重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶突變體的表達(dá)、分離純化及其催化應(yīng)用

宋小平,沈何放,余銀,馬若彤,潘李娜

1(安徽醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 藥學(xué)系,安徽 合肥,230061) 2(安徽省重組蛋白藥物工程技術(shù)研究中心,安徽 合肥,230022)

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(transglutaminase,TG)能夠催化蛋白質(zhì)肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基與各種酰基受體發(fā)生?；D(zhuǎn)移反應(yīng),是一種有效的蛋白質(zhì)交聯(lián)劑[1-3]。微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(microbial transglutaminase,MTG)具有低蛋白分子質(zhì)量、非Ca2+依賴性和較廣的底物范圍等優(yōu)點(diǎn),在食品工業(yè)[4-6]、生物醫(yī)藥[7]、組織工程[7]、定點(diǎn)蛋白交聯(lián)[8]和同源抗體偶聯(lián)藥物的構(gòu)建等行業(yè)均具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[8-10]。近年來(lái),通過(guò)分子進(jìn)化獲得更高活性和熱穩(wěn)定性的突變酶,并擴(kuò)大其應(yīng)用范圍的研究一直受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的密切關(guān)注。

我們?cè)谇捌谘芯恐?成功構(gòu)建了一種5位點(diǎn)組合突變的畢赤酵母菌株pro/rDNA-mtg-mut2,其表達(dá)的重組酶MTG-MUT2為5個(gè)氨基酸組合突變體：S2P-S23V-Y24N-R215A-H289Y。MTG-MUT2比酶活力為(39.3±1.6) U/mg,是野生酶的2.4倍[野生酶(16.7±0.7) U/mg]；最佳酶反應(yīng)溫度是55 ℃；50和60 ℃的半衰期分別為446.9和 27.6 min,分別是野生酶的11.7和10.2倍(野生酶在50和60 ℃的半衰期分別為38.5和2.7 min)。本研究首先通過(guò)高密度發(fā)酵獲得粗酶液,分離純化得到純酶；并對(duì)該純酶的3個(gè)組分進(jìn)行分離,分析糖基化對(duì)酶活性的影響及其影響機(jī)制。然后,研究該純酶催化氨基酸交聯(lián)反應(yīng),旨在拓展重組酶MTG-MUT2的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

畢赤酵母重組菌株pro/rDNA-mtg-mut2為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏。

1.1.2 儀器

AKTA Pure蛋白質(zhì)層析純化系統(tǒng)、Superdex 75 prep grade,GE公司；BWS465-785S拉曼光譜儀,美國(guó)必答泰克公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.1.3 試劑與培養(yǎng)基

N-carboxybenzoyl-L-glutaminyl-glycine(N-CBZ-Gln-Gly)、L-谷氨酸-γ-單羥胺酸、牛血清蛋白,Sigma-Aldrich公司；還原型谷胱甘肽,華美生物工程有限公司；anti-MTG,Eurogentec公司；L-谷氨酰胺(純度>99%),國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司；L-賴氨酸(純度>99%),麥克林試劑公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

畢赤酵母培養(yǎng)基：YPD、BMGY、BMMY,參照Invitrogen公司的操作手冊(cè)配制,畢赤酵母培養(yǎng)溫度28 ℃,誘導(dǎo)溫度25 ℃[9-10]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 pro/rDNA-mtg-mut2 的高密度發(fā)酵及純化

高密度發(fā)酵在14 L發(fā)酵罐中進(jìn)行。采用起始發(fā)酵體積為3 L的發(fā)酵體系,初始培養(yǎng)基組成：2.4 L BMGY(4%甘油)+300 mL YNB+300 mL PPB,發(fā)酵參數(shù)設(shè)定為：pH 6.0,生長(zhǎng)溫度28 ℃,攪拌轉(zhuǎn)速800 r/min,通氣量10 L/min。當(dāng)罐內(nèi)基礎(chǔ)甘油用完后,溶氧會(huì)在短時(shí)間內(nèi)上升,此時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加甘油,50%甘油(含12 ml/L PTM1)恒速補(bǔ)料25 mL/(L·h)。當(dāng)菌體濕重達(dá)到(195±2)g/L時(shí)停止補(bǔ)甘油,開(kāi)始補(bǔ)加100%甲醇誘導(dǎo)(甲醇含12 mL/L PTM1)。甲醇誘導(dǎo)采用3步補(bǔ)料(根據(jù)甲醇電極判斷補(bǔ)料時(shí)間點(diǎn)),誘導(dǎo)溫度調(diào)整為25 ℃。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中控制溶氧水平為25%～30%[9-11],誘導(dǎo)40 h。每8 h取樣測(cè)定菌體濕重和酶活力,采用非還原SDS-PAGE檢測(cè),膠濃度10%,Western Blot鑒定目標(biāo)蛋白,鑒定用抗體為anti-MTG。發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化采用His Trap HP組氨酸標(biāo)記親和層析法,操作步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)[9-10]。純化樣品檢測(cè)方法同上。

1.2.2 MTG-MUT2酶活力測(cè)定

異羥肟酸比色法測(cè)定MTG酶活力,按照參考文獻(xiàn)[12-14]的方法進(jìn)行。MTG酶活力定義為：在37 ℃下,MTG每分鐘催化底物(N-CBZ-Gln-Gly)生成1 μmoL谷氨酸-單羥胺酸(氧肟酸)為1個(gè)酶活單位。蛋白濃度測(cè)定采用Bradford方法,標(biāo)準(zhǔn)蛋白為牛血清蛋白[13]。

1.2.3 糖基化對(duì)MTG-MUT2酶活性的影響

將1.2.2 所得純化樣品過(guò)分子篩(Superdex 75 prep grade),并在同一條件下測(cè)定這3個(gè)組分的酶活力,以探索糖基化對(duì)酶活性的影響,酶活力測(cè)定方法見(jiàn)1.2.2。流程為：平衡→上樣→洗脫。PBS(pH 7.4)平衡分子篩,上樣流速為2 mL/min,PBS洗脫,手動(dòng)收集各個(gè)紫外峰組分,SDS-PAGE檢測(cè),膠濃度10%,每孔上樣量2.5 μg,考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.2.4 MTG-MUT2催化條件優(yōu)化

為了進(jìn)一步探討MTG-MUT2對(duì)蛋白質(zhì)中氨基酸的交聯(lián)作用,以L-谷氨酰胺和L-賴氨酸作為底物,首先分析反應(yīng)底物的配比對(duì)產(chǎn)物生成的影響。固定L-谷氨酰胺的濃度為300 mmol/L,L-賴氨酸與其的比例為A∶0.9、B∶1.0、C∶1.1、D∶1.2,在55 ℃、pH 6.5下反應(yīng)2 h,比較谷賴二肽產(chǎn)量,確定2種底物最適合的添加比例。接著,研究L-谷氨酰胺的濃度分別為100、200、300、400、500、600 mmol/L時(shí),L-賴氨酸和L-谷氨酰胺添加比例的最適比例,比較谷賴二肽產(chǎn)量。

1.2.5 MTG-MUT2催化產(chǎn)物的檢測(cè)

采取檸檬酸鈉還原法制備銀納米顆粒(Ag nanoparticles,AgNPs),Ag+被還原成直徑為納米級(jí)的AgNPs。具體制備依據(jù)文獻(xiàn)[14-19]的方法進(jìn)行制備。

將待測(cè)樣品用PBS緩沖液(pH 7.2)稀釋為100 μg/mL。取50 μL待測(cè)樣本與50 μL修飾后的AgNPs混合后放入微量比色皿中進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼散射光譜(surface enhanced Raman scattering,SERS)測(cè)試。激發(fā)波長(zhǎng)為785 nm,積分時(shí)間5 ms,激光功率20 mW。數(shù)據(jù)采集及光譜處理均采用光譜儀自帶軟件。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 pro/rDNA-mtg-mut2在14 L發(fā)酵罐中的表達(dá)和純化

典型的發(fā)酵曲線如圖1-a所示,包括間歇培養(yǎng)、甘油進(jìn)料和甲醇誘導(dǎo)階段。在間歇培養(yǎng)階段,酵母種子在含4%甘油(pH 6.0)的BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng),28 ℃控制,持續(xù)17～18 h,當(dāng)細(xì)胞濕重(wet cell weight,WCW)達(dá)到140 g/L,開(kāi)始補(bǔ)甘油。在甘油補(bǔ)料階段,補(bǔ)50%的甘油(含有12 mL/L PTM1溶液),將DO控制在30%,溫度維持在28 ℃,至WCW達(dá)到約(195±2)g/L時(shí),補(bǔ)料結(jié)束。當(dāng)溶氧(dissolved oxygen,DO)出現(xiàn)急劇上升,開(kāi)始甲醇誘導(dǎo)(100%甲醇,含12 mL/L PTM1),甲醇采取3步誘導(dǎo)：3.6、7.2和10.8 mL/(L·h),誘導(dǎo)過(guò)程DO保持在大約30%(圖1-a)。甲醇誘導(dǎo)持續(xù)40 h,當(dāng)酵母WCW達(dá)到約340～350 g/L時(shí)結(jié)束。在甲醇誘導(dǎo)的前32 h,MTG-MUT2的酶活力和表達(dá)逐漸增加(圖1-b～圖1-d)；然而,誘導(dǎo)32 h后,MTG-MUT2酶活力和表達(dá)量增加不明顯,發(fā)酵結(jié)束時(shí),發(fā)酵上清液的最高酶活力為7.45 U/mL(圖1-b)。

2.2 MTG-MUT2的純化和SDS-PAGE分析

對(duì)pro/rDNA-mtg-mut2高密度發(fā)酵的70 h培養(yǎng)上清液進(jìn)行1步鎳柱親和層析純化,收集洗脫液215 mL。如表1所示,酶活力為12.3 U/mL,蛋白質(zhì)量濃度274.3 μg/mL,蛋白純化2.7倍,回收率為87.4%。SDS-PAGE結(jié)果如圖2所示,重組MTG-MUT2有3條特異性蛋白帶,分別為1條非糖基化條帶和2條糖基化條帶,大小為38 k～42 kDa,這與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道的1～3條帶的結(jié)果相一致[10-12]。

a-發(fā)酵曲線；b-不同誘導(dǎo)時(shí)間的生物量和酶活力；c-SDS-PAGE不同誘導(dǎo)時(shí)間發(fā)酵上清液；d-WB檢測(cè)不同誘導(dǎo)時(shí)間發(fā)酵上清液圖1 pro/rDNA-mtg-mut2高密度發(fā)酵過(guò)程的檢測(cè)Fig.1 Parameters detected at different induction time of high-density pro/rDNA-mtg-mut2 fermentation

表1 重組MTG的純化方案Table 1 Purification scheme of recombinant MTG-MUT2

圖2 SDS-PAGE檢測(cè)純化MTG-MUT2Fig.2 Detection of purified MTG-MUT2

2.3 糖基化對(duì)MTG-MUT2酶活性的影響

MTG-MUT2的3個(gè)組分分離結(jié)果如圖3所示。與未分離蛋白條帶比較,3條蛋白帶的主帶已分離,根據(jù)分子質(zhì)量從大到小依次為42、40、38 kDa,但由于2條帶表觀分子質(zhì)量相差只有約2 kDa,所以條帶沒(méi)有完全分開(kāi),但不影響后續(xù)酶活力的分析。以未分離酶作為對(duì)照,在同一條件下檢測(cè)這3個(gè)組分(42、40、38 kDa)的酶活力,結(jié)果分別為：10.6、14.7和8.7 U/mL,40 kDa糖蛋(14.7 U/mL)是非糖基化酶(8.7 U/mL)的1.7倍；2個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生糖基化的酶活力次之(10.6 U/mL),是非糖基化酶的1.2倍。

1,5-未過(guò)分子篩樣品(不同批次)；2～4-分離后的蛋白樣品圖3 MTG-MUT2分離后組分的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.3 Components seperated by MTG-MUT2 detected by SDS-PAGE

2.4 MUT2催化條件優(yōu)化

固定谷氨酰胺的濃度為300 mmol/L,L-賴氨酸與其的比例為A∶0.9、B∶1.0、C∶1.1、D∶1.2,在55 ℃、pH 6.5下反應(yīng)2 h,結(jié)果如圖4所示(圖中數(shù)據(jù)均為扣除基線和溶劑的峰)。拉曼光譜特征峰在298～2 000 cm-1,與Gln和Lys比較,Lys與Gln連接產(chǎn)物可能的峰在719、755、1 180、1 288、1 476、1 602 cm-1(圖4)。其中719、755 cm-1主要是酰胺Ⅳ的CO面內(nèi)彎曲所致,1 180 cm-1是NCαC骨架伸縮振動(dòng)的特征峰,1 288 cm-1主要是酰胺Ⅲ中NH 面內(nèi)彎曲引起的峰,因此1 288 cm-1可作為Gln的γ-羧酰胺基與Lys的酰基形成酰胺鍵(肽鍵)的重要指征,是2個(gè)氨基酸交聯(lián)的重要依據(jù),其峰強(qiáng)可反映谷賴二肽的生成量。

圖4 Lys和Gln交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物的拉曼光譜圖Fig.4 Raman spectra of Lys and Gln cross-linked reaction products

谷賴二肽在1 288 cm-1的拉曼光譜峰強(qiáng)度隨著底物賴氨酸濃度的增加而增大,但當(dāng)比例大于1.1時(shí),峰強(qiáng)增加有限(峰強(qiáng)度3 550.7 a.u.),所以當(dāng)賴氨酸濃度為330 mmol/L,谷氨酰胺濃度為300 mmol/L,即比例1.1為底物的最佳濃度比(圖5-a)。L-賴氨酸和L-谷氨酰胺的添加比例為1.1,谷賴二肽的產(chǎn)量如圖5-b所示。隨著L-谷氨酰胺的濃度從100 mmol/L 增加到600 mmol/L,谷賴二肽在1 288 cm-1的拉曼光譜峰強(qiáng)度隨著底物谷氨酰胺濃度的增加而增大,分別為3 191.8、3 250.1、3 550.7、3 764.7、3 994.6和4 274.7 a.u.。

a-Lys/Gln對(duì)催化反應(yīng)的影響；b-Gln濃度對(duì)催化反應(yīng)的影響圖5 底物的配比和底物濃度對(duì)MTG-MUT2催化反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of substrate ratio and substrate concentration on MTG-MUT2 catalytic reaction

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)前期構(gòu)建的畢赤酵母pro/rDNA-mtg-mut2,在14 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵表達(dá)獲得MTG-MUT2,對(duì)其純化酶的催化交聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行了研究,并探索了糖基化對(duì)酶活力的影響。

研究表明,在pH 為6.0時(shí),誘導(dǎo)WCW為(195±2) g/L,采取甲醇3步補(bǔ)料工藝3.6 mL/(L·h) 5～6 h、7.2 mL/(L·h) 2～3 h和10.8 mL/(L·h)持續(xù)到下罐,產(chǎn)酶速率最快,為8.89 U/g WCW；酶活性最高,達(dá)到3.12 U/mL。一般誘導(dǎo)時(shí)間越長(zhǎng),目的蛋白的表達(dá)量越高,但誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可能會(huì)影響共表達(dá)2種蛋白(前導(dǎo)肽PRO和MTG-MUT2)的平衡[3,10-11],反而會(huì)抑制MTG-MUT2的活性表達(dá),故本研究中誘導(dǎo)時(shí)間不超過(guò)45 h。在優(yōu)化的最適合培養(yǎng)條件下,對(duì)該菌株在14 L發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)1步鎳柱親和層析純化,蛋白純化2.7倍,回收率為87.4%。

表達(dá)的重組蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中正確折疊是其正常分泌的重要條件,這是影響畢赤酵母高效表達(dá)蛋白的重要因素,分子伴侶和N-糖基化對(duì)有些蛋白的正確折疊是必不可少的[20-23]。本研究中Western Blot鑒定結(jié)果顯示MTG-MUT2在34～43 kDa處有3條特異性蛋白帶,表明有2個(gè)位點(diǎn)均參與了MTG-MUT2的糖基化修飾。分析其晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)MTG-MUT2有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)：N282和N297,N282環(huán)繞在活性位點(diǎn)C64附近,推測(cè)通過(guò)N-糖基化修飾增加肽鏈的親水性,從而使肽鏈能夠避免修飾位點(diǎn)與附近其他蛋白發(fā)生疏水作用,從而提高蛋白折疊的可能性,并增大了與底物的接觸面積,賦予其較高的酶活。另一個(gè)糖基化位點(diǎn)N297,與N282相距較近,因位阻作用影響其糖基化以及與底物結(jié)合,從而影響酶活,因而N297只是一個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn),這就解釋了2個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生糖基化的蛋白酶活(10.6 U/mL)要低于1個(gè)位點(diǎn)糖基化(N282)的酶活(14.7 U/mL),但是均高于非糖基化蛋白酶活(8.7 U/mL)。以上研究結(jié)果表明,糖基化有助于MTG-MUT2的正確折疊,增大了與底物的接觸面積,從而賦予其較高的酶活。

本研究還對(duì)該純化酶催化L-谷氨酰胺的?；D(zhuǎn)移給L-賴氨酸的交聯(lián)反應(yīng)條件進(jìn)行了研究,并采用SERS快速、靈敏分析交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物[24-26]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示底物賴氨酸的拉曼特征峰位于651、1 203、1 354、1 518 cm-1,谷氨酰胺的拉曼特征峰位于384、501 cm-1,賴氨酸與谷氨酰胺連接產(chǎn)物可能的峰位于719、755、1 180、1 288、1 476、1 602 cm-1(圖4)。其中1 288 cm-1主要是酰胺Ⅲ中NH 面內(nèi)彎曲引起的峰,因此1 288 cm-1可作為Gln的γ-羧酰胺基與Lys的?；纬甚０锋I(肽鍵)的重要指征,是2個(gè)氨基酸交聯(lián)的重要依據(jù),其峰強(qiáng)可反映谷賴二肽的生成量。確定了賴氨酸和谷氨酰胺的最適添加比例為1.1；在最適反應(yīng)條件下(反應(yīng)溫度55 ℃,最適pH 6.5),當(dāng)谷氨酰胺濃度為600 mmol/L、賴氨酸濃度為660 mmol/L時(shí),反應(yīng)2 h,谷賴二肽在1 288 cm-1的特征峰強(qiáng)度為4 274.7,高于野生酶在同等反應(yīng)條件下峰強(qiáng)的20%(野生酶：2 992.5),顯示出該酶在較高反應(yīng)溫度下較好的氨基酸交聯(lián)反應(yīng)。雙縮脲反應(yīng)適用于分子中含兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵(—CO—NH—)等基團(tuán)的物質(zhì),不能用于二肽的檢測(cè)。研究結(jié)果表明,采用銀溶膠作為SERS基底,能夠快速簡(jiǎn)便、高效靈敏檢測(cè)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶催化的反應(yīng)產(chǎn)物。

綜上所述,MTG-MUT2具有良好的熱穩(wěn)定性和催化效率高的優(yōu)良特性,在工業(yè)生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用潛力。MTG-MUT2催化蛋白質(zhì)內(nèi)或蛋白質(zhì)間交聯(lián)反應(yīng)的性質(zhì),使其在組織工程上有潛在的應(yīng)用,有待后續(xù)研究。