表達(dá)H5N1亞型禽流感HA、NA、M1基因的重組桿狀病毒的鑒定

李晶梅，陳魯杰，王煥君，李 改，朱 薇，張飛雁，石寶蘭，漆世華，謝紅玲

(1.國藥集團(tuán)動物保健股份有限公司，武漢 430075；2.諾華生物科技(武漢)有限責(zé)任公司，武漢 430075)

禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒引起的一種禽類傳染病,其中的H5N1亞型禽流感是危害最大的禽類疫病之一。疫苗能有效防控該疫病，現(xiàn)階段主要應(yīng)用的是雞胚工藝或細(xì)胞培養(yǎng)工藝制備H5N1亞型禽流感病毒，進(jìn)而生產(chǎn)全病毒滅活疫苗。全病毒滅活疫苗需在生物安全三級的生產(chǎn)車間生產(chǎn)，生產(chǎn)成本較高，因此廣大研究者一直在探尋新型疫苗研發(fā)方向[1]。

昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種能夠高效表達(dá)外源基因的真核表達(dá)載體系統(tǒng)[2]。昆蟲桿狀病毒不感染脊椎動物，無生物安全隱患；基因組較大可容納大片段外源基因；能對表達(dá)的蛋白進(jìn)行加工修飾，使表達(dá)的蛋白保存原有的生物活性[3]。有研究表明該系統(tǒng)表達(dá)流感病毒的 HA、NA、M1 蛋白可自我包裝成形態(tài)類似于禽流感病毒的病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)[4]。VLPs具有較好的免疫原性，有開發(fā)成為疫苗產(chǎn)品的可能。

為研究基于該系統(tǒng)構(gòu)建的含有H5N1亞型禽流感HA、NA、M1基因的重組桿狀病毒(簡稱“VLP01株”)，其表達(dá)產(chǎn)物是VLPs，還是游離的HA、NA、M1等蛋白，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了血凝、電鏡、Western Blot、ELISA鑒定，以確定其性質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 毒種、細(xì)胞 VLP01株毒種由諾華生物科技(武漢)有限責(zé)任公司提供，國藥集團(tuán)動物保健股份有限公司擴(kuò)繁并保存；Sf9細(xì)胞由國藥集團(tuán)動物保健股份有限公司擴(kuò)繁并保存。

1.2 主要試劑 H5N1 HA重組蛋白、H5N1 NA重組蛋白、H7N9 M1重組蛋白，Sino Biological公司產(chǎn)品；禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)(Re-6)抗原(簡稱“H5禽流感病毒”)，哈爾濱國生生物科技股份有限公司產(chǎn)品；HA單抗，由國藥集團(tuán)動物保健股份有限公司研制；NA多抗，abcam公司產(chǎn)品；M1單抗，santa cruz biotechnology公司產(chǎn)品；HRP羊抗鼠IgG和HRP羊抗兔IgG，KPL公司產(chǎn)品；DAB顯色試劑盒，武漢博士德公司產(chǎn)品；TMB顯色液，湖州英創(chuàng)生物科技有限公司產(chǎn)品；蛋白Marker，Thermo Scientific公司產(chǎn)品。

1.3 主要設(shè)備耗材 超速離心機(jī)，Beckman公司，水平轉(zhuǎn)子sw41Ti，角轉(zhuǎn)子 TyPe0ToTi；20 mL超濾濃縮離心管，50000MWCO，Vivaspin公司產(chǎn)品。

1.4 制備表達(dá)產(chǎn)物 毒種接種Sf9細(xì)胞，27 ℃培養(yǎng)4 d，3000 r/min 20 min離心收獲上清即為表達(dá)產(chǎn)物。

1.5 超速離心純化表達(dá)產(chǎn)物 角轉(zhuǎn)子離心表達(dá)產(chǎn)物，4 ℃ 28000 r/min 2 h。棄去上清，沉淀中加入PBS，震蕩懸浮后過夜，制成均勻混懸液。配制蔗糖密度梯度離心溶液，蔗糖密度分別為20%、60%，水平轉(zhuǎn)子離心混懸液，4 ℃ 28000 r/min 3 h。吸取目的條帶即為純化產(chǎn)物。

1.6 血凝效價檢測 檢測表達(dá)產(chǎn)物、角轉(zhuǎn)子離心上清、混懸液、純化產(chǎn)物的血凝效價，血凝檢測的方法參照《中華人民共和國獸藥典2015版第三部》附錄27[5]。

1.7 電鏡檢測 純化產(chǎn)物以超濾濃縮離心管脫糖，加至銅網(wǎng)上，2%磷鎢酸染色液負(fù)染，透射電鏡觀察VLPs的形態(tài)。

1.8 Western Blot檢測 純化前表達(dá)產(chǎn)物、純化后表達(dá)產(chǎn)物、H5禽流感病毒(對照)和H5N1 HA重組蛋白(HA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品)經(jīng)10% SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)至NC膜，用HA單抗作為一抗、HRP羊抗鼠IgG作為二抗、DAB染色液顯色，鑒定HA蛋白。同法用NA多抗鑒定NA蛋白，用M1單抗鑒定M1蛋白。

1.9 ELISA檢測 用NA兔多抗作為包被抗體、HA鼠單抗作為檢測抗體建立雙抗夾心ELISA方法，并以此方法檢測表達(dá)產(chǎn)物。包被捕獲抗體：加入NA多抗，200 ng/孔，100 μL/孔，2～8 ℃孵育過夜，PBST 洗板。封閉：加入含5%脫脂乳的PBS，250 μL/孔，37 ℃封閉 2 h，PBST 洗板。加樣：在酶標(biāo)板相應(yīng)孔中加入適當(dāng)稀釋的表達(dá)產(chǎn)物、H5禽流感病毒和HA蛋白、NA蛋白，100 μL/孔，3個重復(fù)，37 ℃孵育1 h，PBST洗板。加檢測抗體：加入HA單抗，500 ng/孔，100 μL/孔，37 ℃孵育 1 h，PBST 洗板。加酶標(biāo)二抗：加入HRP羊抗鼠IgG工作液，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，PBST洗板。加顯色液：加入TMB顯色液，100 μL/孔，室溫反應(yīng)10 min。加終止液：加2 mol/L硫酸，50 μL/孔，在酶標(biāo)儀上讀取OD450nm的值。PBS各孔OD450nm值的平均數(shù)+3倍標(biāo)準(zhǔn)差為陰陽性判定的臨界值，OD450nm≥臨界值，判為陽性；OD450nm<臨界值判為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 血凝效價檢測 表達(dá)產(chǎn)物、角轉(zhuǎn)子離心上清、混懸液、純化后表達(dá)產(chǎn)物的血凝效價和體積見表1。超速離心后有血凝活性的物質(zhì)在沉淀中而不在上清中。

表1 被檢樣品血凝效價和體積Tab 1 HA titer and volume of the samples

2.2 電鏡檢測 如圖1所示，電鏡下可見禽流感病毒形態(tài)特點(diǎn)的VLPs，呈圓形或橢圓形，直徑約100 nm，外周有環(huán)形的冠狀刺突。

圖1 純化后樣品電鏡照片F(xiàn)ig 1 Observation of the purified sample by electron microscopy

2.3 Western Blot檢測 用HA、NA、M1抗體分別檢測純化前表達(dá)產(chǎn)物、純化后表達(dá)產(chǎn)物、H5禽流感病毒及HA、NA、M1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。

2.3.1 HA抗體檢測HA蛋白 純化前后的表達(dá)產(chǎn)物、H5禽流感病毒、HA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在70 kD左右有目的條帶，見圖2。H5禽流感病毒HA蛋白的條帶弱，可能因?yàn)榧兹缁顚?dǎo)致抗原表位被部分破壞，未被HA抗體全部識別。表達(dá)產(chǎn)物、H5禽流感病毒、HA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的HA蛋白的分子量有差異，可能因?yàn)楸磉_(dá)的系統(tǒng)不一樣，表達(dá)產(chǎn)物是昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的，HA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品是原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的，而H5禽流感病毒是雞胚擴(kuò)繁制備的。

1：H5禽流感病毒；M：Marker；2：純化后的表達(dá)產(chǎn)物；3：純化前的表達(dá)產(chǎn)物；4：HA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品1: H5 AIV；M: Marker；2: Purified products；3: Unpurified products；4: HA protein圖2 Western Blot檢測HA蛋白Fig 2 Detection of HA protein by Western Blot

2.3.2 NA抗體檢測NA蛋白 純化前后的表達(dá)產(chǎn)物、H5禽流感病毒、NA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在50 kD左右有目的條帶，見圖3。

1：純化前的表達(dá)產(chǎn)物；M：Marker；2：純化后的表達(dá)產(chǎn)物；3：NA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；4：H5禽流感病毒1: Unpurified products；M: Marker；2: Purified products；3: NA protein；4: H5 AIV圖3 Western Blot檢測NA蛋白Fig 3 Detection of NA protein by Western Blot

2.3.3 M1抗體檢測M1蛋白 純化前后的表達(dá)產(chǎn)物、H5禽流感病毒、M1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在27 kD左右有目的條帶，見圖4。

1：H5禽流感病毒；M：Marker；2：純化后的表達(dá)產(chǎn)物；3：純化前的表達(dá)產(chǎn)物；4：M1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品1: H5 AIV；M: Marker；2: Purified products；3: Unpurified products；4: M1 protein圖4 Western Blot檢測M1蛋白Fig 4 Detection of M1 protein by Western Blot

2.4 ELISA檢測 預(yù)實(shí)驗(yàn)研究顯示，表達(dá)產(chǎn)物中有影響ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的物質(zhì)，所以樣品需經(jīng)透析處理。ELISA方法檢測表達(dá)產(chǎn)物、H5 禽流感病毒和HA蛋白、NA蛋白，OD450nm值見表1，經(jīng)計(jì)算樣品陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為0.164。結(jié)果顯示，不同批的表達(dá)產(chǎn)物為陽性，H5禽流感病毒和HA蛋白、NA蛋白均為陰性。結(jié)果說明，表達(dá)產(chǎn)物為同時含有禽流感HA、NA蛋白的VLPs。H5 禽流感病毒的ELISA檢測結(jié)果為陰性，結(jié)合2.3.1的結(jié)果，分析原因可能是甲醛滅活的H5禽流感病毒無法被HA單抗有效識別。

表2 ELISA檢測表達(dá)產(chǎn)物Tab 2 Detection of the products by ELISA

3 討論與結(jié)論

昆蟲細(xì)胞的小規(guī)模和大規(guī)模培養(yǎng)都相對容易，因此，昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成為了最廣泛的應(yīng)用于重組蛋白的常規(guī)生產(chǎn)系統(tǒng)之一[6]。昆蟲細(xì)胞可以折疊、修飾、運(yùn)輸和組裝新合成的多肽，產(chǎn)生高度真實(shí)的可溶性最終產(chǎn)物[6]，因此，將其作為疫苗的抗原生產(chǎn)系統(tǒng)在工藝和抗原性方面均滿足要求。

VLP01株是基于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的含有H5N1亞型禽流感HA、NA、M1基因的重組桿狀病毒，以禽流感疫苗研發(fā)為目的。為確認(rèn)VLP01株表達(dá)產(chǎn)物是禽流感VLPs，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定。角轉(zhuǎn)子超速離心后有血凝活性的物質(zhì)在沉淀中不在上清中，說明有血凝活性的物質(zhì)是可被超離沉淀的、沉降系數(shù)700～800 s的禽流感VLPs，而非沉降系數(shù)小于20 s、不能被超離沉淀的HA蛋白。禽流感病毒形態(tài)上為不規(guī)則球形，100 nm左右，包膜上有兩種糖蛋白，即血凝素和神經(jīng)氨酸酶，這兩類蛋白突出病毒體外，長度約為10～14 nm，直徑6～8 nm，被稱作刺突[7]。電鏡觀察本研究純化后的表達(dá)產(chǎn)物，可見上述大小的病毒樣顆粒及表面的環(huán)形冠狀刺突，說明表達(dá)產(chǎn)物具有禽流感病毒的形態(tài)特點(diǎn)，是禽流感VLPs。HA、NA、M1抗體以Western Blot方法檢測蔗糖密度梯度方法離心純化的表達(dá)產(chǎn)物，可見特異性條帶，說明純化后的表達(dá)產(chǎn)物是同時含有HA、NA、M1蛋白的禽流感VLPs。NA多抗、HA單抗的夾心ELISA檢測表達(dá)產(chǎn)物為陽性，說明表達(dá)產(chǎn)物并非游離的HA蛋白、NA蛋白，而是同時含有HA蛋白、NA蛋白VLPs。

血凝、電鏡、Western Blot、ELISA鑒定均說明VLP01株表達(dá)產(chǎn)物是形態(tài)結(jié)構(gòu)類似禽流感病毒的禽流感VLPs而非游離的HA、NA等蛋白。開展的其他研究顯示，基于VLP01株的禽流感VLPs疫苗在靶動物上一次免疫能夠產(chǎn)生不低于6log2的血凝抑制抗體，并可抵御相同分支的H5N1禽流感病毒的攻擊，不發(fā)病、不排毒，即禽流感VLPs具有禽流感病毒相似的免疫原性。綜上，昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的重組桿狀病毒載體禽流感疫苗有被開發(fā)成為新型禽流感疫苗產(chǎn)品的可能。