八珍湯促宮頸成熟分子機制和生物通路的網(wǎng)絡(luò)藥理學研究

鄭丹如，盧海霞，許祿華，任利容△

1廣州中醫(yī)藥大學附屬深圳市寶安中醫(yī)院，廣東 深圳518101；2南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院

如何安全有效地終止妊娠，提高自然分娩率，降低剖宮產(chǎn)率，一直是產(chǎn)科關(guān)注的熱點課題。妊娠晚期由于妊娠期糖尿病、子癇前期、妊娠合并病毒性肺炎等并發(fā)癥，導(dǎo)致為保證母嬰安全而不得不適時終止妊娠［1］。目前，新型冠狀病毒感染孕產(chǎn)婦管理策略建議指出，對于妊娠合并病毒性肺炎的孕婦，若已足月，建議多學科診療，適時終止妊娠，如宮頸條件好，無陰道試產(chǎn)禁忌癥，可經(jīng)陰道分娩。若宮頸不成熟，則需通過藥物或機械刺激促進宮頸成熟，誘發(fā)子宮收縮，以幫助產(chǎn)婦盡早經(jīng)陰道分娩［2-4］。宮頸成熟的機制尚不明確，目前認為是多種因素綜合作用的結(jié)果，公認的學說有“炎癥反應(yīng)學說”“內(nèi)分泌控制理論”“機械性刺激”“子宮功能性改變”［5］。臨床主要通過靜脈滴注催產(chǎn)素、陰道用前列腺素類藥物、宮頸球囊擴張等機械性刺激或口服中藥來促進宮頸成熟。

《婦人大全良方》中提到“婦人以血為主，氣順則血和，胎安則順產(chǎn)”，氣血對婦女妊娠起重要作用。妊娠婦女易出現(xiàn)氣血不足，影響分娩。八珍湯具有氣血雙補，益胃健脾的功效，《傅青主女科》將八珍湯用于“催生”。傅氏認為：“催生者，因坐草太早，困倦難產(chǎn)，用八珍湯，稍佐以香附、乳香，以助血氣。胞衣早破，漿血己干，亦用八珍湯”［6］。近年來被用于促進宮頸成熟，并取得了良好的臨床療效［7-8］，且有利于產(chǎn)婦產(chǎn)后恢復(fù)。

2007年，“網(wǎng)絡(luò)藥理學（network pharmacology）”的概念由英國鄧迪大學藥理學家Hopkins在《自然生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）雜志中首次系統(tǒng)闡述［9］，它基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)，運用專業(yè)的算法和可視化網(wǎng)絡(luò)分析軟件，對現(xiàn)有的疾病數(shù)據(jù)庫、藥物數(shù)據(jù)庫等數(shù)據(jù)庫信息進行虛擬篩選和網(wǎng)絡(luò)預(yù)測［10］，系統(tǒng)地評價藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，網(wǎng)絡(luò)藥理學具有整體性、系統(tǒng)性特點，與中醫(yī)藥“整體觀”和“辨證論治”原則一致，目前已被廣泛應(yīng)用于中藥研究。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，本研究將從“成分-靶點-通路”多層面預(yù)測八珍湯促進宮頸成熟的生物過程和生物通路，為其進一步藥理學研究及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 八珍湯藥物有效化學成分和對應(yīng)靶點收集在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫［11］（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中以“人參、白術(shù)、茯苓、甘草、熟地黃、白芍、當歸、川芎”為檢索詞，并根據(jù)ADME參數(shù)設(shè)定篩選規(guī)則：OB≥30%，DL≥0.18，檢索得到八珍湯藥物有效化學成分和藥物靶點，進一步篩選獲得有效成分對應(yīng)的靶點基因信息，最后通過Uniprot數(shù)據(jù)庫［12］（http：//www.uniprot.org/）對基因進行注釋，轉(zhuǎn)化為統(tǒng)一的Swiss-Prot ID（檢索時間：2020年2月1日）。見表1。

表1 八珍湯藥物部分化學成分基本信息

1.2 促宮頸成熟的相關(guān)靶點收集在人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards[13]，https://www.genecards.org/）、孟德爾人類遺傳數(shù)據(jù)庫（online Mendelian inheritance in man，OMIM[14]，http://www.omim.org/）、DiGSeE[15]（http://210.107.182.61/geneSearch/）、Drug Bank 5.1.5[16]（http://www.drugbank.ca/更新于2020年1月3日）和治療靶標數(shù)據(jù)庫（Therapeutic target database，TTD［17］，http：//db.idrblab.net/ttd/）5個疾病相關(guān)基因庫中分別以“cervical maturing/ripening”為檢索詞檢索疾病相關(guān)基因靶點（檢索時間：2020年2月2日），匯總各大數(shù)據(jù)庫搜索得到的疾病相關(guān)基因靶點，剔除重復(fù)基因，導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫［12］（http：//www.uniprot.org/），統(tǒng)一將基因-蛋白名稱轉(zhuǎn)化為Swiss-Prot ID。

1.3 八珍湯促宮頸成熟的PPl網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建整理獲得疾病靶點基因與藥物成分靶點并進行映射，得到八珍湯促宮頸成熟潛在作用靶標，繪制Venn圖。將得到的藥物-疾病交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫［18］（http：//string-db.org/，Version11.0），物種選擇設(shè)定為“Homo sapiens”，并進行置信度得分（confidence coefficient）篩選，以評估配體間匹配程度的可靠性，設(shè)定confidence coefficient≥0.900，標準區(qū)間為［0，1］，≥0.9為可靠性最高，0.7～0.9為可靠性高，≥0.4為可靠性中等，≤0.15為可靠性低。active interaction sources設(shè)定為Text mining、Experiments、Databases、Coexpression、Neighborhood、Gene Fusion、Cooccurrence，剔除游離點后導(dǎo)出網(wǎng)絡(luò)圖和數(shù)據(jù)。

1.4 “促宮頸成熟-基因-靶點-八珍湯有效成分”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和拓撲結(jié)構(gòu)分析通過Cytoscape3.7.2軟件［19］的“Network Analyzer”功能［20］，對八珍湯促宮頸成熟進行中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，并獲得相關(guān)參數(shù)，如平均最短路徑長度（average shortest path length）和接近中心性（betweenness centrality），節(jié)點的平均最短路徑長度越小，接近中心性越大，表明該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要［21］。導(dǎo)出網(wǎng)絡(luò)圖和數(shù)據(jù)，篩選出關(guān)鍵藥物有效成分和靶標。

1.5 GO和KEGG通路富集分析利用Cytoscape3.7.2中Clue GO插件，對關(guān)鍵靶點進行GO和KEGG富集分析。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入，分別選擇“Biological Process（生物過程）”“Cellular Component（細胞成分）”“Molecular Function（分子功能）”和“KEGG-Pathway（KEGG通路分析）”進行分析，得到相關(guān)數(shù)據(jù)，保存結(jié)果，并將所得結(jié)果按照qvalue排列，綜合“%Associated Genes”“Number Gene”等指標篩選可能與促宮頸成熟相關(guān)的排名靠前的生物過程和通路。

2 結(jié)果

2.1 八珍湯藥物有效化學成分和對應(yīng)靶點設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18，檢索和篩選后共獲得160個有效化學成分，其中人參22個，白術(shù)7個，茯苓15個，甘草92個，熟地黃2個、白芍13個，當歸2個，川芎7個，部分有效化學成分的基本信息見表1；檢索得到1690個有效成分對應(yīng)靶點基因，其中人參193個，白術(shù)18個，茯苓18個，甘草1265個，熟地黃29個、白芍84個，當歸52個，川芎31個，匯總所有藥物靶點基因并剔除重復(fù)靶點基因，得214個基因。

2.2 促宮頸成熟相關(guān)靶點和“藥物-疾病”靶點交集以“cervical maturing”為檢索詞檢索5個數(shù)據(jù)庫，剔除重復(fù)基因靶點，共獲得4276個疾病基因靶點。將上一步得到的八珍湯藥物靶點和宮頸成熟的靶點進行映射，取兩者交集，可得八珍湯促宮頸成熟相關(guān)靶點基因，共175個，并繪制Venn圖，見圖1。

圖1 “疾病-藥物”韋恩圖

2.3 八珍湯促宮頸成熟的PPl網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析175個有效成分靶標經(jīng)STRING數(shù)據(jù)庫檢索和篩選得到702個蛋白-蛋白相互作用的靶蛋白，預(yù)測相互作用靶蛋白217個，網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點連接度的中位數(shù)為8.02，網(wǎng)絡(luò)p-value＜1.0e-16，平均局部聚類系數(shù)0.486。見圖2。

2.4 “促宮頸成熟-基因-靶點-八珍湯有效成分”網(wǎng)絡(luò)將有效成分靶標和靶蛋白數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，利用其網(wǎng)絡(luò)分析工具Network Analyzer進行網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析。連接節(jié)點數(shù)越多，圓點直徑越大，顏色越深；連接節(jié)點數(shù)越少，圓點直徑越小，顏色越淺。圓圈中心為促宮頸成熟，內(nèi)圈為八珍湯八味藥物，中間為藥物有效成分，外圈為靶標基因。剔除最小圓點，獲得46個關(guān)鍵藥物有效成分和34個靶點，根據(jù)平均最短路徑長度（average shortest path length）和接近中心性（betweenness centrality），篩選出關(guān)鍵藥物化學成分16個和關(guān)鍵靶標14個。提示八珍湯中甘草、人參和白芍在促宮頸成熟中發(fā)揮的作用可能較其他藥物大；化學成分β-谷固醇（beta-sitosterol）、芒柄花黃素（formononetin）、谷甾醇（sitosterol）、山柰酚（kaempferol）、原阿片堿（fumarine）等及靶標前列腺素過氧化物合酶2（prostaglandinendoperoxide synthase 2,PTGS2）、雌激素受體（estrogen receptor,ESR1）、雄激素受體（androgen receptor,AR）、腎上腺素能受體2（adrenrgic receptor 2,ADRB2）、核受體輔激活蛋白2（nuclear receptor coactivator 2,NCOA2）等在促宮頸成熟中發(fā)揮重要作用。見圖3、表2—3。

圖3 “促宮頸成熟-藥物-活性成分-基因”網(wǎng)絡(luò)模型

表2 16個關(guān)鍵化學成分的接近中心性和平均最短路徑長度

表3 14個關(guān)鍵靶標的接近中心性和平均最短路徑長度

2.5 八珍湯促宮頸成熟的GO富集分析Biological Process結(jié)果提示，共表達基因主要參與了對含氧化合物的反應(yīng)、對脂質(zhì)的反應(yīng)、細胞對含氧化合物的反應(yīng)、對有機循環(huán)化合物的反應(yīng)、對激素的反應(yīng)、積極調(diào)控多細胞生物過程、細胞群增殖的調(diào)節(jié)、積極調(diào)控細胞增殖等生物過程；Cellular Component結(jié)果提示，共表達基因主要涉及膜微結(jié)構(gòu)、膜筏、突觸前膜固有成分、突觸前膜組成部分等細胞組分；Molecular Function結(jié)果提示，共表達基因具有激酶結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、激酶活性正調(diào)控、蛋白激酶活性的正調(diào)控、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的正調(diào)控等分子功能。見表4。

表4 八珍湯促宮頸成熟GO富集分析

2.6八珍湯促宮頸成熟的KEGG通路富集分析通過Cytoscape 3.7.2中Clue GO插件對八珍湯促宮頸成熟的關(guān)鍵靶點進行KEGG通路的富集分析，篩選前10條通路（qvalue從小到大進行排序）。KEGG通路富集分析結(jié)果：八珍湯有效成分可作用于催乳素信號通路（prolactin signaling pathway）、雌激素信號通路（estrogen signaling pathway）、催產(chǎn)素信號通路（oxytocin signaling pathway）、松弛素信號通路（relaxin signaling pathway）等內(nèi)分泌信號相關(guān)通路；白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）信 號 通路、MAPK signaling pathway（絲裂原活化蛋白激酶信號通路）等免疫炎癥相關(guān)信號通路；腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信 號 通 路、PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt信號通路）等多條信號通路。見表5。

表5 八珍湯促宮頸成熟關(guān)鍵靶標的通路富集分析

3 討論

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學將八珍湯有效化學成分及其對應(yīng)的靶標和基因，與促宮頸成熟的生物分子學信息進行網(wǎng)絡(luò)映射，獲得兩者關(guān)聯(lián)的靶基因175個；繼而應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫及Cytoscape軟件對八珍湯與促宮頸成熟之間的關(guān)系進行機制性計算和可視化分析，得到16個關(guān)鍵化學成分：β-谷固醇、芒柄花黃素、谷甾醇、山柰酚、原阿片堿等，14個 關(guān) 鍵 靶 標：PTGS2、ESR1、AR、ADRB2、NCOA2、PTGS1、NOS2、PPARG、ESR2、PGR、MAPK14、CCNA2、CHEK1、RXRA，最后進行GO和KEGG富集分析，獲得其作用的生物過程、細胞成分、分子功能和生物通路。

靶標PTGS2、MAPK主要通過IL-17、TNF、白細胞跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)移等炎癥免疫信號通路促宮頸成熟，ESR1、ESR2、NCOA2、NCS2、PGR、MAPK主要通過雌激素、孕激素、松弛素、催乳素等內(nèi)分泌信號通路促宮頸成熟，RXRA通過PI3K-Akt、脂肪細胞因子等信號通路進行調(diào)節(jié)，MAPK則與上述通路中均產(chǎn)生作用，參與促宮頸成熟的調(diào)控。

“KEGG通路富集分析”結(jié)果顯示，八珍湯促宮頸成熟涉及雌激素、催乳素、催產(chǎn)素信號通路等激素信號通路和IL-17信號通路、白細胞跨內(nèi)皮遷移、Toll樣受 體（Toll like receptor，TLR）、MAPK、T細胞等信號通路。宮頸成熟是多種因素作用的結(jié)果。雌激素、孕激素、催產(chǎn)素等體內(nèi)與妊娠相關(guān)的激素信號通路的增強，導(dǎo)致雌激素、孕激素等激素水平上升，促進分娩啟動［22］。宮頸成熟類似于炎癥反應(yīng)，由多種炎癥因子參與，通過白細胞跨內(nèi)皮遷移和雌激素信號通路，雌激素誘導(dǎo)白細胞遷移進入組織，促進啟動體內(nèi)非感染性炎癥反應(yīng)，引起宮頸重塑和分娩［23］。MAPK信號通路是由雌激素和促炎化合物激活的質(zhì)體受體介導(dǎo)，研究表明，MAPK激活對分娩前宮頸成熟起重要作用，它可以使子宮頸基質(zhì)和平滑肌及c-Jun顯著增加，宮頸張力增強［24］。Toll樣受體信號通路被激活后啟動促炎因子如白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）、TNF等的釋放，通過前列腺素（PGs）誘發(fā)子宮收縮和宮頸成熟。MMPs是一種水解蛋白酶大家族，可降解細胞外很多中基質(zhì)蛋白，目前認為MMPs是宮頸成熟和分娩啟動的重要中間環(huán)節(jié)，炎癥因子的釋放激活MMPs系統(tǒng)使得宮頸細胞外基質(zhì)蛋白水解而軟化和成熟［25］，MMPs主要通過IL-17、TNF、雌激素、松弛素等信號通路被激活。松弛素在生殖系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，在妊娠足月時通過松弛素信號通路擴張外周血管，提高胎盤血供，松弛盆腔結(jié)締組織以利于分娩［26］。

八珍湯促宮頸成熟作用是多角度、多層次的，主要表現(xiàn)在靶標本身具有多維調(diào)控的特點，另一方面，靶標間交互錯雜，相互作用和影響。目前已發(fā)現(xiàn)的機制表明，宮頸成熟是多方面因素作用的結(jié)果，涉及非感染性炎癥反應(yīng)、體內(nèi)雌孕激素、催產(chǎn)素、泌乳素、松弛素等激素水平等。上述網(wǎng)絡(luò)富集結(jié)果表明，這些靶標在網(wǎng)絡(luò)中通過雌激素、催乳素、催產(chǎn)素、松弛素等內(nèi)分泌激素生物通路和IL-17、白細胞跨內(nèi)皮遷移、T細胞等炎癥發(fā)生相關(guān)生物通路和其他通路效應(yīng)作用共同對宮頸成熟非感染性炎癥反應(yīng)、激素水平和功能變化等多方面進行調(diào)控。

中醫(yī)學認為，氣血對妊娠起重要作用，氣血的充足有利于妊娠和分娩，宮頸的成熟是分娩啟動的重要一環(huán)。八珍湯為中醫(yī)名方，有著“補益氣血，益胃健脾”功效，《傅青主女科》用八珍湯“催生”，傅氏認為：“催生者，因坐草太早，困倦難產(chǎn)，用八珍湯，稍佐以香附、乳香，以助血氣。胞衣早破，漿血己干，亦用八珍湯”［6］。方中人參與熟地黃為君藥，人參甘溫，大補五臟元氣，補氣生血，熟地黃補血滋陰；臣以白術(shù)補氣健脾，當歸補血和血、潤腸通便；佐用茯苓健脾養(yǎng)心，白芍養(yǎng)血斂陰，川芎活血行氣，以使補而不滯；甘草益氣和中。這八味藥物，化學成分復(fù)雜，具有不同的組合形式，藥物間的組合可能產(chǎn)生新的作用，故利用網(wǎng)絡(luò)藥理學構(gòu)建“促宮頸成熟-基因-靶點-八珍湯有效成分”網(wǎng)絡(luò)，揭示其可能在干預(yù)宮頸成熟相關(guān)生物分子和基因表達方面發(fā)揮整體調(diào)節(jié)作用，這與中醫(yī)“整體”觀念一致。孕期由于胎兒的消耗，孕婦貧血的發(fā)病率遠高于非孕婦［27-28］，基于以上提出對本方對應(yīng)的“氣血兩虛”證型進行生物分子網(wǎng)絡(luò)研究和方證對應(yīng)研究的假設(shè)，或可預(yù)測相關(guān)的臨床生物標志，使其有更大的臨床轉(zhuǎn)換價值。

另一方面，甘草與宮頸成熟的交集基因最多，關(guān)鍵化學成分主要為甘草、人參、當歸、白芍、川芎、熟地黃的化學成分，提示這幾味中藥可能在促宮頸成熟方面較其他藥物發(fā)揮更重要的作用。結(jié)合中醫(yī)方劑“君臣佐使”組方規(guī)則看，佐藥甘草有多個關(guān)鍵化學成分可通過多條生物通路促宮頸成熟，君藥人參和佐藥白芍、當歸亦有多個有效化學成分在促宮頸成熟中發(fā)揮重要作用?；诖颂岢鰧υ剿幬镉昧勘壤恼{(diào)整對促宮頸成熟療效影響的假設(shè)，進行科學合理的實驗驗證，則可利用發(fā)現(xiàn)的規(guī)律對促宮頸成熟的組方用藥用量進行進一步理性設(shè)計，使其有更大的臨床轉(zhuǎn)換價值。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學對八珍湯促宮頸成熟的生物通路和效應(yīng)機制進行預(yù)測和分析尚存在不足之處，如中藥藥物化學成分數(shù)據(jù)庫、促宮頸成熟的關(guān)鍵基因數(shù)據(jù)庫等有待進一步更新和完善，依賴中醫(yī)藥基礎(chǔ)與臨床研究數(shù)據(jù)的積累、計算與實驗方法等技術(shù)方法尚待完善，因此本研究結(jié)果尚不能全面、真實地揭示八珍湯復(fù)雜的效應(yīng)機制。