灰氈毛忍冬苯丙氨酸解氨酶（LmPAL2）基因的 克隆與表達(dá)分析

王珊，陳勛，龍雨青，童巧珍，劉湘丹*，周日寶*（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，長沙 410005；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙 410208；.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，湖南 衡陽 421002；4.湖南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化及功能工程技術(shù)研究中心，長沙 410208；5.湖南省普通高等學(xué)校中藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410208）

灰氈毛忍冬Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.來源于忍冬科，收載于《中國藥典》2020年版山銀花項(xiàng)下，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，是臨床常用中藥之一。自《中國藥典》2005年版將金銀花與山銀花分列后，學(xué)者們對(duì)兩者開展了多項(xiàng)對(duì)比研究[1-2]，其中主要活性成分綠原酸的含量測(cè)定結(jié)果顯示，灰氈毛忍冬顯著高于忍冬。大量研究表明，綠原酸具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化和抗炎等作用[3]，灰氈毛忍冬作為提取綠原酸的主要原料之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。以往提高綠原酸含量的研究多集中在提取工藝和加工炮制等方面[4-5]。近些年，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，對(duì)灰氈毛忍冬綠原酸生物合成途徑的相關(guān)基因研究逐漸成為熱點(diǎn)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸的生物合成可能與苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、羥基肉桂轉(zhuǎn)移/羥基肉桂酰輔酶A奎尼酸轉(zhuǎn)移酶（HCT/HQT）和香豆酸羥化酶（C3H）等重要酶有關(guān)[6]。目前已有關(guān)于灰氈毛忍冬HQT基因[4，7]、LmCCoAOMT基因[8]、4CL基因[9]，以及本項(xiàng)目組的PAL1基因[10]和C3H1基因[11]等陸續(xù)被克隆，這些基因皆被認(rèn)為是參與調(diào)控綠原酸生物合成途徑的關(guān)鍵基因。綠原酸為苯丙素類物質(zhì)，其合成與苯丙烷代謝密切相關(guān)[12]。PAL 作為苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，對(duì)綠原酸的合成有著促進(jìn)作用[13]。

本研究以灰氈毛忍冬的花、莖和葉為材料，根據(jù)項(xiàng)目組前期獲得的灰氈毛忍冬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的相關(guān)序列設(shè)計(jì)引物，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和擴(kuò)增技術(shù)（RACE），克隆灰氈毛忍冬PAL2（LmPAL2）基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。再采用qRT-PCR 技術(shù)測(cè)定其在不同花期和不同部位的表達(dá)量，并進(jìn)行分析，為進(jìn)一步探究LmPAL2基因在參與灰氈毛忍冬綠原酸生物合成中的調(diào)控作用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

灰氈毛忍冬材料均采摘于湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥植園，取開花進(jìn)程中的7個(gè)花期的花[10]以及莖、葉，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)周日寶教授鑒定為灰氈毛忍冬的花、莖及葉，于－80℃ 冰箱保存。

1.2 試藥

Biospin 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（杭州博日科技有限公司），RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit（Thermo公司），Gel Extraction Kit、2×Taq MasterMix（Dye）和2×Pfu MasterMix（Dye）（康為世紀(jì)生物科技有限公司），pEASY-T1 Cloning Vector、pEASY-Blunt Cloning Vector和TranStart Green qPCR SuperMix UDG（北京全式金生物科技有限公司），SMARTer RACE 5’/3’ Kit（Clontech 公司）。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成（序列見表1），濃度均為10 μmol·L－1。

表1 引物序列 Tab 1 Primer sequence

2 方法

2.1 LmPAL2 基因克隆

2.1.1 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成 取灰氈毛忍冬白色花蕾期的花適量，參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒的步驟提取總RNA[14]，分別于瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳和微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的完整性及純度。根據(jù)Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

2.1.2LmPAL2基因核心片段擴(kuò)增 從本課題組前期獲得的灰氈毛忍冬轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中，篩選出標(biāo)注為PAL的序列，應(yīng)用Primer Premier 軟件設(shè)計(jì)特異性引物PAL2-F和PAL2-R（見表1），以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序參考文獻(xiàn)[10]，其中引物為PAL2-F和PAL2-R。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，利用膠回收試劑盒回收目的條帶，按照pEASY-T1 Cloning Vector 說明書的步驟進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、篩選，將挑選出的白斑進(jìn)行菌液PCR，并委托上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

2.1.3LmPAL2基因5’-和3’-RACE擴(kuò)增 根據(jù)“2.1.2”項(xiàng)下測(cè)得的LmPAL2基因核心片段設(shè)計(jì)5’-和3’-RACE 引物PAL2-5’和PAL2-3’（見表1）。按照RACE 試劑盒說明書分別合成LmPAL2基因的5’-和3’-RACE-Ready cDNA，再分別進(jìn)行5’-及3’-RACE擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序參考文獻(xiàn)[10]，其中引物為PAL2-5’和PAL2-3’?；厥誖ACE 擴(kuò)增產(chǎn)物和T載體克隆等同“2.1.2”項(xiàng)下，所用載體為Blunt。

2.1.4LmPAL2基因cDNA全長的獲得及驗(yàn)證 采 用Conting Express軟 件 對(duì)5’-和3’-端 序列進(jìn)行拼接，得到LmPAL2基因的cDNA序列全長。根據(jù)序列全長設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物V-PAL2-F和V-PAL2-R（見 表1），以“2.1.1”項(xiàng) 下 得 到的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行全長驗(yàn)證。PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序參考文獻(xiàn)[10]，其中引物為V-PAL2-F 和V-PAL2-R?；厥漳康臈l帶、克隆等同“2.1.2”下，所用載體為Blunt。

2.2 LmPAL2 基因生物信息學(xué)分析

應(yīng)用NCBI 在線軟件查找LmPAL2基因的ORF，通過ProtParam 軟件在線預(yù)測(cè)其編碼蛋白的分子量、分子式、不穩(wěn)定系數(shù)及等電點(diǎn)等；利用ProtScale 軟件測(cè)定其蛋白親/疏水性；采用WOLF PSORT 在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位情況；TMHMM 分析蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)；SignalP 4.1 Server 預(yù)測(cè)信號(hào)肽；InterProScan分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；SOPMA和SWISS-MODEL分別預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；通過NCBI的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 比對(duì)，篩選出同源性較高的物種，再利用DNAMAN 軟件進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì)，并用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2.3 LmPAL2 基因在不同花期和不同器官的表達(dá)

根據(jù)LmPAL2基因cDNA全長序列，設(shè)計(jì)熒光定量PCR的特異性引物Q-PAL2-R 和Q-PAL2-F（見表1）。采用“2.1.1”項(xiàng)下灰氈毛忍冬7個(gè)花期的花及莖、葉的RNA，定量至100 ng·μL－1后反轉(zhuǎn)錄合成各自的cDNA第一鏈，以18 S rRNA為內(nèi)參基因，在熒光定量PCR 儀上進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序參考文獻(xiàn)[10]，其中引物為Q-PAL2-R和Q-PAL2-F。每個(gè)樣品重復(fù)3次，采用2－ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果與分析

3.1 LmPAL2基因克隆

3.1.1 總RNA的提取 灰氈毛忍冬花總RNA電泳結(jié)果見圖1，28 S和18 S條帶清晰可見，其中28 S條帶亮度約為18 S的2倍，提示提取的總RNA完整性良好，A260/A280值在1.8～2.0，A260/A230值＞2.0，說明總RNA質(zhì)量較好，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 總RNA電泳圖Fig 1 Electrophoresis of total RNA

3.1.2LmPAL2基因核心片段擴(kuò)增 通過RT-PCR擴(kuò)增得到約700 bp的單一條帶（見圖2），經(jīng)過回收、T載體克隆與測(cè)序，確定該核心片段序列長為693 bp。采用DNAMAN比對(duì)，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得序列基本一致。

圖2 LmPAL2基因核心片段擴(kuò)增產(chǎn)物Fig 2 PCR product core fragment of LmPAL2 gene

3.1.3LmPAL2基 因5’-和3’-RACE擴(kuò) 增 及cDNA全長驗(yàn)證5’-和3’-RACE擴(kuò)增結(jié)果均提示在1300 bp附近有一亮帶（見圖3A及3B）。將5’-和3’-端測(cè)序結(jié)果與核心片段序列拼接后，得到LmPAL2基因cDNA全長序列2425 bp。對(duì)其進(jìn)行全長驗(yàn)證，在2400 bp左右發(fā)現(xiàn)一明顯亮帶（見圖3C），將亮帶回收、克隆并測(cè)序，結(jié)果與拼接全長序列一致。

圖3 LmPAL2 基因克隆凝膠電泳Fig 3 Clone gel electrophoresis map of LmPAL2 gene

3.2 LmPAL2 基因生物信息學(xué)分析

3.2.1 蛋白理化特性 灰氈毛忍冬PAL2基因全長2425 bp，包含一個(gè)2124 bp的ORF，序列編碼707個(gè)氨基酸（見圖4），命名為LmPAL2，其GenBank登錄號(hào)為：MH779889。推測(cè)其分子式為C3402H5441N949O1038S25，相對(duì)分子質(zhì)量為77.05 kD，等電點(diǎn)為6.23，不穩(wěn)定系數(shù)為32.51，屬于穩(wěn)定蛋白，親水性平均系數(shù)為－0.207，預(yù)測(cè)其為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位推測(cè)LmPAL2蛋白可能定位于葉綠體中。蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)該基因編碼的氨基酸均在膜外，不具有跨膜區(qū)域。信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析，LmPAL2蛋白中無信號(hào)肽序列，推測(cè)其為非分泌蛋白。

圖4 LmPAL2全長序列及推測(cè)的氨基酸序列Fig 4 Full-length cDNA sequence of LmPAL2 gene and predicted amino acid sequence

3.2.2 蛋白結(jié)構(gòu)域和二、三級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)LmPAL2蛋白屬于PAL家族，包含PAL 保守結(jié)構(gòu)域，并且含有PAL/HAL 活性中心序列GTITASGDLVPLSYIAG。LmPAL2 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，其組成以α-螺旋和隨機(jī)卷曲為主，分別占55.59%和29.56%。LmPAL2 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果見圖5。

圖5 LmPAL2 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig 5 Prediction of tertiary structure of LmPAL2 protein

3.2.3 氨基酸序列同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析LmPAL2氨基酸序列同源性比對(duì)結(jié)果顯示，其 與 忍 冬Lonicera japonica（AGE10590.1）、葡萄Vitis vinifera（ANB59163.1）、獼 猴 桃Actinidia deliciosa（QED11030.1）、山 茶 花Camellia japonica（AFJ80777.1）、唐 松 草Thalictrum thalictroides（KAF5182779.1）、梨Pyrus bretschneideri（ASV49150.1）及 罌 粟Papaver somniferum（XP_026403210.1）的同源性在84.27%～99.15%。氨基酸多重序列比對(duì)結(jié)果見圖6，分析發(fā)現(xiàn)這些物種均含有GTITASGDLVPLSYIAG 酶活性中心序列。

圖6 LmPAL2 與其他植物PAL 蛋白的多序列比對(duì)分析Fig 6 Multiple sequence alignment of LmPAL2 and other plant PAL proteins

從NCBI 中下載與LmPAL2同源性較高的部分植物PAL基因家族氨基酸序列，應(yīng)用MEGA軟件構(gòu)建NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖7）。系統(tǒng)進(jìn)化樹主要聚為三支，灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides與忍冬Lonicera japonica、向日葵Helianthus annuus、罌粟Papaver somniferum、獼猴桃Actinidia deliciosa、柑橘Citrus clementina以及梨Pyrus bretschneideri聚為一支，其中與同科同屬的忍冬親緣關(guān)系最近。

圖7 LmPAL2 蛋白的NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig 7 Neighbor-joining phylogenetic tree of LmPAL2 proteins

3.3 LmPAL2 基因不同花期和不同器官的表達(dá)分析

LmPAL2基因在不同花期的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果表明，其在綠白色花蕾期表達(dá)強(qiáng)烈，花蕾初期、青綠色花蕾期和金黃色花期次之，枯萎期表達(dá)量最低（見圖8）。而LmPAL2基因在不同器官中的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果顯示，葉中的表達(dá)量最高，其次是白色花蕾期，莖中最低（見圖9）。

圖8 LmPAL2基因在不同花期中的相對(duì)表達(dá)量Fig 8 Relative expression of LmPAL2 gene in different flowering stages

圖9 LmPAL2基因在不同器官中的相對(duì)表達(dá)量Fig 9 Relative expression of LmPAL2 gene in different organs

4 討論

本研究克隆得到PAL2基因cDNA序列全長，其中ORF為2124 bp，編碼707個(gè)氨基酸。與本項(xiàng)目組前期獲得的PAL1基因ORF為2145 bp，編碼714個(gè)氨基酸相比[10]，存在稍許差異，這也驗(yàn)證了同一植物多基因家族中的各個(gè)基因編碼長度不盡相同[15]。同源性比對(duì)結(jié)果顯示，LmPAL2與LmPAL1的相似度為82.77%。兩者均含有PAL典型結(jié)構(gòu)域和活性中心，只是氨基酸的位點(diǎn)有所不同。

PAL是催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的限速酶，在植物次生代謝、生長發(fā)育和防御中發(fā)揮著重要的作用[16]。因此，PAL基因在許多植物中得到廣泛的研究。蓖麻RcPAL基因表達(dá)上調(diào)時(shí)木質(zhì)素含量顯著增加，下調(diào)時(shí)則相反，表明RcPAL基因是蓖麻木質(zhì)素生物合成的關(guān)鍵基因[17]。膜莢黃芪中的AmPAL2基因的表達(dá)可能與毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累密切相關(guān)[18]。茉莉花JsPAL2基因可能與茉莉花香氣物質(zhì)的合成有關(guān)[19]。水稻OsPALS基因通過調(diào)節(jié)水楊酸和木質(zhì)素的生物合成和積累，提高水稻對(duì)褐飛虱的抗性[20]。關(guān)于PAL參與綠原酸生物合成的功能研究也早已開展。大豆PAL2基因轉(zhuǎn)化煙草后，轉(zhuǎn)基因植株葉中的PAL轉(zhuǎn)錄水平提高5倍，且葉中綠原酸含量顯著增加[21]。擬南芥AtPAL2基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的過表達(dá)使綠原酸的含量增加了1倍[22]。忍冬LjbZIP8在轉(zhuǎn)基因煙草中過表達(dá)通過抑制NtPAL1、NtPAL2和NtPAL4的表達(dá)，降低了新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的含量，也間接說明PAL是綠原酸生物合成途徑中的關(guān)鍵基因[23]。

在大多數(shù)植物中，PAL基因?qū)儆谝粋€(gè)基因家族，PAL家族的每個(gè)成員表現(xiàn)出明顯的表達(dá)模式和活性差異[24]。如忍冬LJPAL1和LJPAL3基因的表達(dá)量花蕾＞葉，而LJPAL2則為花蕾略低于葉[25]。紅腺忍冬LHPAL1基因的表達(dá)量花蕾＞葉，LHPAL2和LHPAL3基因的表達(dá)量則為葉＞花蕾[25]。華南忍冬PAL1基因的表達(dá)量為葉＞花蕾，PAL2基因花蕾略低于葉，PAL3基因則花蕾明顯高于葉[26]?；覛置潭琇mPAL1基因的表達(dá)量為白色花蕾期花＞莖＞葉[10]，而LmPAL2則為葉＞白色花蕾期花＞莖。這也提示PAL基因家族成員在苯丙氨酸代謝途徑的功能調(diào)控中存在差異。

本研究中LmPAL2基因在綠白色花蕾期強(qiáng)烈表達(dá)，結(jié)合課題組前期研究，灰氈毛忍冬不同花期的綠原酸含量測(cè)定結(jié)果顯示，從綠白色花蕾期開始，綠原酸的含量逐漸上升，至金黃色開花期達(dá)到峰值[11]，初步推測(cè)LmPAL2表達(dá)豐度的升高，促進(jìn)了后期綠原酸的合成。后續(xù)可通過構(gòu)建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)基因植株以開展LmPAL2基因參與綠原酸合成的功能驗(yàn)證研究。

本研究完成了灰氈毛忍冬LmPAL2基因的克隆，并比較了其在不同花期和不同器官的表達(dá)差異，為進(jìn)一步研究灰氈毛忍冬次生代謝產(chǎn)物綠原酸積累的分子調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)，為通過基因工程技術(shù)培育出綠原酸含量更高的優(yōu)良品種奠定基礎(chǔ)。