三種中獸藥產(chǎn)品中黃柏薄層色譜無(wú)苯展開(kāi)系統(tǒng)研究

安鵬麗，陳 靜，李金超，馮亞文，郭 莉，張 娜，楊彥超，李 樓，武俠均

(1.保定冀中藥業(yè)有限公司，保定 071500；；2.河北省獸藥監(jiān)察所，石家莊 050035；3.唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北唐山 063000)

三黃散、公英青藍(lán)合劑、公英青藍(lán)顆粒三個(gè)產(chǎn)品是畜牧養(yǎng)殖行業(yè)的常用產(chǎn)品，其標(biāo)準(zhǔn)收錄于2017年版《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(中藥卷)[1]。三個(gè)產(chǎn)品組方都含有黃柏，在黃柏的薄層色譜鑒別方面，展開(kāi)劑都使用了苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液(6∶3∶1.5∶1.5∶0.5)。

薄層色譜法是一種簡(jiǎn)便、快速、微量的分析方法，廣泛應(yīng)用于化學(xué)合成、天然藥物的定性鑒別和純度檢驗(yàn)中。其中，展開(kāi)系統(tǒng)是決定薄層色譜分離效果的重要因素。苯價(jià)格便宜且分離效果好，在多種藥物的薄層鑒別中表現(xiàn)出了優(yōu)良的性質(zhì)，但其毒性不容忽視。自職業(yè)病實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)報(bào)告以來(lái)，苯引起的急、慢性中毒人數(shù)一直位居我國(guó)職業(yè)中毒首位；2017年國(guó)際癌癥研究中心將苯再次列入人類致癌物清單(Ⅰ類)，同時(shí)被我國(guó)納入《國(guó)家高毒物品目錄》[2]。業(yè)內(nèi)對(duì)無(wú)苯展開(kāi)劑的研究不在少數(shù)。李正國(guó)等[3]人曾用甲苯替代苯，對(duì)梔子金花丸中的黃連、黃柏進(jìn)行薄層鑒別；陳藹等[4]對(duì)使用苯、甲苯為展開(kāi)劑的多種中藥材進(jìn)行了方法改進(jìn)，取得了較好的成果；朱弘等[5]對(duì)黃連解毒散、香薷散、烏梅散的薄層鑒別進(jìn)行了無(wú)苯展開(kāi)系統(tǒng)研究，證實(shí)以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)為展開(kāi)劑能收到良好的分離效果。

鑒于此，研究針對(duì)三黃散、公英青藍(lán)合劑、公英青藍(lán)顆粒三個(gè)常用產(chǎn)品開(kāi)展了替代苯試劑的薄層鑒別研究，以期找到合適的展開(kāi)劑，減少苯的使用，保護(hù)工作人員，并減少環(huán)境污染。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 GoodLook-2000型薄層色譜成像儀，上?？普苌萍加邢薰尽?/p>

硅膠G薄層板，青島海洋化工廠分廠，規(guī)格100 mm×100 mm，厚度0.20～0.25 mm，批號(hào)2020年07月07日、批號(hào)2020年05月08日。

硅膠HSG薄層板，煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司，規(guī)格100 mm×200 mm，厚度0.2 mm±0.03 mmm，批號(hào)020191216。

硅膠HSG薄層板，煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所，規(guī)格200 mm×100 mm，厚度0.25 mm±0.02 mm，批號(hào)20200703。

DC-Fertigplatten SIL G-25薄層板，德國(guó)MN(MACHEREY-NAGEL)公司，規(guī)格10×20 cm，厚度0.25 mm，批號(hào)407191。

TLC Silica gel 60薄層板，德國(guó)默克公司(Merck KGaA)，規(guī)格10 cm×20 cm，批號(hào)HX02024426。

玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管，華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠生產(chǎn)，內(nèi)徑0.5 mm。

三黃散、公英青藍(lán)合劑、公英青藍(lán)顆粒標(biāo)方樣品及三種產(chǎn)品相應(yīng)的無(wú)黃柏陰性樣品，按照國(guó)家現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2017年版中藥卷》[1]自制。

鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)110713-201212)、黃柏對(duì)照藥材(批號(hào)121510-201807)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

試劑甲醇、正丁醇、冰醋酸、乙酸乙酯、丁酮、甲酸、乙酸乙酯、環(huán)己烷、乙酸乙酯、異丙醇、三乙胺、氨水、正己烷、三氯甲烷均為分析純，水為純化水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 方法設(shè)計(jì) 室溫條件下，以硅膠G板為固定相，參照《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2017年版中藥卷》《中國(guó)獸藥典》[6]《中國(guó)藥典》[7]中黃柏及鹽酸小檗堿的相關(guān)檢測(cè)方法，篩選出的4種使用較為廣泛的展開(kāi)劑組合，對(duì)三種產(chǎn)品進(jìn)行薄層色譜分離。若能篩選出分離效果較好的展開(kāi)劑，則根據(jù)斑點(diǎn)分離度及目標(biāo)斑點(diǎn)比移植等進(jìn)一步優(yōu)化其配比，使其能夠達(dá)到最佳的分離效果。若備選項(xiàng)均不能達(dá)到有效分離，則另外探索新的試驗(yàn)方法。篩選的4種展開(kāi)方法如下：

方法一：正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)[1]

方法二：乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶7∶1∶1)[7]

方法三：乙酸丁酯-甲酸-水(14∶5∶5)的上層溶液[7]

方法四：環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)，氨蒸氣預(yù)飽和20 min[6，8]

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 三黃散 取三黃散標(biāo)方樣品0.3 g，加甲醇5 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。取不含黃柏的陰性對(duì)照樣品，同法制備三黃散陰性對(duì)照樣品。

1.2.2.2 公英青藍(lán)合劑 取公英青藍(lán)合劑標(biāo)方樣品2 mL，水浴蒸至近干，放冷，加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。取不含黃柏的陰性對(duì)照樣品，同法制備公英青藍(lán)合劑陰性對(duì)照樣品。

1.2.2.3 公英青藍(lán)顆粒 取公英青藍(lán)顆粒標(biāo)方樣品5 g，加甲醇5 mL使溶解，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。取不含黃柏的陰性對(duì)照樣品，同法制備公英青藍(lán)顆粒陰性對(duì)照樣品。

1.2.2.4 對(duì)照藥材與對(duì)照品 取黃柏對(duì)照藥材0.1 g，加甲醇5 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，取濾液作為對(duì)照藥材溶液。再取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.2.3 點(diǎn)樣、展開(kāi)與顯色 分別取三黃散陰性樣品、對(duì)照品、對(duì)照藥材、三黃散標(biāo)方供試品溶液各2 μL，公英青藍(lán)合劑陰性樣品、對(duì)照品、對(duì)照藥材、公英青藍(lán)合劑標(biāo)方供試品溶液各1 μL，公英青藍(lán)顆粒陰性樣品、對(duì)照品、公英青藍(lán)顆粒標(biāo)方供試品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，按照1.2.1項(xiàng)下設(shè)計(jì)方法展開(kāi)，展距8 cm，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法一(正丁醇-冰醋酸-水系統(tǒng))結(jié)果 由圖1可見(jiàn)，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)為展開(kāi)劑對(duì)三藥進(jìn)行薄層色譜分離，三黃散與公英青藍(lán)合劑分離度不夠，公英青藍(lán)顆粒背景模糊，與上下斑點(diǎn)之間輪廓不夠清晰。再者，該方法展開(kāi)需時(shí)較長(zhǎng)，展距8 cm約需2～2.5 h，不是首選方法。

A：三黃散展開(kāi)圖(1.陰性對(duì)照；2.鹽酸小檗堿對(duì)照品；3.黃柏對(duì)照藥材；4.三黃散標(biāo)方樣品)B：公英青藍(lán)合劑展開(kāi)圖(1.陰性對(duì)照；2.鹽酸小檗堿對(duì)照品；3.黃柏對(duì)照藥材；4.標(biāo)方樣品)C：公英青藍(lán)顆粒展開(kāi)圖(1.陰性對(duì)照；2.鹽酸小檗堿對(duì)照品；3.標(biāo)方樣品)以下均相同圖1 正丁醇-冰醋酸-水系統(tǒng)對(duì)三藥分離效果Fig 1 Separation effect for all the three drugs withn-butanol-glacial acetic acid-water system

2.2 方法二(乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水系統(tǒng))結(jié)果 以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶7∶1∶1)為展開(kāi)劑對(duì)三藥進(jìn)行薄層色譜分離，三黃散的陰性樣品存在干擾，公英青藍(lán)合劑與公英青藍(lán)顆粒條帶中主斑點(diǎn)與上下的藍(lán)色斑點(diǎn)分離度低，該方法不適用。

圖2 乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水系統(tǒng)對(duì)三藥分離效果Fig 2 Separation effect for all the three drugs with ethyl acetate-butanone-formic acid-water system

2.3 方法三(乙酸丁酯-甲酸-水系統(tǒng))結(jié)果 由圖3可見(jiàn)，以乙酸丁酯-甲酸-水(14∶5∶5)的上層溶液為展開(kāi)劑，三黃散與公英青藍(lán)合劑陰性樣品不存在干擾，但是公英青藍(lán)顆粒在主斑點(diǎn)處存在干擾，三者分離度都較差。

圖3 乙酸丁酯-甲酸-水系統(tǒng)(上層溶液)對(duì)三藥分離效果Fig 3 Separation effect for all the three drugs with butyl acetate-formic acid-water system (the upper solution)

2.4 方法四(環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺系統(tǒng))結(jié)果 由圖4可見(jiàn)，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)為展開(kāi)劑，三藥分離度尚可，但是三黃散的陰性樣品存在干擾，主斑點(diǎn)與一個(gè)紅色斑點(diǎn)重合；4B與4C間對(duì)比，可明顯看出該方法對(duì)鹽酸小檗堿主斑點(diǎn)的展開(kāi)效果不穩(wěn)定，主斑點(diǎn)出現(xiàn)的位置受溫度、濕度及加入氨水的量等多個(gè)因素干擾，重現(xiàn)性極差。因此該方法不適用于三種目標(biāo)產(chǎn)品的薄層分離。

圖4 環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺系統(tǒng)對(duì)三藥分離效果Fig 4 Separation effect for all the three drugs with cyclohexane-ethyl acetate-isopropanol-methanol-water-triethylamine system

2.5 方法改進(jìn) 由于上述四種來(lái)自藥典的展開(kāi)系統(tǒng)未能達(dá)到理想的分離效果，后期進(jìn)行了多種組合的嘗試，最終確定了新的展開(kāi)系統(tǒng)：正己烷-三氯甲烷-丁酮-乙酸乙酯-甲酸-水(3∶9∶6∶3∶4∶0.5)。該系統(tǒng)對(duì)三種藥物的分離效果如圖5。

(使用青島海洋2020年07月07日批次薄層G板)圖5 正己烷-三氯甲烷-丁酮-乙酸乙酯-甲酸-水系統(tǒng)對(duì)三藥分離效果Fig 5 Separation effect for all the three drugs with n-hexane-chloroform-butanone-ethyl acetate-formic acid-water system

由圖可見(jiàn)，三黃散、公英青藍(lán)合劑、公英青藍(lán)顆粒三種藥物使用該展開(kāi)系統(tǒng)，分離度高，斑點(diǎn)輪廓清晰，效果良好。

除斑點(diǎn)的形態(tài)和分離度指標(biāo)外，比移植Rf也是薄層色譜法的基本定性參數(shù)。

比移值Rf=原點(diǎn)到斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離

當(dāng)色譜條件一定時(shí)，組分Rf是一常數(shù)，其值在0～1之間，可用范圍是0.2～0.8，最佳范圍是0.3到0.5。物質(zhì)不同，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)各不相同，其Rf也不同。因此，利用Rf可以對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性鑒別[9]。

原點(diǎn)到溶劑前沿的距離即為展距，本試驗(yàn)中薄層板高10 cm，展距在8 cm，多次重復(fù)證實(shí)，目標(biāo)斑點(diǎn)位置距離原點(diǎn)在3.3～5 cm之間，受展開(kāi)劑飽和時(shí)間、溫濕度、不同硅膠板批次的影響稍有變動(dòng)。計(jì)算目標(biāo)斑點(diǎn)的比移值Rf介于0.41～0.62之間，各斑點(diǎn)之間分布較為均勻，方法穩(wěn)定。

2.6 方法驗(yàn)證 以正己烷-三氯甲烷-丁酮-乙酸乙酯-甲酸-水(3∶9∶6∶3∶4∶0.5)為展開(kāi)劑，對(duì)三黃散、公英青藍(lán)合劑、公英青藍(lán)顆粒的樣品進(jìn)行薄層色譜分離，分別使用青島海洋2020年5月8日(圖6-1)及2020年7月7日生產(chǎn)的硅膠G板重復(fù)試驗(yàn)，后者分離效果稍好于前者；使用德國(guó)默克公司G板HX02024426批次(圖6-2)、德國(guó)MN公司G板407191批次(圖6-3)，以及煙臺(tái)江友HSG板020191216批次(圖6-4)、煙臺(tái)化工HSG板20200703批次(圖6-5)重復(fù)，均能達(dá)到更好的分離效果。

3 討論與結(jié)論

苯屬于一類溶劑，對(duì)人體和環(huán)境的危害很大，國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室均已避免使用。2005年版《中國(guó)藥典薄層色譜彩色圖譜集》中已經(jīng)將苯改為甲苯，但該展開(kāi)系統(tǒng)不穩(wěn)定，存在重現(xiàn)性差的問(wèn)題[10]。研究在改進(jìn)三黃散、公英青藍(lán)合劑、公英青藍(lán)顆粒三種藥物中黃柏的薄層色譜鑒別展開(kāi)劑的研究過(guò)程中，試驗(yàn)了多種相關(guān)藥物應(yīng)用的不同展開(kāi)劑，如使用三氯甲烷-甲醇-濃氨(5∶0.6∶0.3)(苦參藥材鑒別)、二氯甲烷-丁酮-甲酸-水(10∶1∶0.1∶0.1)(布渣葉藥材鑒別)等為代表的展開(kāi)劑，酸/堿的含量較低，鹽酸小檗堿主斑點(diǎn)滯留在原點(diǎn)不發(fā)生移動(dòng)，但是提高展開(kāi)劑中酸或堿的含量至10%左右，則目標(biāo)斑點(diǎn)能夠隨展開(kāi)劑上行，且經(jīng)過(guò)對(duì)比證明，甲酸比乙酸、氨水、三乙醇胺等分離度好。雖然經(jīng)過(guò)幾十次嘗試仍未找到直接可用的展開(kāi)劑組合，但是發(fā)現(xiàn)了這三種產(chǎn)品在分離過(guò)程中有共同點(diǎn)：①主斑點(diǎn)的分離需要在酸或堿性環(huán)境下進(jìn)行；②三氯甲烷能夠使主斑點(diǎn)上升到無(wú)干擾的高度；③三氯甲烷展開(kāi)的主斑點(diǎn)形態(tài)有拖尾，乙酸乙酯能改善斑點(diǎn)形態(tài)；④加入少量水能夠使Rf值適中。

經(jīng)過(guò)嘗試，最終確定了新的展開(kāi)系統(tǒng)：正己烷-三氯甲烷-丁酮-乙酸乙酯-甲酸-水(3∶9∶6∶3∶4∶0.5)。經(jīng)過(guò)不同溫濕度條件下的多次重復(fù)試驗(yàn)證明，該展開(kāi)系統(tǒng)分離度高，重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，展距8 cm整體耗時(shí)在30～40 min；所用試劑均為常規(guī)試劑，毒性小，且對(duì)飽和時(shí)間無(wú)嚴(yán)格要求，是一種很穩(wěn)定的展開(kāi)劑系統(tǒng)。該系統(tǒng)可為三黃散、公英青藍(lán)合劑、公英青藍(lán)顆粒和其它以鹽酸小檗堿為主要成分的中藥材及成方制劑薄層色譜鑒別提供參考。