土壤中抗生素多殘留污染現(xiàn)狀及前處理方法研究進(jìn)展

陳 晨，李秀波，王宏磊，劉義明

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，國家飼料藥物基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

獸用抗生素可以抑制病原微生物的生長，從而治療在養(yǎng)殖過程中畜禽產(chǎn)生的各種疾病，提高動物性食品的產(chǎn)量與質(zhì)量。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國平均每年約有上千萬噸的獸藥廣泛應(yīng)用于動物疾病治療、預(yù)防和畜禽飼料添加劑等多個(gè)方面。但作為環(huán)境污染物，這些抗生素會有30%～90%以原形或代謝物形式從糞便中排出體外從而被直接施入農(nóng)田[1-2]，且殘留時(shí)間較長，在土壤中進(jìn)行殘留積累[3]。土壤中累積的獸藥一方面會破壞土著微生物菌落，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性細(xì)菌以及耐藥性細(xì)菌，從而使土壤環(huán)境中的抗生素抗性基因豐度增加以及產(chǎn)生耐藥性細(xì)菌[4-5]。國內(nèi)外研究表明，即使是污染較輕的地區(qū)也同樣檢測出含有氟喹諾酮類藥物等大量抗性基因[6-7]。另一方面，抗生素還會聯(lián)合土壤中的其他離子，影響土壤中生物群落的多樣性以及生物學(xué)的功能。形如磺胺甲惡唑與銅離子同時(shí)在土壤中存在的情況下會顯著降低土壤中總磷脂脂肪酸、細(xì)菌磷脂脂肪酸和真菌磷脂脂肪酸的含量[8]。另外土壤中的抗生素還可以通過食物鏈產(chǎn)生生物富集，對人類的健康帶來嚴(yán)重的危害[9]。因此,研究者對獸藥在環(huán)境土壤中的檢測技術(shù)越來越重視，針對復(fù)雜的土壤基質(zhì)開發(fā)出了不同的前處理技術(shù)。本文概述了國內(nèi)外重點(diǎn)地區(qū)的環(huán)境土壤中獸藥污染現(xiàn)狀，同時(shí)系統(tǒng)總結(jié)了近年來土壤樣品中獸藥靶向與非靶向篩查方法的樣品前處理技術(shù)，并對相關(guān)技術(shù)進(jìn)行了比較和展望，以期望促進(jìn)獸藥檢測方法的開發(fā)以及環(huán)境土壤中獸藥含量的檢測。

1 土壤中獸用抗生素的來源

獸用抗生素在所有的抗生素使用中占有很大的比重。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有70%的抗生素使用在畜牧養(yǎng)殖行業(yè)，每年有超過9.7萬噸的抗生素投入畜禽養(yǎng)殖業(yè)中[10-11]。大量獸用抗生素的使用成為環(huán)境土壤中抗生素的主要來源。環(huán)境土壤中獸藥的輸入途徑主要有兩種：一是有機(jī)肥在土壤中直接施肥造成土壤中獸藥抗生素污染；二是使用污染的水資源對農(nóng)田進(jìn)行灌溉。其走向流路可以概括為圖1。

圖1 土壤中獸用抗生素的來源流程圖[23-24]Fig 1 Flow chart of antibiotic source[23-24]

1.1 施肥 隨著集約化養(yǎng)殖環(huán)境的迅速發(fā)展，含有各種抗生素的畜禽糞便量也不斷增加。這些糞便中的抗生素雖然會因?yàn)槎逊实忍幚硎侄谓到庖徊糠諿12]，但是單純的堆放處理抗生素降解不顯著[13-14]，在養(yǎng)殖場的糞便中仍然檢測出大量的抗生素，特別是四環(huán)素類與喹諾酮類。其中環(huán)丙沙星、強(qiáng)力霉素和土霉素的最高含量超過1000 μg/kg[15]。這種被污染的糞便直接施用于土壤或者是經(jīng)過處理制成有機(jī)肥施用于土壤都會造成土壤中獸藥抗生素的殘留，經(jīng)過累計(jì)以及生物鏈的富集，從而流向人體，對人類以及整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生威脅。有研究表明相對于不使用豬糞的土壤，長期使用豬糞的稻田表層土壤中四環(huán)素含量具有明顯的累積現(xiàn)象，濃度范圍為：ND～344.74 μg/kg，且長期使用豬糞會造成稻田表面的抗性基因的豐度顯著升高[16]。

1.2 灌溉 獸藥抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中也廣泛使用[17]。我國很多淡水養(yǎng)殖地區(qū)的養(yǎng)殖水體中已經(jīng)有一定量的磺胺類和喹諾酮類抗生素的殘留，并可能威脅到水生生物的安全[18-19]。其被污染過的水質(zhì)直接流入水體或沉降富集于底泥中造成環(huán)境水的污染[20]，被污染的環(huán)境水資源在對農(nóng)田等進(jìn)行灌溉的時(shí)候就會造成土壤中不同程度的獸藥抗生素累積[21-22]。

2 土壤中獸用抗生素的污染狀況

在我國的各個(gè)區(qū)域內(nèi)的土壤中都不同程度的檢出了獸藥抗生素殘留。其中包括畜禽養(yǎng)殖場周邊土壤、蔬菜基地和城市土壤等。有研究指出城市土壤中的抗生素濃度高于農(nóng)業(yè)土壤[25]。檢出量最多的抗生素有四環(huán)素類、喹諾酮類和磺胺類，有的甚至已經(jīng)超出了獸藥國際協(xié)調(diào)委員會(VICH)籌劃指導(dǎo)委員會提出的土壤抗生素毒害效應(yīng)的觸法值(100 μg/kg)，具有一定的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。但是各個(gè)地方土壤中的抗生素檢出濃度具有較大的差異，發(fā)生重大差異的原因可能是因?yàn)槊總€(gè)地方的施肥與灌溉的習(xí)慣不同。有文獻(xiàn)指出環(huán)境土壤中獸藥抗生素殘留的含量與土壤采集的深度、使用不同動物糞便施肥都有很大的關(guān)系[26]。Gu等指出徐州市畜禽養(yǎng)殖場土壤中氟喹諾酮類抗生素和大環(huán)內(nèi)酯類化合物的總濃度遠(yuǎn)高于磺酰胺類[27]。氟喹諾酮類與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在土壤中降解較慢，吸附性較長，能在土壤中穩(wěn)定的存在。四環(huán)素類抗生素由于其廣譜性與價(jià)格低廉所以廣泛應(yīng)用畜牧養(yǎng)殖業(yè)中，但是這些抗生素不能完全被機(jī)體吸收，而大部分以原形或者代謝產(chǎn)物的形式從體內(nèi)排出，并隨著農(nóng)用最終在土壤中進(jìn)行吸附積累，進(jìn)而危害農(nóng)業(yè)生態(tài)安全。農(nóng)業(yè)土壤中四環(huán)素類抗生素已經(jīng)成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)環(huán)境污染及生態(tài)安全研究的熱點(diǎn)之一。具體的檢出情況如表1所示。

表1 抗生素在環(huán)境土壤中的殘留濃度Tab 1 Residual concentration of antibiotics in Environmental Soil

3 土壤中獸用抗生素的檢測前處理技術(shù)

獸用抗生素殘留的檢測方法主要有免疫分析法與儀器分析法，但是在檢測之前樣品的制備一直作為整個(gè)藥物殘留檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因?yàn)闄z測獸藥殘留的基質(zhì)成分比較復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)影響比較嚴(yán)重，另外藥物以及其代謝產(chǎn)物各種物理化學(xué)性質(zhì)不同，在不同的酸堿濃度下顯示不同的電離特性[39]，從而對前處理的條件要求比較嚴(yán)苛。由于干擾獸藥多殘留分析的原因比較多，且在建立以及優(yōu)化獸藥殘留預(yù)處理方法的時(shí)候，必須考慮減少使用有機(jī)化學(xué)溶劑，從而減少對環(huán)境的污染，除此以外，良好的預(yù)處理方法要盡可能減少其消耗的時(shí)間、精力、以及成本，提高被檢測目標(biāo)的回收率。所以很多年來，藥物多殘留分析中樣品預(yù)處理方法一直是檢測的瓶頸之一。近些年來，因?yàn)槿藗儗ΛF藥殘留含量的關(guān)注度較多，對殘留獸藥的認(rèn)識更加深刻，所以針對獸藥殘留建立了大量的預(yù)處理方法。傳統(tǒng)的預(yù)處理技術(shù)有：固相萃取法、QuEChERS、加速溶劑萃取法、液-液萃取法、索氏提取法、超聲波提取法等。土壤基質(zhì)比較復(fù)雜，其中1%～10%動植物腐爛而形成的土壤腐殖質(zhì)，還有巖石風(fēng)格所形成的礦物質(zhì)。近十年來開發(fā)的方法中使用的提取液大多數(shù)都選擇了EDTA-檸檬酸緩沖液，其在檢測不同土質(zhì)的時(shí)候也僅僅只是優(yōu)化了檸檬酸鹽緩沖液與有機(jī)溶劑。選擇EDTA-Mcllvaine緩沖液提取土壤中抗生素及其降解產(chǎn)物，其原因也是因?yàn)楸苊猥F藥抗生素與金屬離子發(fā)生螯合作用，從而增加獸藥的提取效果。由于土壤基質(zhì)中的干擾物較為復(fù)雜,往往會與待測的喹諾酮類抗生素在霧滴表面離子化過程中產(chǎn)生競爭,進(jìn)而影響電噴霧接口處的離子化效率,即產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。因此，為盡量避免基質(zhì)效應(yīng)降低測定方法的準(zhǔn)確度，樣品的前處理?xiàng)l件優(yōu)化至關(guān)重要。

3.1 固相萃取技術(shù) 固相萃取技術(shù)(solid-phase extraction，SPE)是一項(xiàng)常用的對目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行分離、濃縮、凈化和介質(zhì)交換的同時(shí)具有多功能的樣品預(yù)處理技術(shù)，廣泛用于衛(wèi)生，環(huán)境，制藥，臨床，食品和工業(yè)化學(xué)等領(lǐng)域，目前是土壤中獸藥抗生素多殘留檢測最常用的前處理凈化方法。大多數(shù)研究都使用超聲震蕩提取與該技術(shù)連用，隨后通過SAX與HLB小柱串聯(lián)的前處理方法[40-41]。郭欣妍等利用磷酸鹽緩沖液：乙腈=1∶1超聲萃取，SAX-HLB串聯(lián)固相萃取柱凈化與富集，檢測土壤中喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和內(nèi)酰胺類5類25種抗生素，回收率為51.3%～86.4%。并且串聯(lián)SAX強(qiáng)陰離子交換柱后，土壤樣品的基質(zhì)效應(yīng)降低為75%～160%之間[40]。SUN利用加速溶劑提取與SAX-HLB串聯(lián)固相萃取連用技術(shù)對土壤中的四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類與磺胺類抗生素進(jìn)行提取。多種技術(shù)連用大大減少了土壤基質(zhì)效應(yīng)，回收率均在67.3%～97.4%之間[42]。曹勝男等使用甲醇：EDTA=1∶1溶液提取，超聲提取與SPE凈化，對施糞土壤中四環(huán)素類、喹諾酮類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類4類15種獸藥抗生素進(jìn)行提取，四環(huán)素類的加標(biāo)回收率為73.2%～97.4%，磺胺類為71.7%～108.4%，喹諾酮類為78.1%～112.8%，大環(huán)內(nèi)酯類回收率為81.2%～98.6%[43]。SPE技術(shù)在檢測土壤中獸藥抗生素多殘留的應(yīng)用見表2。

表2 固相萃取技術(shù)在環(huán)境土壤中多類獸藥殘留同時(shí)分析中的應(yīng)用Tab 2 SPE technology in the soil of the veterinary antibiotics residue

續(xù)表

3.2 QuEChERS技術(shù) QuEChERS是Anastassiades等[44]在2003年開發(fā)的一種消耗時(shí)間少，花費(fèi)少的一種新型的前處理技術(shù)。起初應(yīng)用于蔬菜中農(nóng)藥的多殘留檢測，后來因?yàn)椴僮鞣奖?，被引用到獸藥殘留等各個(gè)領(lǐng)域中。QuEChERs前處理技術(shù)可以利用吸附填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互吸引，從而有效地去除檢測物中的有機(jī)酸、糖類、多環(huán)芳烴等成分，使被檢測物質(zhì)回收率良好，該方法在基質(zhì)比較復(fù)雜的土壤獸藥抗生素的檢測中更實(shí)用。QuEChERS技術(shù)與SPE技術(shù)相似，先使用提取液進(jìn)行提取，而后進(jìn)行濃縮，與SPE技術(shù)的不同之處在于它選用的是合適的具有吸附作用的QuEChERS鹽包作為吸附劑，例如C18粉[45]，石墨烯、碳納米材料等，對藥物或者雜質(zhì)進(jìn)行吸附，使被檢測物回收率提高的同時(shí)減少基質(zhì)效應(yīng)所產(chǎn)生的影響。有研究表明，相比于固相萃取技術(shù)，QuEChERs更加方便，同時(shí)回收率更好[46]。使用QuEChERs檢測土壤中磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、林可胺類，其在添加范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，而且回收率都可以達(dá)到61%～118%[46-49]。在進(jìn)行土壤中獸藥抗生素等多殘留分析時(shí)，除了環(huán)丙沙星、馬波沙星等氟喹諾酮類、莫能菌素回收率很低以外，其他抗生素使用QuEChERS提取的結(jié)果均優(yōu)于加壓萃取技術(shù)。且相比于加壓萃取技術(shù)，QuEChERS更適合分析大環(huán)內(nèi)酯類阿奇霉素和替米考星、硝基咪唑類、四環(huán)素類和鏈霉素維吉尼亞霉素[50]。QuEChERS技術(shù)在檢測土壤中獸藥抗生素多殘留的應(yīng)用見表3。

表3 QuEChERS技術(shù)在環(huán)境土壤中多類獸藥殘留同時(shí)分析中的應(yīng)用Tab 3 QuEChERS technology in the soil of the veterinary antibiotics residue

QuEChERs凈化技術(shù)在檢測其他基質(zhì)的獸藥多殘留方面已有應(yīng)用報(bào)道，但目前在土壤基質(zhì)中同時(shí)檢測多類藥殘留方面的研究不多。但其操作簡單，回收率好，重復(fù)程度好，其在未來將很好的應(yīng)用于土壤中獸藥抗生素的檢測。

3.3 液-液萃取技術(shù) 液-液萃取技術(shù)(liquid-liquid extraction，LLE)主要通過目標(biāo)待測物質(zhì)在不同的兩種液體中的溶解度不同而提取，其具有提取和凈化兩種作用。陳海燕等利用0.1 mol/L氫氧化鈉：甲醇=5∶5提取，二氯甲烷萃取，經(jīng)過高效液相色譜-熒光檢測器檢測土壤中三種磺胺類的獸藥抗生素，回收率為74.17%～104.35%，同時(shí)檢測線可以達(dá)到2.5 μg/kg[51]。另外還有SUN[52]使用LLE技術(shù)檢測土壤中的喹諾酮類抗生素，其回收率也都大于90%，且批內(nèi)與批間變異均不超過5%。但是相對于其他的前處理方法，液-液萃取技術(shù)在進(jìn)行土壤中獸藥抗生素多殘留檢測時(shí)，一般僅僅適用于同一類的獸藥抗生素，目前針對土壤中多類多種獸藥抗生素的檢測使用液-液萃取技術(shù)的鮮有人研究。況且液-液萃取需要較多的有機(jī)試劑，這對環(huán)境會造成更進(jìn)一步的破壞。

3.4 加速溶劑萃取技術(shù) 加速溶劑萃取(accelerated solvent extraction，ASE)又稱加壓液相萃取(PLE)，其全自動程度很高，可以連續(xù)的進(jìn)行提取過濾。在高溫高壓的條件下，提高目標(biāo)獸藥抗生素在提取劑中的溶解度，從而提高前處理的回收率。孫寶利等建立了一種ASE-HPLC-MS/MS檢測方法用于測定土壤中四環(huán)素類抗生素殘留含量，回收率均在60.1%～103.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.6%～4.8%之間[53]。楊靜等聯(lián)合加速溶劑萃取與固相萃取技術(shù)，檢測土壤中的6種喹諾酮類的抗生素，將基質(zhì)效應(yīng)因子控制在0.84～1.04之間，且回收率在60.9%～89.9%，很好的減少了土壤基質(zhì)對質(zhì)譜檢測器產(chǎn)生干擾問題[54]。Marie-Virginie Salvia[55]利用甲醇∶乙腈∶0.2M檸檬酸(pH=4.5)=40∶40∶20(V/V/V)提取液，經(jīng)過快速溶劑萃取，利用LC-MS/MS檢測土壤中喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素，回收率喹諾酮類>87%，但是四環(huán)素類回收率在在25.4%～41.7%之間。所以快速溶劑萃取技術(shù)比較適用于檢測土壤中同一類的獸藥抗生素。但是同時(shí)檢測多類的抗生素時(shí)，效果不是很理想。

4 展 望

環(huán)境土壤中的抗生素殘留檢測技術(shù)還處于正在發(fā)展的階段，面臨著一系列的問題。常用的檢測手段有理化檢測手段分析與免疫檢測。在市面上常見的快檢方法ELISA、膠體金等使用針對一種靶標(biāo)物的檢測，不能滿足對多獸藥殘留的高通量多元分析要求。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法雖然靈敏度高，但是實(shí)驗(yàn)室條件要求比較高，操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本比較高，盡管在多殘留檢測手段中出現(xiàn)了定量檢測的生物芯片技術(shù)，達(dá)到樣品前處理的集成化以及操作靈敏度與特異性來說相對較好，但是液質(zhì)聯(lián)用仍然是現(xiàn)階段最常用的技術(shù)。本文針對近十年土壤中抗生素的檢測方法相互比較，從前處理的提取液、前處理技術(shù)等多方面進(jìn)行闡述。土壤中獸藥抗生素的檢測現(xiàn)狀：一是開發(fā)優(yōu)化的方法比較單一，大多數(shù)開發(fā)方法還集中于提取液以及萃取技術(shù)的優(yōu)化；二是現(xiàn)在大多數(shù)的環(huán)境中獸藥抗生素的檢測方法還都處于靶向的檢測，針對非靶向檢測技術(shù)還不成熟，因?yàn)橥寥乐械墨F藥種類復(fù)雜，含量較多。所以非靶向的檢測技術(shù)的發(fā)展有利于環(huán)境中土壤中的抗生素含量的檢測，非靶向的檢測技術(shù)的發(fā)展就需要非靶向的譜圖庫的建立。

綜上所述，高分辨質(zhì)譜是環(huán)境土壤中抗生素檢測的強(qiáng)有力的工具，但是在該檢測技術(shù)下還需要更多的研究：①高分辨質(zhì)譜分析技術(shù)在環(huán)境水樣品中已經(jīng)開始逐漸發(fā)展，但是在土壤中的環(huán)境檢測還鮮有報(bào)道，所以使用高分辨質(zhì)譜對土壤樣品的前處理凈化過程還需要進(jìn)一步發(fā)展探索，同時(shí)在前處理過程中考慮多種提取凈化步驟連用是將來的發(fā)展趨勢；②高分辨的非靶向技術(shù)在環(huán)境中已經(jīng)開始發(fā)展起來，國內(nèi)已經(jīng)發(fā)布了關(guān)于高分辨質(zhì)譜檢測水環(huán)境中獸藥的國家標(biāo)準(zhǔn)[69]，但是在土壤中的關(guān)注度還是比較低，所以高分辨質(zhì)譜的檢測技術(shù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定，或者是非靶向的抗生素篩查將是未來發(fā)展的方向。