芪麝丸對(duì)背根節(jié)神經(jīng)元COX2-PGE2-EP信號(hào)通路影響的體外研究*

陳蘋華，唐占英，劉 丹，袁薇娜，李 攀，胡志俊

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海230000

神經(jīng)根型頸椎病往往是由頸背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）或脊神經(jīng)后根（dorsal root，DR）受到傷害性刺激所產(chǎn)生的以疼痛、麻木為主的綜合征，有學(xué)者[1]曾采用WHOQOL-BREF量表（世界衛(wèi)生組織生活質(zhì)量測(cè)定量表簡(jiǎn)表）追蹤調(diào)查了神經(jīng)根型頸椎病患者不同維度的生活質(zhì)量，研究發(fā)現(xiàn)生理領(lǐng)域得分最低，并且隨著病程的延長(zhǎng)，其得分越低，由此可見，神經(jīng)根受壓所帶來的一系列癥狀，如頸部伴上肢的麻木、疼痛、感覺異常等嚴(yán)重并長(zhǎng)期影響著人們的生活質(zhì)量。其病理變化多為脊神經(jīng)節(jié)受到機(jī)械壓迫或炎性因子刺激等而引起的缺血、水腫等神經(jīng)功能異常，屬于根性神經(jīng)痛的一種。DRG在根性神經(jīng)痛中起不可或缺的作用。DRG神經(jīng)元不僅可以自身釋放炎性介質(zhì)，存在于其膜上的離子通道也介導(dǎo)痛覺異常的發(fā)生發(fā)展。芪麝丸是基于施杞教授提出的“以氣為主、以血為先”的理論而研發(fā)的中成藥，由黃芪、川芎、人工麝香、青風(fēng)藤、防己和人工牛黃為主要成分制成，主要用于治療氣虛血瘀型神經(jīng)根型頸椎病。本研究基于環(huán)氧合酶2-前列腺素E2的受體（cyclooxygenase 2-prostaglandin E2-E-prostanoid，COX2-PGE2-EP）信號(hào)通路探究芪麝丸對(duì)DRG的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證芪麝丸對(duì)根性神經(jīng)痛的臨床療效。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠1周齡（雌雄不限），體質(zhì)量（23±3）g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：2007000542991，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所合格證號(hào)：上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室（SYXK滬2003-0002）。

1.2 藥物芪麝丸（上海黃海制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：161101，規(guī)格：25丸/袋）。

1.3 主要試劑DMEM/F-12培養(yǎng)基（1∶1）（上海源培生物科技股份有限公司，F(xiàn)40515/L320KJ）；0.25%胰蛋白酶EDTA溶液（上海源培生物科技股份有限公司，CA4061/S310KJ）；青霉素-鏈霉素溶液（碧云天生物技術(shù)有限公司，100X，1709239/030311B）；阿糖胞苷（Macklin公司）；胎牛血清（Gibco公司，1715752/10099141）；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α，上海鑫樂生物，1707JZ31rMH/xlEr0359）；Super Script VILO cDNA Synthesis Kit、PowerUp SYBR Green Master Mix（vazyme，7E252D8/R12301）；Pierce BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒A/B（日本TaKaRa公司，A4801A/T9300A1、A1101B/T9300A2）；PTGS2(COX-2)Antibody COX2抗體（boster公司，31296I11P56/ba0738）；Anti-Prostaglandin E Receptor EP4抗體（abcam公司，GR2738291/ab93486）。

1.4 主要儀器SZX7型體視顯微鏡（Olympus奧林巴斯公司）；HFsafe-1500LC型生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；371型CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司）；TDZ5-WS型臺(tái)式低速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；IX73型倒置相差顯微鏡（Olympus奧林巴斯公司）；ViiA7型熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司）；Spectramax plus384型酶標(biāo)儀（江蘇美達(dá)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）；AI600型Western掃膜系統(tǒng)（General Electric公司）。

1.5 芪麝丸藥液的配制將芪麝丸與DMEM/F-12培養(yǎng)基按照1 g/2 mL的比例加入到2 mL離心管中，勻漿機(jī)中勻漿，并充分混勻；37℃條件下水浴2 h；4℃冰箱內(nèi)靜置24 h；過200目，70 μm的細(xì)胞過濾器過濾除菌，制成母液，濃度為50%，分裝保存于-20℃的冰箱內(nèi)。

1.6 芪麝丸藥液濃度的篩選收集背根節(jié)神經(jīng)元，分別加入0.5%、0.35%、0.25%和0.1%4個(gè)濃度梯度的芪麝丸藥液，結(jié)果顯示0.35%的芪麝丸對(duì)背根節(jié)神經(jīng)元的毒性作用小，可以有效抑制DRG神經(jīng)元中COX2-PGE2-EP信號(hào)通路中環(huán)氧合酶2的信使核糖核酸(cyclooxygenase 2 messenger RNA，COX2 mRNA）、EP2 mRNA、EP4 mRNA和 環(huán) 氧合酶2(cyclooxygenase，COX2）蛋白、EP4蛋白的表達(dá)，故本實(shí)驗(yàn)選擇最佳濃度為0.35%的芪麝丸藥液。

1.7 背根節(jié)取材、培養(yǎng)與分組

1.7.1 背根節(jié)取材與培養(yǎng)1）無(wú)菌條件下解剖并游離大鼠脊柱，沿著脊柱前、后正中線剖開成兩部分，并向兩側(cè)翻開；2）在體視顯微鏡（40×）下，輕牽拉脊髓翻向外側(cè)，可在脊柱內(nèi)部側(cè)方的凹槽內(nèi)發(fā)現(xiàn)一膨大結(jié)構(gòu)，即DRG；3）分離周圍組織，盡可能留下膨大部分，即得到完整的背根節(jié)；4）用0.25%胰蛋白酶EDTA消化，接種于6孔板中，標(biāo)記為對(duì)照組、模型組和芪麝丸組，放入36℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。定時(shí)換液，培養(yǎng)48 h后加入10 μmol/L的阿糖胞苷溶液純化，第7天時(shí)收集細(xì)胞備用。

1.7.2 分組將培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元分為對(duì)照組、模型組和芪麝丸組。對(duì)照組不施加干預(yù)因素；模型組加入100 ng/mL的TNF-α溶液；芪麝丸組加入100 ng/mL的TNF-α溶液及0.35%的芪麝丸藥液。

1.8 檢測(cè)指標(biāo)

1.8.1 背根節(jié)COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA的檢測(cè)制備并分選背根節(jié)神經(jīng)元，接種于6孔板中，各組干預(yù)后于第7天收集細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，PCR法）檢測(cè)COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA的表達(dá)。

1.8.2 背根節(jié)COX2蛋白、EP2蛋白、EP4蛋白的檢測(cè)制備并分選背根節(jié)神經(jīng)元，接種于6孔板中，各組干預(yù)后于第7天收集細(xì)胞，采用蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）法檢測(cè)COX2蛋白、EP4蛋白的表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，在正態(tài)性和方差齊性下采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），以±s表示，組間比較采用LSD法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不滿足條件的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)，以中位數(shù)M表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 離體培養(yǎng)的背根節(jié)神經(jīng)元對(duì)照組DRG神經(jīng)元胞體較大，呈橢圓形，胞體中間顏色深，邊緣顏色較淡，呈透明狀光暈樣；DRG神經(jīng)元有的呈單個(gè)散在分布，有的聚集成島狀；DRG神經(jīng)元發(fā)出神經(jīng)纖維軸突較粗，相互連接交互形成神經(jīng)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；散見少量呈紡錘形的雪旺細(xì)胞以及形狀不規(guī)則的成纖維細(xì)胞。模型組加入100 ng/mL TNF-α溶液后，DRG神經(jīng)元發(fā)出的神經(jīng)軸突聚集成簇狀分布，神經(jīng)元胞體也聚集成島狀，數(shù)目相對(duì)減少；加入中藥芪麝丸藥液后，DRG神經(jīng)元胞體多呈串珠樣分布，胞體顏色加深，神經(jīng)纖維網(wǎng)絡(luò)較前稀疏，但神經(jīng)纖維增粗。見圖1。

圖1 各組DRG神經(jīng)元變化情況

2.2 各組背根節(jié)神經(jīng)元中COX2-PGE2-EP信號(hào)通路表達(dá)情況模型組中COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA的表達(dá)均有所增加，COX2蛋白和EP4蛋白表達(dá)上調(diào)；與對(duì)照組比較，COX2 mRNA的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），EP4蛋白表達(dá)差異顯著（P＜0.01）；EP2 mRNA、EP4 mRNA、COX2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示TNF-α成功誘導(dǎo)背根節(jié)神經(jīng)元發(fā)生“炎癥性改變”。與模型組比較，芪麝丸組DRG神經(jīng)元中COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA表達(dá)下降，其中COX2 mRNA表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，芪麝丸組DRG神經(jīng)元中COX2蛋白和EP4蛋白含量有所降低，其中EP4蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1、圖2—3。

表1 各組背根節(jié)神經(jīng)元COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA、COX2蛋白和EP4蛋白的表達(dá)情況（±s）

表1 各組背根節(jié)神經(jīng)元COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA、COX2蛋白和EP4蛋白的表達(dá)情況（±s）

注：與對(duì)照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.05，△表示P＞0.05

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圖2 對(duì)照組與模型組大鼠DRGns中蛋白表達(dá)

3 討論

根性神經(jīng)痛是臨床常見的一種病情復(fù)雜、反復(fù)發(fā)作的慢性疼痛類疾病。主要是由于DRG或DR受到傷害性刺激而產(chǎn)生疼痛癥狀，往往由于脊神經(jīng)后根，特別是脊神經(jīng)節(jié)受到機(jī)械壓迫或炎性因子刺激而引起的一種病理變化。

無(wú)論是椎間盤突出［2］、腫瘤壓迫占位或者是外周神經(jīng)炎癥反應(yīng)等，都能夠造成DRG和DR損傷，受損的DRG和DR可在局部產(chǎn)生大量相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)和炎性因子，主要包括COX2、前列腺素E2（PGE2）［3］和TNF-α等。其中COX2限速酶能夠促進(jìn)花生四烯酸合成PGE2，以此結(jié)合并激活PGE2的4個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體EP1、EP2、EP3和EP4，進(jìn)一步誘發(fā)炎癥和根性神經(jīng)痛的發(fā)生。

圖3 模型組與芪麝丸組大鼠DRGns中蛋白表達(dá)

研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可以通過誘導(dǎo)COX2、PGE2和EP表達(dá)增加激活COX2-PGE2-EP信號(hào)通路。在SNI大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中，TNF-α mRNA短暫性表達(dá)增加，24～48 h后COX2和PGI2合成酶含量在內(nèi)皮細(xì)胞中增加；鞘內(nèi)注射TNF-α可以增加內(nèi)皮細(xì)胞中COX2和PGI2合成酶mRNA的含量，這些發(fā)現(xiàn)表明神經(jīng)損傷后脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中產(chǎn)生的TNF-α可能誘導(dǎo)COX2和前列腺素類合成酶產(chǎn)生，進(jìn)而參與神經(jīng)性痛的產(chǎn)生［4］。在非神經(jīng)細(xì)胞中，如纖維母細(xì)胞，TNF-α可在不同時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)產(chǎn)生COX2和PGE2［5］；在人羊膜細(xì)胞中，在外源性花生四烯酸存在的條件下，TNF-α可以持續(xù)誘導(dǎo)產(chǎn)生PGE2［6］；如人類上皮細(xì)胞中加入TNF-α后，可呈劑量和時(shí)間依賴性誘導(dǎo)COX2和PGE2的表達(dá)［7］。由此可認(rèn)為TNF-α能夠通過不同機(jī)制誘導(dǎo)COX2和PGE2的表達(dá)，參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生。

中醫(yī)古籍中并無(wú)根性神經(jīng)痛的相關(guān)記載，臨床常見的根性神經(jīng)痛如神經(jīng)根型頸椎病可根據(jù)其癥狀歸于“痹癥”范疇。施杞教授認(rèn)為慢性筋骨病屬中醫(yī)“痹癥”范疇［8］，并創(chuàng)立了“益氣化瘀方”的代表方劑芪麝丸。王擁軍等制備長(zhǎng)期直立大鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠L5椎體邊緣發(fā)生骨質(zhì)增生改變，受壓的椎間盤與上下位椎體之間非基質(zhì)成分含量增加，Ⅰ型和Ⅲ型膠原增加，同時(shí)X型膠原蛋白（type X collegan，Col X）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transform growth factorβ1，TGF-β1）表達(dá)增強(qiáng)，芪麝丸干預(yù)后能夠降低Col X和VEGF的表達(dá)量和椎間盤膠原α1（collagenα1，Col10α1）及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）基因的表達(dá)［9-10］。芪麝丸干預(yù)氣虛血瘀型大鼠模型后，能夠下調(diào)高表達(dá)的磷脂酶A2（PLA2）和PGE2水平，延長(zhǎng)其游泳時(shí)間?？梢哉J(rèn)為芪麝丸能改善氣虛血瘀型大鼠癥狀［11］。因神經(jīng)根型頸椎病多為突出的椎間盤或增生的骨贅壓迫刺激脊神經(jīng)根產(chǎn)生炎癥，故在體外培養(yǎng)炎性細(xì)胞-巨噬細(xì)胞模擬神經(jīng)根型頸椎病的炎性環(huán)境，發(fā)現(xiàn)芪麝丸能夠通過減少NO含量和COX2蛋白表達(dá)［12］進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)。與其他藥物相比，芪麝丸能夠有效改善患者頸痛、上肢麻木的癥狀，且不良反應(yīng)少［13-16］。

本實(shí)驗(yàn)在離體培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中加入TNF-α模擬體外DRG或DR受壓的炎性環(huán)境。發(fā)現(xiàn)TNF-α可以促進(jìn)COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA和COX2蛋白、EP4蛋白的表達(dá)，而芪麝丸藥液能夠在一定程 度 上 抑 制COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA和COX2蛋白、EP4蛋白表達(dá)，提示芪麝丸可以通過調(diào)控背根節(jié)COX2-PGE2-EP信號(hào)通路發(fā)揮抗炎、改善局部水腫等緩解根性神經(jīng)痛的作用。