轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1在踝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨和血清中的表達(dá)

石 林，逄銘源，陳麗倩，姜厚森，郭 佳，孫建民

（濰坊市人民醫(yī)院，山東濰坊 261000）

踝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（ankle osteoarthritis,AOA）隨著我國(guó)老齡化的加劇，患病率出現(xiàn)越來(lái)越高的趨勢(shì)，成為最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)炎[1，2]，最重要的特征性改變是關(guān)節(jié)軟骨損傷[3，4]。然而當(dāng)下對(duì)踝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的治療只能緩解患者的疼痛及改善關(guān)節(jié)的功能，不能逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)的損傷或抑制其發(fā)展，最終手術(shù)干預(yù)不可避免。有研究表明，關(guān)節(jié)軟骨損傷與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1（TGF-β1）影響軟骨代謝的機(jī)制有關(guān)。它具有雙向性和多樣性，在免疫、炎癥等疾病中有重要作用[5，6]。作者對(duì)臨床診斷為踝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的患者中進(jìn)行軟骨和血清中TGF-β1的測(cè)定，并與正常人對(duì)照，探討TGF-β1的臨床意義。

1 臨床資料

1.1 一般資料

AOA組：為2017年07月—2020年06月在本院因AOA行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)或踝關(guān)節(jié)融合患者，術(shù)前臨床與影像檢查，以及術(shù)中所見(jiàn)確認(rèn)為AOA。其中，男14例，女13例；年齡69～43歲，平均（50.30±7.12）歲，病程3個(gè)月～21年，平均（10.30±3.20）年。臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹，受累關(guān)節(jié)局部可有壓痛，有的被動(dòng)運(yùn)動(dòng)時(shí)關(guān)節(jié)疼痛，過(guò)度活動(dòng)后關(guān)節(jié)腫脹明顯，疼痛加重。X線片顯示關(guān)節(jié)間隙不匹配，軟骨下骨質(zhì)出現(xiàn)囊性變，關(guān)節(jié)邊緣有骨贅形成，有部分患者距骨關(guān)節(jié)面萎陷、變形和關(guān)節(jié)出現(xiàn)半脫位等。

正常對(duì)照組：為同期因治療其他疾病入院住院患者27例，病史、臨床表現(xiàn)和影像檢查踝關(guān)節(jié)均正常。其中，男10例，女17例；年齡75～32歲，平均（47.00±4.30）歲。此外，正常軟骨組織標(biāo)本3份，取自外傷或者截肢手術(shù)未累及踝關(guān)節(jié)的軟骨組織。

本研究所有取標(biāo)本的患者在術(shù)前談話時(shí)向患者講明，取得患者及家屬的同意，簽訂知情同意書(shū)后采集，研究方案獲得濰坊市人民醫(yī)院倫理委員批準(zhǔn)。

1.2 檢測(cè)方法

血清TGF-β1檢測(cè)：所有受試者空腹6～12 h后抽血1～2 ml，離心后取上層即為血清。所取標(biāo)本放置在-20℃冰箱內(nèi)保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法測(cè)定血清中TGF-β1，試劑盒為杭州華安科技生物有限公司產(chǎn)品。儀器是國(guó)產(chǎn)自動(dòng)酶標(biāo)儀和自動(dòng)洗板機(jī)。按試劑說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行樣品檢測(cè)。

骨軟骨組織觀察與免疫組織化學(xué)染色：觀察距骨關(guān)節(jié)面大體形態(tài)，取距骨骨軟骨組織采用超敏SP免疫組織化學(xué)方法觀察TGF-β1分布。使用羅氏自動(dòng)免疫組化機(jī)，TGF-β1免疫組織化學(xué)試劑盒為杭州華安科技生物有限公司產(chǎn)品。取材后10%甲醛固定12～24 h，然后脫鈣、脫水、透明、浸泡、包埋。石蠟切片烘烤30 min后常規(guī)二甲苯脫蠟至水，再用蒸餾水清洗一次，緩沖液清洗1 min，在玻片組織上滴加Ⅰ抗，4℃孵育經(jīng)過(guò)一夜。第2 d用緩沖液沖洗3次，每次1 min后滴加Ⅱ抗，保持37℃孵育1 h。配制新鮮顯色液，沖洗玻片3次，每次3 min，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺法分別染色1、3 min后停止顯色，在顯微鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果并拍照記錄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均以±s表示，兩組間數(shù)據(jù)比較用兩樣本t檢驗(yàn)，有關(guān)指標(biāo)采用相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 血清TGF-β1檢測(cè)結(jié)果

ELISA法測(cè)定血清中TGF-β1結(jié)果，AOA組（1 994.70±188.49）pg/ml，對(duì)照組為（1623.22±127.99）pg/ml，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。AOA組血清中TGF-β1的含量明顯高于對(duì)照組。

2.2 大體形態(tài)觀察和軟骨組織TGF-β1免疫組織化學(xué)染色

大體形態(tài)觀察：AOA組軟骨表面粗糙不平，色澤暗淡，部分軟骨剝脫及軟骨下骨裸露；正常軟骨組軟骨表面平整，色澤正常，無(wú)脫屑。

TGF-β1免疫組織化學(xué)染色AOA患者骨軟骨標(biāo)本中TGF-β1染色陽(yáng)性，其中，15例染色較深，呈強(qiáng)陽(yáng)性，其中軟骨下骨中可見(jiàn)多核巨細(xì)胞，胞漿呈深藍(lán)色（圖1a）。相比之下，正常軟骨著色較淡，軟骨下骨也可見(jiàn)多核巨細(xì)胞，但體積小，著色淺（圖1b）。

圖1 TGF-β1免疫組織化學(xué)染色（×400） 1a:AOA組，軟骨下骨可見(jiàn)較大多核巨細(xì)胞，胞漿著色較深 1b:正常組軟骨下骨亦可見(jiàn)多核巨細(xì)胞，但體積較小，胞漿著色較淺

3 討論

AOA是一種以關(guān)節(jié)軟骨被損壞為特征的退行性病變，主要表現(xiàn)為踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨面變粗糙、脫屑、部分軟骨剝脫，關(guān)節(jié)鏡下反光度差，關(guān)節(jié)面不匹配，周?chē)琴樞纬桑P(guān)節(jié)間隙變窄等。踝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的病因有很多，主要是以下幾類(lèi)：過(guò)度活動(dòng)、勞累致使關(guān)節(jié)軟骨損傷；軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解造成軟骨自身修復(fù)的能力下降[1～3]。AOA是一種復(fù)雜的疾病，其發(fā)病機(jī)制包括生物力學(xué)和代謝因素，這些因素改變了關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的組織平衡。細(xì)胞/細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相互作用在關(guān)節(jié)軟骨的病理生理學(xué)中起著關(guān)鍵作用，這些相互作用由細(xì)胞表面的受體與細(xì)胞因子介導(dǎo)。在生理環(huán)境中，受體調(diào)節(jié)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)信號(hào)，維持軟骨平衡。IL-1、TNF-α和其他細(xì)胞因子激活軟骨基質(zhì)的降解酶，主要是金屬蛋白酶（MMPs），它們通過(guò)放大級(jí)聯(lián)按順序激活。而生長(zhǎng)因子，如TGF-beta、IFG、BMP、NGF等，不僅參與組織損傷修復(fù)，也在OA發(fā)病中起著重要作用[7]。

在AOA發(fā)生過(guò)程中，TGF-β1作為一個(gè)具有重要調(diào)節(jié)意義的因子，通過(guò)TGF-β1及其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路系統(tǒng)將信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)而起到多種生理調(diào)節(jié)作用，在維持關(guān)節(jié)軟骨正常結(jié)構(gòu)和關(guān)節(jié)修復(fù)中有重要的意義[5，6]。本研究發(fā)現(xiàn) TGF-β1在 AOA 中高表達(dá)，無(wú)論血清中TGF-β1還是局部組織中TGF-β1均較正常對(duì)照增加，說(shuō)明它的作用不僅僅是修復(fù)軟骨和抑制炎癥，可能有加速關(guān)節(jié)軟骨的破壞作用。有很多學(xué)者的研究也印證了本研究，Scharstuhl等[8]在老年小鼠的膝關(guān)節(jié)內(nèi)多次注入TGF-β1會(huì)使關(guān)節(jié)周?chē)纬晒琴?，說(shuō)明老年小鼠TGF-β1含量的增多可能加速骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。有研究表明TGF-β1在骨性關(guān)節(jié)炎的早期階段可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的合成，骨性關(guān)節(jié)炎的晚期抑制軟骨細(xì)胞的合成[9，10]。

本研究顯示AOA血清中TGF-β1的含量明顯高于對(duì)照組，AOA軟骨細(xì)胞中TGF-β1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于正常軟骨細(xì)胞。說(shuō)明TGF-β1的表達(dá)與AOA患者的病情相關(guān)，也提示TGF-β1在AOA的后期主要是抑制軟骨細(xì)胞增生，加速關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。