由于甲酸在水中電離產(chǎn)生正離子，向水相中加入甲酸可以增加正離子掃描模式下甲硝唑的離子化效率，提高靈敏度。分別考察了0.01%、0.05%、0.1%三種濃度甲酸作為流動(dòng)相時(shí)，對(duì)甲硝唑及氯霉素類(lèi)化合物響應(yīng)值的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，甲酸濃度為0.05%時(shí)，在提高甲硝唑的離子化效率的同時(shí)，對(duì)氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的電離沒(méi)有顯著性影響，故B 相選用0.05%甲酸水溶液。

當(dāng)樣品溶液的溶劑與流動(dòng)相溶劑對(duì)樣品溶解度不同時(shí)，可能會(huì)造成峰展寬、峰分叉現(xiàn)象。為防止溶劑效應(yīng)的發(fā)生，試驗(yàn)樣品先加入0.1 mL 甲醇超聲溶解殘留物，再加入0.9 mL 體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醇-水溶液，混勻后進(jìn)樣。可有效防止溶劑效應(yīng)，改善色譜峰峰型，提高響應(yīng)值。

以乙腈-5 mmol／L乙酸銨溶液（含0.05%甲酸）為流動(dòng)相，采用Kinetex C18柱（100 mm ×2.1 mm，2.6 μm，美國(guó)沃特世公司）對(duì)4 種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分離，結(jié)果表明，梯度洗脫比等度洗脫分析時(shí)間短、色譜峰寬更窄，且能夠克服等度洗脫時(shí)待測(cè)物與干擾雜質(zhì)一起流出，對(duì)待測(cè)物的離子化產(chǎn)生抑制作用以及色譜峰背景干擾的缺點(diǎn)。優(yōu)化的梯度洗脫程序見(jiàn)表1。在優(yōu)化條件下4 種抗生素提取色譜圖如圖1、圖2 所示。

圖1 氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的提取色譜圖

圖2 甲硝唑的提取色譜圖

2.3 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

食品樣本分析過(guò)程中，樣本的前處理較為費(fèi)力、費(fèi)時(shí)，同時(shí)明顯影響分析結(jié)果的限速過(guò)程。氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素和甲硝唑?qū)儆谌鯓O性物質(zhì)，易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。通過(guò)考察證明，在3 種試劑中，乙酸乙酯提取率最高，因此選擇乙酸乙酯提取樣品。4 種抗生素需采用正負(fù)兩種掃描方式，因此采用的固相萃取小柱需對(duì)陰陽(yáng)離子均有所保留。Waters Oasis MCX 固相萃取小柱屬于混合型陽(yáng)離子交換反相吸附劑，其填料設(shè)計(jì)可以克服傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)混合型固相萃取吸附劑的局限性，提供了離子交換和反相離子交換的雙重保留模式。因此試驗(yàn)采用乙酸乙酯從MCX 柱洗脫獲得氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素組分，采用5%氨化甲醇從MCX 柱洗脫獲得甲硝唑組分，分級(jí)凈化可有效去除干擾物質(zhì)，滿(mǎn)足要求。

2.4 同位素內(nèi)標(biāo)的使用

在質(zhì)譜分析中，同位素內(nèi)標(biāo)法是以穩(wěn)定同位素標(biāo)記化合物作為內(nèi)標(biāo)，利用待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)豐度比值(峰面積比)進(jìn)行線性回歸，通過(guò)對(duì)同位素豐度的準(zhǔn)確質(zhì)譜測(cè)量和對(duì)加入的內(nèi)標(biāo)的準(zhǔn)確稱(chēng)量，做到對(duì)待測(cè)物的定量測(cè)定。該技術(shù)能有效消除基質(zhì)干擾、具有檢測(cè)靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。

2.5 線性關(guān)系與檢出限

在1.2 儀器條件下測(cè)定1.3.2 配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以待測(cè)化合物的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。以3 倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法的檢出限。計(jì)算得到的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限結(jié)果列于表5。由表5 可知，4 種抗生素質(zhì)量濃度與對(duì)應(yīng)的色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，檢出限為0.08 μg／L。

表5 回歸方程、線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)與檢出限

2.6 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取18 份空白蜂蜜5 g 作為本底，分別加入高、中、低三個(gè)質(zhì)量濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度水平平行6 次測(cè)定，樣品處理同前，上機(jī)測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。由表6 可知，4 種抗生素的平均加標(biāo)回收率為90.2%～105.7%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.7%～8.9%，說(shuō)明方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

表6 4 種抗生素的加標(biāo)回收、精密度試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

建立了一種HPLC-MS／MS 方法同時(shí)檢測(cè)蜂蜜中甲硝唑、氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素濃度，該方法對(duì)儀器條件和凈化過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化，同位素內(nèi)標(biāo)的使用可減少基質(zhì)效應(yīng)的影響，具有檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、檢出限低、靈敏度高等特點(diǎn)，適用于蜂蜜中甲硝唑、氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留量的同時(shí)檢測(cè)。