不同栽培年限人參根區(qū)土壤養(yǎng)分酶活性及微生物量的變化

王天佑，丁萬隆，尹春梅，王蓉，李勇*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；

2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118

人參Panax ginsengC.A.Meyer 為五加科多年生宿根草本植物，以干燥根和根莖入藥，是馳名中外的補(bǔ)益類中藥材，具有大補(bǔ)元氣、復(fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智等功效[1]。但人參具有極強(qiáng)的忌連作特性，老參地通常數(shù)十年內(nèi)無法重復(fù)栽參[2]，即使通過撂荒、輪作等傳統(tǒng)模式加以改良也難以恢復(fù)到初始水平[3]。歷史上“伐林栽參”模式雖一定程度上緩解了人參市場的供需矛盾，卻引發(fā)土壤肥力下降、水土流失、生物多樣性減退等諸多生態(tài)問題[4]。深入研究人參連作障礙形成機(jī)制、加快老參地循環(huán)再利用，不僅能促進(jìn)中藥材生產(chǎn)與自然生態(tài)環(huán)境和諧發(fā)展，還有助于推動人參種植模式優(yōu)化升級。

已有研究發(fā)現(xiàn)，連作導(dǎo)致人參根區(qū)土壤營養(yǎng)失衡，根系有機(jī)酸分泌量顯著增加，最終表現(xiàn)為土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、酶活性及理化性狀等的變化[5]。本研究通過對我國人參主產(chǎn)區(qū)不同栽培年限人參根區(qū)土壤pH、養(yǎng)分含量、酶活性及菌群動態(tài)的測定，進(jìn)而分析人參栽培過程中不同土壤因子的動態(tài)變化及其相互聯(lián)系，為闡明人參連作障礙形成機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 試藥

牛肉膏、蛋白胨、虎紅、鏈霉素、葡萄糖、瓊脂、蔗糖購自奧博星生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

SPX-150 型生化培養(yǎng)箱（中儀國科科技有限公司）；UV-2450 型紫外分光光度計（島津儀器有限公司）；萬分之一天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Scout pro 型電子天平（奧豪斯電子天平儀器上海有限公司）；ZHWY-100H 型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；DH-8D 型水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；BSC型生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；LX-B35L型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）。

1.3 樣品

2～5 年生栽參農(nóng)田土（編號為FSG2～FSG5）及對照農(nóng)田土（FSFL）采自吉林省撫松縣北崗鎮(zhèn)（N42°26′55″，E127°34′41″），平均海拔836 m，氣壓91.68 kPa。全部土壤樣本采用五點法[6]取樣，每個樣點隨機(jī)選取6 株健康生長的人參，小心挖出人參根并收集根圍土（與主根距離<5 cm）。將土壤中的石塊、植物殘體、雜草等剔除干凈，分別裝入無菌自封袋，記錄對應(yīng)的人參生長年限。

2 方法

2.1 前處理

樣品加冰袋帶回實驗室，立即過2 mm篩，部分用于土壤微生物分析，剩余室溫風(fēng)干后用于土壤酶活性及營養(yǎng)元素分析。

2.2 土壤酶活性測定

土壤脲酶、酸性磷酸酶、纖維素酶和蔗糖酶活性均采用比色法[7]測定；土壤過氧化氫酶活性采用改良紫外-可見分光光度法測定[8-9]。

2.3 土壤養(yǎng)分測定

土壤pH 測定參照NY/T 1377—2007[10]；土壤有機(jī)質(zhì)測定參照NY/T 1121.6—2006[11]；土壤總氮及總碳測定采用高溫燃燒法[12]；土壤全磷及全鉀測定采用電感耦合等離子體（ICP）定量法[13]；土壤堿解氮測定參照LY/T 1228—2015[14]；土壤有效磷測定參照NY/T 1121.25—2012[15]；土壤速效鉀測定參照NY/T 889—2004[16]。

2.4 土壤微生物

土壤微生物量采用平板稀釋計數(shù)法[17]測定。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌、高氏一號合成培養(yǎng)基培養(yǎng)放線菌、馬丁-孟加拉紅-鏈霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)真菌。細(xì)菌、放線菌30～300 個菌落/皿，真菌10～100個菌落/皿為宜。接菌后28 ℃恒溫培養(yǎng)（細(xì)菌1～2 d、放線菌3～4 d、真菌3～6 d），按公式（1）計算微生物原始濃度。

2.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2016、SPSS 20.0 和GraphPad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計分析及作圖；單因素方差分析（ANOVA）比較不同處理間土壤因子的顯著性差異；Pearson 相關(guān)分析推測土壤因子間的相互關(guān)系；按公式（2）～（5）計算土壤酶活性相對指數(shù)、土壤酶活性綜合指數(shù)、土壤微生物豐富度指數(shù)及土壤微生物豐富度綜合指數(shù)[18]。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤養(yǎng)分分析

本研究中土壤整體偏酸性（pH 4.5～4.7），非栽參農(nóng)田土壤（pH 4.7）相較于栽參農(nóng)田土壤略有改觀，但仍未達(dá)到人參最適生長pH（pH 5.5～6.5）。隨連作年限增加，土壤pH 差異無統(tǒng)計學(xué)意義；非栽參農(nóng)田土壤pH 與栽參5 年土壤差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與其他年生人參栽培土壤差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；土壤堿解氮和速效鉀含量隨人參栽培年限增加在土壤中逐漸積累，且不同年限間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；土壤有效磷呈先上升后降低趨勢，在人參栽種4 年后達(dá)到峰值（169.5 mg·kg-1），5 年后驟降至88.7 mg·kg-1；土壤有機(jī)質(zhì)隨栽培年限增加呈先緩慢降低后升高趨勢，栽種4 年后最低（46.4 mg·kg-1），5 年后最高（60.7 mg·kg-1）；土壤碳氮比（C/N）隨人參種植年限增加呈先降低后升高趨勢；土壤全磷和全鉀含量隨栽培年限增加，呈先上升后降低再上升趨勢（表1）。

表1 栽參及對照土壤養(yǎng)分分布

3.2 土壤酶活性分析

土壤酶活性綜合指數(shù)由大到小依次為對照農(nóng)田土、3 年生農(nóng)田土、4 年生農(nóng)田土、5 年生農(nóng)田土、2 年生農(nóng)田土。隨人參栽培年限增加，土壤酶活性總體呈先上升后下降的趨勢，非栽參土壤相較于老參地土壤酶活性更高（表2）。

表2 栽參及對照土壤酶活性指數(shù)

3.2.1 脲酶活性 研究發(fā)現(xiàn)，不同栽培年限人參根區(qū)土壤脲酶活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。隨人參栽培年限增加，土壤脲酶活性呈先下降后升高趨勢，大致呈V 型。對照農(nóng)田土壤脲酶活性最高（42.46 mg·g-1），3 年生人參根區(qū)土壤脲酶活性最低（9.37 mg·g-1），見圖1。

圖1 栽參及對照土壤脲酶活性（,n=3）

3.2.2 酸性磷酸酶活性 土壤酸性磷酸酶活性隨人參栽培年限增加呈逐漸上升趨勢（圖2），不同栽培年限人參根區(qū)土壤間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。其中，5 年生人參根區(qū)土酸性磷酸酶活性最高（160.33 mg·kg-1）；2 年生人參根區(qū)土酸性磷酸酶活性最低（97.552 mg·kg-1）。

圖2 栽參及對照土壤酸性磷酸酶活性（,n=3）

3.2.3 纖維素酶活性 隨栽培年限增加，土壤纖維素酶活性大致呈倒V 型變化趨勢（圖3）。2 年生人參根區(qū)土壤纖維素酶活性與對照土壤差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余土壤樣本差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。其中，3 年生人參根區(qū)土壤纖維素酶活性最高（1.487 mg·kg-1），5 年生人參根區(qū)土壤纖維素酶活性最低（0.195 mg·kg-1）。

圖3 栽參及對照土壤纖維素酶活性（,n=3）

3.2.4 蔗糖酶活性 土壤蔗糖酶活性隨人參栽培年限增加大致呈倒V 型變化趨勢（圖4），不同栽培年限人參根區(qū)土壤間無統(tǒng)計學(xué)意義。對照土壤蔗糖酶活性最高（0.87 mg·kg-1），其次是3 年生人參根區(qū)土壤（蔗糖酶活性為0.72 mg·kg-1），2 年生人參根區(qū)土壤蔗糖酶活性最低（0.44 mg·kg-1）。

圖4 栽參及對照土壤蔗糖酶活性（,n=3）

3.2.5 過氧化氫酶活性 土壤過氧化氫酶活性隨栽培年限增加呈N 型變化趨勢（圖5）。其中2 年生和5 年生人參根區(qū)土壤過氧化氫酶活性無統(tǒng)計學(xué)意義，其余土壤樣本過氧化氫酶活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。連作3 年人參根區(qū)土壤過氧化氫酶活性（0.972 mg·kg-1）顯著高于其他土壤樣本；4 年生人參根區(qū)土壤過氧化氫酶活性最低（0.203 mg·kg-1）。

圖5 栽參及對照土壤過氧化氫酶活性（,n=3）

3.3 土壤微生物量分析

由不同土壤樣本3 類微生物的統(tǒng)計結(jié)果（表3）可知，在對照土壤中細(xì)菌生物量顯著高于真菌及放線菌；4年生和5年生人參根區(qū)土壤真菌生物量顯著低于對照組（P<0.05），2 年生和3 年生人參根區(qū)土壤真菌生物量顯著高于對照組（P<0.05）；不同年生人參根區(qū)土壤細(xì)菌生物量均顯著低于對照組（P<0.05）；4 年生和5 年生人參根區(qū)土壤放線菌生物量顯著低于對照組（P<0.05），3 年生人參根區(qū)土壤放線菌生物量顯著高于對照組（P<0.05），2 年生人參根區(qū)土壤放線菌生物量與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 栽參及對照土壤微生物種類及生物量（, n=3）

表3 栽參及對照土壤微生物種類及生物量（, n=3）

研究發(fā)現(xiàn)，供試土壤微生物豐富度綜合指數(shù)由大到小依次為3年生農(nóng)田土、非栽參農(nóng)田土、2年生農(nóng)田土、4年生農(nóng)田土和5年生農(nóng)田土（表4）。整體微生物豐富度隨人參栽培年限增加呈先上升后下降趨勢，非栽參土壤微生物豐富度相較于栽參土壤整體水平更高。

表4 栽參及對照土壤微生物豐富度指數(shù)

3.4 土壤因子相關(guān)性分析

如表5 所示，相關(guān)系數(shù)（r）≥0.2 的數(shù)據(jù)占全部數(shù)據(jù)的80.88%。其中，土壤pH 與土壤有機(jī)質(zhì)呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與全磷含量及脲酶活性呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；土壤有機(jī)質(zhì)含量與土壤纖維素酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）；土壤C/N 與土壤全鉀含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與真菌和放線菌生物量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）；土壤全磷含量與土壤脲酶活性呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；土壤全鉀含量與土壤過氧化氫酶活性呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與土壤放線菌生物量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；土壤速效鉀含量與土壤脲酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），與土壤細(xì)菌生物量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）；土壤酸性磷酸酶活性與土壤真菌生物量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）；土壤過氧化氫酶活性與土壤放線菌生物量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。

表5 栽參土壤因子皮爾森相關(guān)分析

4 討論

研究表明，土壤酸化會引發(fā)肥力下降、營養(yǎng)元素流失、重金屬積累、微生物群落結(jié)構(gòu)失衡等問題，這是土壤退化的一個重要表現(xiàn)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，全部供試土壤均偏酸（pH 4.5～4.7），這與前人報道基本符合[20]。土壤總碳及土壤有機(jī)質(zhì)作為土壤肥力水平的重要指標(biāo)，與植物生長及生態(tài)環(huán)境密切相關(guān)。隨人參栽培年限增加，土壤有機(jī)質(zhì)及總碳量逐年降低，直接影響土壤養(yǎng)分供給，加劇人參連作障礙，這與孫海[21]報道一致。氮、磷、鉀在土壤中的濃度高低及存在形式對植物生長具有重要意義。本研究中土壤總氮及堿解氮隨栽培年限增加，均呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢，說明其在土壤中的轉(zhuǎn)化與消耗速率接近，總體水平相對穩(wěn)定；土壤全磷和全鉀與總氮變化趨勢一致，但有效磷呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，速效鉀呈逐漸升高趨勢，且這2 種有效成分含量與非栽參農(nóng)田土壤相差較大，表明在人參種植初期，土壤中初始的磷素便能滿足人參生長初期的消耗，同時鉀的增多顯示為了保證栽參土壤具有良好的滲透勢以及促進(jìn)土壤酶系統(tǒng)的活化，試驗地實施了合理有效的人參種植管理方案。

一般來說，4～5 年生人參正處于生長旺盛時期，對養(yǎng)分需求會比較大，5 年生根區(qū)土壤中的養(yǎng)分含量應(yīng)該低于4 年生人參根區(qū)土壤，然而實際檢測發(fā)現(xiàn)，5年生人參根區(qū)土壤養(yǎng)分反而較4年生人參出現(xiàn)小幅上升，推測與收獲年份為保證人參產(chǎn)量而采取的人為水肥干預(yù)有關(guān)。

本研究對試驗地塊進(jìn)行了嚴(yán)格的肥藥管理，即對該地塊實施集免疫調(diào)節(jié)、促生拮抗、生物刺激、殺菌劑及植物營養(yǎng)類劑于一體的、有效的肥藥調(diào)控以保持土壤的養(yǎng)分供給。多數(shù)肥藥劑量以每75 m2施用1 單位體積（瓶、袋）為基準(zhǔn)（健達(dá)、哈茨木霉和榮亞每3 m2施用1 單位體積）；所有藥劑均按照使用說明溶解，并以噴灌的方式施用。3～5 年生人參肥藥管理方案與1～2 年生不同，除池面消毒外，1～2 年生各進(jìn)行9 次肥藥噴灌，而3～5 年生進(jìn)行10 次，且肥藥配方中3～5 年生使用了更多的殺菌劑和促生拮抗劑，導(dǎo)致各營養(yǎng)水平最終呈現(xiàn)不同程度的上升趨勢。

土壤礦質(zhì)元素及其形態(tài)類型是土壤質(zhì)量的核心，其與土壤酶活性及土壤微生物組成緊密相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，人參根區(qū)土壤纖維素酶、蔗糖酶、過氧化氫酶活性均呈倒V 形變化，這與張亞玉等[22]的報道一致。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，土壤脲酶活性與土壤堿解氮含量正相關(guān)；土壤酸性磷酸酶活性與土壤有效磷含量正相關(guān)；纖維素酶活性與土壤有機(jī)質(zhì)顯著負(fù)相關(guān)。上述結(jié)果說明，土壤酶對土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化及供給的正向作用，且土壤脲酶、酸性磷酸酶以及纖維素酶活性的變化趨勢與堿解氮、有效磷及有機(jī)質(zhì)含量的變化趨勢相對應(yīng)，從側(cè)面印證了土壤酶在礦質(zhì)元素轉(zhuǎn)化中的重要作用。

土壤微生物是養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的源和庫，其在土壤礦質(zhì)元素轉(zhuǎn)化及養(yǎng)分供給中扮演重要角色。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著人參栽植年限的增加，人參根區(qū)土壤真菌、細(xì)菌及放線菌豐富度指數(shù)均不斷降低，微生物種群趨于單一化，這與前人的研究結(jié)果一致[23-24]。分析發(fā)現(xiàn)，r≥0.2 的數(shù)據(jù)占全部數(shù)據(jù)的80.88%。上述研究結(jié)果表明，土壤微生物、礦質(zhì)元素及酶活性等因子間關(guān)系非常復(fù)雜，人參栽培過程中土壤微生態(tài)失衡以及病原物含量的增加，是人參連作障礙形成的主要原因之一。