QH菌微生物傳感器測(cè)試海水BOD的性能

陳 婧,林振景,任漢英

(1.河北環(huán)境工程學(xué)院,河北 秦皇島 066102;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院,河北 秦皇島 066000;3.河北省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,河北 石家莊 050018)

常用的水質(zhì)監(jiān)測(cè)指標(biāo)包括物理性指標(biāo)、化學(xué)性指標(biāo)和生物性指標(biāo)三類。生化需氧量是常用的化學(xué)性指標(biāo)之一[1],常用五日生化需氧量表示,簡(jiǎn)稱BOD5[2]。BOD5法耗時(shí)較長(zhǎng),操作麻煩[3-4],不適合在線監(jiān)測(cè)。1977年日本科學(xué)家Karube.I等[5]首次將微生物用于BOD的測(cè)定,開啟了BOD快速測(cè)定的新領(lǐng)域[6-9]。近30年來,淡水BOD的在線監(jiān)測(cè)和快速測(cè)量技術(shù)發(fā)展迅速,已經(jīng)有很多的商品化監(jiān)測(cè)儀器。但是由于海水的特殊性,淡水BOD在線監(jiān)測(cè)儀不能適用或者不能直接適用于海水BOD的監(jiān)測(cè),張悅、李花子[10-11]選用酵母菌制作傳感器,測(cè)定一個(gè)海水樣僅需15 min。廈門大學(xué)等研制了一種海水BOD光導(dǎo)測(cè)定樣機(jī),可以快速自動(dòng)測(cè)定海水BOD,但是儀器成本比較高,現(xiàn)在對(duì)于海水BOD微生物傳感器測(cè)定的研究主要是開發(fā)新的、更優(yōu)秀的響應(yīng)微生物,并提高其性能[12-15]。選擇從秦皇島海水中篩選的QH菌作為響應(yīng)菌株,組裝傳感器,研究此傳感器是否滿足在線監(jiān)測(cè)的需要,并對(duì)其性能進(jìn)行測(cè)試。

1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1.1 儀器和藥品

實(shí)驗(yàn)所用儀器設(shè)備、藥品如表1所示:

表1 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑配制

① 磷酸鹽緩沖溶液:取Na2HP O4·12H2O(m=5.970 0 g)和KH2PO4(m=0.453 9 g),溶于1.2 L水中。配制好的溶液pH值為7.78,含鹽度0.234%(w/v)。

② G標(biāo)液:將葡萄糖和谷氨酸溶液按體積1:1混合均勻,配置G標(biāo)液。配置好的G標(biāo)液BOD5恒定,為(198.0±30.5)mg/L。

③ 模擬海水:將上述①溶液加入3% NaCl(w/v),攪拌溶解。

1.3 培養(yǎng)基篩選

牛肉膏0.3 g,蛋白胨1 g,可溶性淀粉0.5 g,瓊脂1.5 g,模擬海水100 mL。pH值范圍為7.0~7.2。

培養(yǎng)基使用前高溫濕熱滅菌30 min。

實(shí)驗(yàn)室所用試劑均為分析純(Analytical Reagent,AR)級(jí)別以上的試劑,水為石英二次蒸餾水。

1.4 菌源選擇

我國(guó)海洋面積遼闊,海水質(zhì)量和環(huán)境質(zhì)量存在一定的差異。為了保證篩選菌株具有一定代表性,實(shí)驗(yàn)就近選取了秦皇島海域海水作為菌株篩選的菌源,進(jìn)行菌源的篩選。

1.5 初篩方法

按照1.3的方法制備固體培養(yǎng)基,放置在培養(yǎng)皿中,冷卻成固體。用稀釋接種海水涂布培養(yǎng)皿,在恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃恒溫培養(yǎng),觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.6 實(shí)驗(yàn)原理

微生物菌液經(jīng)過多次分離培養(yǎng)后,取定量的濕菌液置于微孔濾膜上,并進(jìn)行固定。將制備完畢的微生物膜放置于傳感器氧電極上,并固定好。以模擬海水為實(shí)驗(yàn)底液,恒速鼓入空氣進(jìn)行曝氣。向底液中加入一定量的G標(biāo)液,基于呼吸作用的原理,微生物同化有機(jī)物消耗一定量的氧,轉(zhuǎn)化后的電流信號(hào)降低。通過比較電流變化的快慢和大小,判定菌種是否可以作為工作菌種。通過測(cè)定G標(biāo)液的量、BOD的濃度和電流的變化值,找到電流和BOD值的線性關(guān)系。微生物傳感器裝置示意圖見圖1。

1.7 初篩結(jié)果

觀察從平板上生長(zhǎng)出來的菌落,根據(jù)菌落的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行選擇。即選擇生長(zhǎng)在培養(yǎng)基表面的、菌落面積大、生長(zhǎng)速度快的好氧菌株為初篩菌。

圖1 BOD生物傳感器裝置

表2 初篩結(jié)果

圖2 QB菌落形態(tài)

圖3 QH菌落形態(tài)

如表2所示,經(jīng)過初步篩選,選出秦白(QB)、秦紅(QH)菌性能菌落面積較大,生長(zhǎng)速度達(dá)到要求,可以作為下一步性能測(cè)試的菌株。將篩得的這2株菌分別進(jìn)行純化培養(yǎng),顯微觀察確定為純種后,轉(zhuǎn)接于斜面冰箱內(nèi)保存。首先選擇秦紅(QH)菌進(jìn)行性能測(cè)試,以下的研究結(jié)果均是針對(duì)秦紅(QH)菌。

1.8 微生物固定化

QH菌菌懸液離心(轉(zhuǎn)速6 000 r/min,離心5 min)→實(shí)驗(yàn)試劑③(配置方法如前所述)洗滌2次 →按比例混合濕菌體與輔料 →置于兩個(gè)相同的醋酸纖維素膜間,并固定。

1.9 微生物膜的保存

實(shí)驗(yàn)用微生物膜可以批量制作,保存方法如下:

短期存放:固定化微生物膜可放實(shí)驗(yàn)試劑①中浸泡。

長(zhǎng)期存放:置于4 ℃冰箱中,再次使用需要進(jìn)行微生物復(fù)活。

2 實(shí)驗(yàn)儀器和方法

2.1 傳感器的組裝

此傳感器的工作系統(tǒng)主要由恒溫水浴箱、自制恒溫水槽、CX8000曝氣裝置、測(cè)量池(容積為80 mL)、SJG-203A溶解氧分析儀和記錄儀組成。將制備好的實(shí)驗(yàn)中微生物膜置于氧電極上,并固定完畢。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

以實(shí)驗(yàn)試劑③為底液(50 mL),恒溫,恒速鼓氣。待電流穩(wěn)定后加入實(shí)驗(yàn)試劑①,觀察電流表的變化及反應(yīng)的時(shí)間。通過ΔI(電流變化量)確定BOD值。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)條件的確定

3.1.1 溫度的確定

在27~38 ℃范圍內(nèi)改變測(cè)試溶液溫度對(duì)傳感器的響應(yīng)性能進(jìn)行了測(cè)試,測(cè)試曲線如圖4所示。由圖4可見,溫度在32~35 ℃范圍內(nèi),微生物活性最高,響應(yīng)信號(hào)最大。確定實(shí)驗(yàn)的最佳溫度是32 ℃。

圖4 溫度對(duì)傳感器響應(yīng)影響曲線

3.1.2 pH值的確定

在pH值為6~10范圍內(nèi),實(shí)驗(yàn)傳感器的響應(yīng)情況,不同pH值對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響曲線見圖5。由圖5可知,pH值在6.8~9.2范圍內(nèi)對(duì)傳感器沒有任何影響,確定實(shí)驗(yàn)pH值為7.2。

圖5 pH值對(duì)傳感器響應(yīng)影響曲線

3.1.3 鹽度的確定

向?qū)嶒?yàn)試劑①添加0~6%的NaCl,用來考察鹽濃度對(duì)QH菌活性的影響程度,結(jié)果如圖6所示。由圖6可知,當(dāng)NaCl濃度在2%~4%之間時(shí),響應(yīng)信號(hào)減小很多,說明鹽度在2%~4%這個(gè)范圍內(nèi)對(duì)傳感器響應(yīng)影響很大。為了改善鹽度對(duì)傳感器的影響程度,采用1%~5%鹽度梯度的培養(yǎng)基逐步馴化煙紅菌,其結(jié)果如圖6所示:

圖6 馴化前、后鹽度影響曲線

3.2 傳感器響應(yīng)性能測(cè)定

3.2.1 平行性實(shí)驗(yàn)

在32℃、pH值為7.2的條件下,每次加入等量的GGA溶液(2 mL),連續(xù)7次測(cè)定傳感器的響應(yīng)情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示,7次實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)變偏差為4.52%。

表3 傳感器平行實(shí)驗(yàn)

3.2.2 響應(yīng)曲線的測(cè)定

在33 ℃下,對(duì)傳感器的線性進(jìn)行了測(cè)試,結(jié)果如圖7所示。測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=0.061 2x-0.001 3,線性相關(guān)系數(shù)為0.992,線性響應(yīng)范圍0~42 mg/L。

圖7 響應(yīng)線性

3.2.3 重金屬離子影響分析

選取Zn2+、Cu2+、Pb2+、Hg2+這4種重金屬離子,考察了重金屬離子對(duì)傳感器響應(yīng)的影響程度。Zn2+、Cu2+、Pb2+、Hg2+這4種重金屬離子影響曲線分別見圖8、圖9、圖10、圖11。

從圖9中可以看出,鋅離子濃度在0.8 mg/L以下時(shí),對(duì)傳感器響應(yīng)影響較小,濃度在1 mg/L以上時(shí),對(duì)響應(yīng)產(chǎn)生明顯抑制作用。從圖11可以看出,鉛離子從開始加入后即產(chǎn)生明顯抑制作用。圖10和圖12都表明傳感器響應(yīng)信號(hào)隨著金屬離子的濃度增加呈現(xiàn)先增大后逐漸減小的變化趨勢(shì)。說明這些重金屬離子為低濃度時(shí),對(duì)微生物的生理代謝有刺激作用,為高濃度時(shí)對(duì)微生物的生理代謝有抑制作用。

圖8 鋅離子影響曲線

圖9 銅離子影響曲線

圖10 鉛離子影響曲線

圖11 汞離子影響曲線

3.2.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取海水樣做加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表4:

表4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

3.2.5 對(duì)照實(shí)驗(yàn)

用本實(shí)驗(yàn)方法、文獻(xiàn)[15]的傳感器及傳統(tǒng)BOD5法測(cè)定同一份青島海水,結(jié)果見表5。結(jié)果表明,QH菌微生物傳感器法與傳統(tǒng)BOD5法有很好的相關(guān)性,比文獻(xiàn)[15]的傳感器測(cè)量的誤差小。

表5 BOD傳感器與BOD5法的對(duì)照實(shí)驗(yàn)

3 結(jié)論

用秦皇島海域海水作為菌株篩選的菌源,經(jīng)過初步篩選,秦白(QB)、秦紅(QH)菌性能菌落面積較大,生長(zhǎng)速度達(dá)到要求,本研究是用QH菌作為性能測(cè)試的菌株,組裝傳感器,測(cè)試出傳感器測(cè)試模擬海水BOD的最佳實(shí)驗(yàn)條件,包括溫度、pH值,在最佳實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)試響應(yīng)曲線,并測(cè)試傳感器的性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)論如下:

(1)傳感器最適宜工作溫度為33 ℃,pH值為7.2,傳感器標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=0.061 2x-0.001 3,線性相關(guān)系數(shù)為0.992。

(2)鹽度測(cè)試表明,QH菌馴化之前,對(duì)鹽度變化比較敏感,響應(yīng)不穩(wěn)定,在馴化之后,能夠在含鹽2.5%~4.5%的底液中穩(wěn)定響應(yīng)。

(3)在重金屬影響實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)鋅離子濃度在0.8 mg/L以下時(shí),對(duì)傳感器響應(yīng)影響較小,濃度在1 mg/L以上時(shí),對(duì)響應(yīng)產(chǎn)生明顯抑制作用。銅離子的微量存在使傳感器響應(yīng)值略有增加,當(dāng)濃度達(dá)0.3 mg/L時(shí),響應(yīng)值達(dá)到最大。隨著銅離子濃度的繼續(xù)增加,信號(hào)值開始下降。鉛離子對(duì)傳感器響應(yīng)的抑制作用較為明顯,當(dāng)濃度在0.25 mg/L時(shí),響應(yīng)信號(hào)立即降低了原響應(yīng)信號(hào)的1/6。汞離子濃度在0.002 mg/L時(shí),傳感器響應(yīng)信號(hào)逐漸增大到最大。而后,隨著汞離子濃度增大,響應(yīng)信號(hào)開始下降,說明微量汞離子的存在對(duì)QH菌有激活作用。對(duì)海水的兩次加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn),回收率分別為118%和91.7%。測(cè)定海水BOD與BOD5相對(duì)誤差為-17.8%,有很好的相關(guān)性。QH菌可以用于海水BOD在線監(jiān)測(cè)使用。深入研究選定響應(yīng)菌株的生理習(xí)性和對(duì)有機(jī)物的降解特性,確定菌株的適用水質(zhì)類型,提高響應(yīng)的靈敏度和響應(yīng)范圍是下一階段研究的重點(diǎn)。