針刺對短暫性全腦缺血再灌注大鼠自噬相關(guān)蛋白的影響*

徐雅文，董蓉潔，毛 斌，尹艷艷，趙俊杰

蓬萊市中醫(yī)院，山東 蓬萊265600

全腦缺血性損傷是心臟驟停后死亡的主要原因。成功復(fù)蘇的患者中院內(nèi)死亡率為70%，而2/3的幸存者在3個月內(nèi)會出現(xiàn)中度或重度神經(jīng)功能缺損體征［1］。由于現(xiàn)有的治療方法很難解決其所致的大量神經(jīng)細(xì)胞損傷或死亡，即使是短暫的大腦血液供應(yīng)中斷也會導(dǎo)致嚴(yán)重的腦損傷和不可逆轉(zhuǎn)的認(rèn)知和執(zhí)行功能障礙［2-3］。研究表明［4-6］，針刺能從抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡、減輕過氧化反應(yīng)、促進(jìn)血管再生多途徑多角度改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能體征，進(jìn)而起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞與促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)的作用。大量體外或在體實驗證明自噬參與了腦缺血腦損傷的病理過程，對于維持細(xì)胞正常功能有重要意義，其激活或抑制影響細(xì)胞的生存和死亡［7］。本研究通過制備短暫性全腦缺血再灌注（TGCIR）大鼠模型，觀察針刺百會、大椎穴對TGCIR大鼠腦組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與分組本研究遵循科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定，使動物遭受痛苦達(dá)到最小。選用成年雄性SD大鼠（200～300 g），實驗動物許可證號：SCXK（遼）2015-0001，在SPF級動物實驗室飼養(yǎng)［溫度（22±2）℃，光暗周期12 h/12 h，相對濕度（60±5）%］。將54只大鼠隨機(jī)分為模型組、非穴位組及針刺組各18只。每籠飼養(yǎng)6只（70 cm×43 cm×27 cm），提供標(biāo)準(zhǔn)飲食飲水。

1.2 儀器與試劑SC600C型有創(chuàng)血壓監(jiān)測儀（Siemens，德國）；反饋式溫度調(diào)節(jié)儀（Harvard Apparatus，美國）；CUT4062型石蠟切片機(jī)（SLEE，德國）；ASP300型自動脫水機(jī)（LEICA，德國）；IX71型顯微鏡（Olympus，日本）；002421型低溫離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific，美國）；EPS-300型電泳儀（上海天能科技有限公司）；華佗牌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，規(guī)格：0.25 mm×25 mm）。恩氟烷（河北一品制藥股份有限公司，批號：H13023176）；PBS緩沖液（武漢博士德生物有限公司，AR0030）；多聚甲醛（武漢博士德生物有限公司，AR1068）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天試劑盒，P0012S）；PVDF膜（上海士鋒生物科技有限公司，F(xiàn)0141）；LC3B（北京博奧森生物有限公司，bs-2912R-1）；Beclin 1（北京博奧森生物有限公司，bs-1353R-1）；兔抗β-actin多克隆抗體（sc-8432，Santa Cruz Biotechnology，美國）；羊抗兔IgG（Abcam，ab6721，英 國）；FITC（sc-65218，Santa Cruz Biotechnology，美國）。

1.3 短暫性全腦缺血再灌注模型制備方法根據(jù)Atochin等提出的改良三血管閉塞法［8］制備大鼠TGCIR模型。所有手術(shù)均在無菌條件下進(jìn)行，應(yīng)用面罩吸入氣體麻醉（1.5%恩氟烷混合30%O2/70%N2O）大鼠，暴露右側(cè)股動脈，將動脈插管插入血管，連接壓力換能器，動態(tài)檢測血壓。同時檢測肛溫，將大鼠放于恒溫毯上維持體溫36～37℃。局部皮膚消毒、備皮，以胸骨柄皮膚為橫切口，切口長2 cm延伸到左邊和右邊的第一個肋間隙。通過頸腹面進(jìn)入頸總動脈，通過第一肋間隙到達(dá)頭臂干和左鎖骨下動脈，繞過胸膜腔避免氣胸。結(jié)扎供應(yīng)大腦的主要動脈（頭臂干動脈、鎖骨下動脈、頸總動脈），使腦血流完全中斷7 min。總手術(shù)干預(yù)時間30～40 min。局部消毒后逐層縫合皮膚，待大鼠蘇醒后放入飼養(yǎng)籠中觀察。見圖1。

圖1 大鼠短暫性全腦缺血再灌注血管結(jié)扎部位示意圖

1.4 模型制備成功評價標(biāo)準(zhǔn)大鼠造模蘇醒后，參照Garcia［9］4分制評分評估大鼠自發(fā)性活動情況，將蘇醒大鼠單獨放置于飼養(yǎng)籠內(nèi)，觀察大鼠5 min內(nèi)接觸籠子四面的情況。0分：大鼠基本不活動；1分：大鼠僅能輕微移動不能接觸籠子任何一面；2分；大鼠可以運動，僅輕微影響運動，接觸籠子少于3個面；3分：大鼠可以隨意運動，并至少接觸3個面。最終納入評分為0～1分表示造模成功。

1.5 干預(yù)方法

1.5.1 模型組接受短暫性全腦缺血再灌注模型制備，但不給于任何治療干預(yù)。

1.5.2 針刺組根據(jù)《實驗針灸學(xué)》［10］中穴位定位標(biāo)準(zhǔn)，大鼠造模蘇醒后選取0.25 mm×25 mm針灸針針刺百會穴（頂骨正中）、大椎穴（第7頸椎與第1胸椎間），針刺深度13 mm，每天2次，每12 h1次，共3天，以180～220 r/min捻轉(zhuǎn)5 min，每5 min捻轉(zhuǎn)1次，共捻轉(zhuǎn)3次，留針30 min。

1.5.3 非穴位組大鼠造模蘇醒后選取0.25 mm×25 mm針灸針，取患側(cè)非穴位（定位：百會穴、大椎穴各旁開1 cm，平行百會、大椎穴連線）針刺深度2～3 mm，不行手法，盡量減少刺激量，留針30 min。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 神經(jīng)功能缺損評分［11-12］分別于造模前及造模后72 h評估大鼠神經(jīng)功能缺損評分。觸須誘導(dǎo)測試：輕握大鼠軀干部位，緩慢移動大鼠至其胡須接觸操作平臺邊緣。正常大鼠在胡須被刺激時同側(cè)前肢會放置在操作臺邊緣。測試重復(fù)10次，得分=前肢成功放置次數(shù)/總次數(shù)×100%。復(fù)合神經(jīng)功能評分：參照Belayev 12分制評分法，共6個條目，得分越高表示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.6.2 組織灌注與取材針刺干預(yù)3天行為學(xué)評估結(jié)束后進(jìn)行灌注取材，大鼠腹腔倍量注射3%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）進(jìn)行麻醉?？焖偃∧X組織于液氮中保存，用于Western blot檢測（每組6只）及置于-20℃冰箱10 min用于TTC染色（每組6只）；4%多聚甲醛心臟內(nèi)灌注，剝離取腦組織，并保存于4%多聚甲醛固定液中，用于免疫組化學(xué)檢測（每組6只）。

1.6.3 TTC染色將大鼠大腦置于腦模具內(nèi)自前向后均勻切為7～8片，每片厚2 mm，并放置于TTC染液中，白色為梗死腦組織，紅色為正常腦組織。于4%多聚甲醛中固定24 h。

相對梗死體積=微梗死體積/總體積=（S1+S2+S3+…SN）H/（S1總＋S2總＋…SN總）H，SN表示每片的梗死面積，H表示每片厚度。

1.6.4 免疫組化檢測切片（4 μm）常規(guī)脫蠟至水，PBS（0.01 mol/L）洗3 min×3次；枸櫞酸溶液（0.1 mol/L、PH=6.0）中熱抗原修復(fù)，水浴20～25 min，室溫冷卻30 min，PBS（0.01 mol/L）洗3 min×3次；加入封閉液室溫封閉20 min；去除封閉液后（勿洗）加入適當(dāng)比例一抗稀釋液（1∶1 000，LC3），4℃孵育過夜；PBS（0.01 mol/L）洗3 min×3次，加入適當(dāng)比例二抗稀釋液（1∶500，F(xiàn)ITC），室溫孵育2 h；PBS（0.01 mol/L）洗3 min×3次；加入DAB顯色液，封片，鏡檢。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析不同高倍鏡視野圖像熒光強(qiáng)度。

1.6.5 Western blot檢測腦組織樣本中加入RIPA裂解液，低溫高速離心提取組織上清液，BCA試劑盒測定蛋白含量，電泳、PVDF轉(zhuǎn)膜、脫脂牛奶封閉，加入一抗稀釋液（1∶1 000，LC3；1∶1000，Beclin 1，1∶2 000，β-actin）4℃過夜，PBS（0.01 mol/L）洗3 min×3次，加入HPR標(biāo)記二抗稀釋液（1∶2 000，羊抗兔IgG）室溫孵育2 h，PBS（0.01 mol/L）洗3 min×3次，ECL發(fā)光液顯色。采用Image-Pro Pus 6.0圖像分析軟件計算相對蛋白表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，兩組間采用單因素方差分析，兩兩之間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)評分造模后72 h，與基線比較，模型組大鼠出現(xiàn)較嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損（P＜0.05），非穴位組與模型組比較無明顯差異，針刺百會、大椎穴能改善大鼠神經(jīng)功能評分（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠行為學(xué)評分比較

2.2 大鼠相對腦梗死體積與模型組比較，非穴位組大鼠相對腦梗死體積無明顯差異，針刺組大鼠相對腦梗死體積降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠相對腦梗死體積比較

2.3 大鼠CA1區(qū)LC3免疫熒光染色陽性表達(dá)綠色熒光為LC3陽性細(xì)胞著色。模型組與非穴位組比較LC3免疫熒光強(qiáng)度無明顯差異，而針刺組LC3免疫熒光強(qiáng)度高于模型組與非穴位組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠CA1區(qū)LC3免疫熒光染色陽性表達(dá)（×400）

2.4 大鼠LC3、Beclin 1蛋白比較與模型組比較，非穴位組LC3、Beclin 1蛋白無明顯差異。而針刺組可提高LC3、Beclin 1蛋白表達(dá)（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖5。

圖5 各組大鼠LC3、Beclin 1蛋白表達(dá)（Western blot）

3 討論

自噬（autophagy）是一種高度保守的細(xì)胞行為，主要涉及大分子物質(zhì)在細(xì)胞中的循環(huán)和再利用，參與降解受損的細(xì)胞器，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的動態(tài)平衡，對腦缺血受損神經(jīng)細(xì)胞的“存活”與“毀滅”意義重大［13-14］。調(diào)控自噬機(jī)制是較為復(fù)雜的過程，其中LC3（Atg8）、Beclin1（Atg6）蛋白是檢測自噬活性的重要指標(biāo)［15］。LC3存在兩種可相互轉(zhuǎn)化的形式LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，游離形式的LC3Ⅰ通過泛素化修飾后脂化的膜結(jié)合形式的LC3Ⅱ。自噬體的數(shù)量與LC3-Ⅱ/Ⅰ的比例成正比，能反映自噬活性，并可通過蛋白印跡技術(shù)計算LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值來反映自噬活性的高低［16-17］。Beclin1在哺乳動物細(xì)胞中廣泛表達(dá)，主要作為一種支架蛋白聚集并調(diào)節(jié)Beclin 1與ClassⅢPI3K/VPS34相互活性，并不斷招募自噬相關(guān)蛋白來介導(dǎo)自噬啟動，在多個階段對自噬起嚴(yán)格控制作用［18］。

近年來，越來越多研究證實腦缺血誘導(dǎo)的腦損傷可激活自噬溶酶體途徑，通過降解受損細(xì)胞器、炎癥物質(zhì)、損傷線粒體等發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［19-20］。最初通過透射電子顯微鏡觀察自噬體結(jié)構(gòu)，并證實自噬參與了腦缺血病理過程。研究者進(jìn)一步采用藥理學(xué)工具或基因敲除小鼠來研究自噬的誘導(dǎo)或抑制，并驗證了功能性自噬在腦缺血中的生物學(xué)意義［21］。在缺血損傷期間，激活的AMPK通過磷酸化抑制mTOR通路上調(diào)自噬，從而在缺血期間對細(xì)胞存活起保護(hù)作用［22］。在腦缺血大鼠模型中發(fā)現(xiàn)［23］，從2 h開始細(xì)胞自噬被顯著激活，1～6 h仍維持較高水平，24 h自噬達(dá)高峰。Carloni等［24］發(fā)現(xiàn)新生大鼠腦缺血后在短時間內(nèi)可誘導(dǎo)自噬發(fā)生，應(yīng)用3-MA自噬抑制劑可導(dǎo)致細(xì)胞大量凋亡、死亡，而應(yīng)用雷帕霉素自噬激動劑可減少細(xì)胞凋亡及死亡數(shù)目，并通過mTOR通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用?？梢?，自噬可保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，減輕缺血性損傷。自噬可能是拮抗腦缺血再灌注腦損傷的干預(yù)新靶點。

本研究采用改良三血管閉塞法制備短暫性全腦缺血再灌注大鼠模型，并通過2種常用行為學(xué)評分評估針刺百會及大椎穴對TGCIR大鼠神經(jīng)功能缺損程度的影響。針刺療效主要有特異效應(yīng)和非特異效應(yīng)，前者為真實治療效應(yīng)，后者為安慰劑效應(yīng)［25-26］。本研究選取非穴位淺刺作為對照，其特異效應(yīng)較弱，能體現(xiàn)針刺穴位的治療效應(yīng)。結(jié)果表明，針刺穴位較非穴位能提高腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損體征。說明針刺百會及大椎穴具有一定的穴位特異性。研究表明［27］，缺血過程中組織低氧、酸化、錯誤折疊蛋白、氧化應(yīng)激及能量供應(yīng)障礙是誘導(dǎo)自噬激活的重要因素，而自噬激活與腦損傷程度呈正相關(guān)。本研究中針刺百會及大椎穴能提高TGCIR大鼠腦組織自噬蛋白（LC3、Beclin 1）表達(dá)，提高自噬水平，表明針刺百會及大椎穴可能激活TGCIR大鼠腦組織自噬水平，改善神經(jīng)功能缺損。

綜上所述，針刺百會及大椎穴能激活短暫性全腦缺血再灌注大鼠自噬，上調(diào)相關(guān)蛋白LC3、Beclin 1表達(dá)，改善腦損傷大鼠神經(jīng)功能缺損。