HPLC同時測定杞菊地黃丸中7個成分含量△

王小芳，鄭倩倩，路麗娟

石家莊市食品藥品檢驗中心，河北 石家莊 050011

杞菊地黃丸出自《麻疹全書》，現(xiàn)收載于《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典）2020 年版（一部），由枸杞子、菊花、熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉8 味中藥組成，可用于治療肝腎不足、陰虛陽浮、頭暈耳鳴、羞明流淚、視物昏花癥狀，臨床主要用于治療干眼癥、高血壓、高血脂、早期老年黃斑變性、慢性結(jié)腸炎、腦震蕩后遺癥等[1-5]。

中藥復(fù)方制劑是多成分協(xié)同發(fā)揮治療作用，僅檢測單一成分不能全面評價其內(nèi)在質(zhì)量，多組分評價模式已成為中藥質(zhì)量控制的一種發(fā)展趨勢。目前，關(guān)于杞菊地黃丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究更多的是關(guān)于莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚的含量測定[6-10]，未檢索到對其他成分的含量測定和多組分質(zhì)量控制的文獻報道。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）梯度洗脫，選取酒萸肉中莫諾苷、馬錢苷，牡丹皮中芍藥苷、丹皮酚，菊花中綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩釣闄z測目標(biāo)成分，對杞菊地黃丸中7 個成分進行同時測定，為全面評價該制劑質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ARC 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；CPA225D 型電子天平（德國賽多利斯公司）；Elmasonic P 型超聲波清洗儀（德國Elma 公司）；DK-98-Ⅱ型水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品芍藥苷（批號：110736-201640，純度：95.2%）、莫諾苷（批號：111998-201602，純度：96.3%）、馬錢苷（批號：111640-201707，純度：99.2%）、丹皮酚（批號：110708-201407，純度：100%）、綠原酸（批號：110753-201716，純度：99.3%）、木犀草苷（批號：111720-201408，純度：94.9%）、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸（批號：111782-201706，純度：97.3%）購自中國食品藥品檢定研究院。

杞菊地黃丸（大蜜丸）購自北京同仁堂科技發(fā)展有限公司制藥廠（批號分別為16013106、17010779、17010781）、藥都制藥集團股份有限公司（批號分別為171101、170401）、天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司（批號：115495）、北京御生堂集團石家莊制藥有限公司（批號：17101007）、天津中新藥業(yè)集團股份有限公司達仁堂制藥廠（批號：5480075）；杞菊地黃丸（水蜜丸）購自太極集團重慶桐君閣藥廠有限公司（批號：17110015）、湖北瑞華制藥有限責(zé)任公司（批號：180110）；甲醇、乙腈、冰醋酸均為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Inertsil ODS-3 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-甲醇（B）-0.2%冰醋酸溶液（C）梯度洗脫（0～10 min，10%～12%A，0～5%B；10～20 min，12%～14%A，5%～10%B；20～30 min，14%～15%A，10%～25%B；30～40 min，15%A，25%～40%B；40～50 min，15%～25%A，40%～45%B）；檢測波長，240 nm（0～18.5、21～25 min，莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷）、348 nm（18.5～21.0、25～42 min，綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩幔?、274 nm（42～60 min，丹皮酚）；流速：0.9 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣體積：10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岣鲗φ掌愤m量，加70%的甲醇制成質(zhì)量濃度分別為482.66、501.95、489.33、1038.15、125.83、62.98、233.99 μg·mL-1的對照品儲備液，精密量取對照品儲備液1 mL 置25 mL 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制備成分別含上述成分19.31、20.08、19.57、41.53、5.03、2.52、9.36 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取剪碎的大蜜丸（批號：17010779）約1.2 g，精密稱定后置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，密塞后稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，取出，放冷，再稱定質(zhì)量。用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻后濾過，取續(xù)濾液即得供試品溶液[11]。

2.4 陰性樣品溶液制備

按照樣品處方和工藝，分別制成缺酒萸肉、牡丹皮、菊花的陰性樣品，按2.3項下方法制備，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性考察 分別取陰性樣品溶液、混合對照品溶液、供試品溶液，按2.1 項下色譜條件測定（圖1）。由圖1可知，樣品中各測定峰分離良好。缺牡丹皮陰性樣品溶液在與芍藥苷、丹皮酚色譜峰相對應(yīng)的保留時間無色譜峰；缺酒萸肉陰性樣品溶液在與莫諾苷、馬錢苷色譜峰相對應(yīng)的保留時間無色譜峰；缺菊花陰性樣品溶液在綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩嵘V峰相對應(yīng)的保留時間無色譜峰，表明陰性無干擾。

圖1 混合對照品溶液、陰性樣品溶液及杞菊地黃丸樣品高效液相色譜圖

2.5.2 線性關(guān)系考察 取2.2項下混合對照品儲備液適量，分別加70%甲醇稀釋100、50、25、10、5、1倍，制得不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行線性回歸，結(jié)果見表1。由表1 可知，莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸在試驗范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 杞菊地黃丸中7個化學(xué)成分的回歸方程及線性范圍

2.5.3 精密度試驗 取同一批供試品（批號：17010779）按2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定6 次，計算莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岱迕娣e的RSD 分別為0.64%、0.80%、0.72%、0.10%、0.71%、1.02%、0.74%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗 取同一批供試品（批號：17010779），按2.3 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在2.1項下色譜條件進樣測定，計算6份樣品的含量，莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷康腞SD分別 為1.08%、1.73%、1.08%、1.63%、1.60%、1.74%、1.14%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 取同一樣品（批號：17010779）按2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，測得莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岱迕娣e的RSD分別為1.37%、0.70%、1.05%、0.20%、1.87%、1.15%、1.16%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗 精密稱取同一樣品（批號：17010779）約0.6 g，共6份，置于具塞錐形瓶中，精密加入混合對照品溶液（莫諾苷48.266 μg·mL-1、馬錢苷50.195 μg·mL-1、芍藥苷48.933 μg·mL-1、丹皮酚103.815 μg·mL-1、綠原酸12.583 μg·mL-1、木犀草苷6.298 μg·mL-1、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?3.399 μg·mL-1）5 mL，再精密加入70%甲醇20 mL，之后按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率，結(jié)果莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬幕厥章史謩e為99.73%、101.00%、98.67%、99.19%、102.56%、101.66%、100.98%，RSD分別為1.29%、0.51%、1.21%、1.01%、0.97%、1.07%、0.47%，結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度良好，見表2。

表2 杞菊地黃丸中7個成分含量測定的加樣回收率試驗

2.5.7 樣品含量測定 取不同廠家10 批樣品，按2.3 項下方法制備供試品溶液，2.1 項下色譜條件進樣測定，計算各成分含量，結(jié)果見表3。

表3 不同廠家杞菊地黃丸中7個成分的含量測定（n=2）mg·g-1

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法

本實驗對比了不同的提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、甲醇）、提取方法（超聲提取、加熱回流提?。?、提取時間（30、45、60、75 min）對杞菊地黃丸中芍藥苷、莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩? 個成分含量的影響。最終確定制備方法為70%甲醇加熱回流提取1 h[11]。

3.2 流動相選擇及優(yōu)化

本實驗對比了不同種類的流動相，首先參照《中國藥典》2020 年版采用乙腈-磷酸溶液[11]、再采用乙腈-冰醋酸溶液梯度洗脫，結(jié)果3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬姆蛛x效果不好；后采用甲醇-磷酸溶液、甲醇-冰醋酸溶液，結(jié)果木犀草苷分離效果不好且分析時間過長；之后選擇了甲醇-乙腈-冰醋酸溶液，并通過優(yōu)化流動相比例，使各峰有較好的分離度，因此，最終確定以甲醇-乙腈-0.2%冰醋酸為流動相。

本實驗采用HPLC 同時測定了杞菊地黃丸中芍藥苷、莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬暮?，該方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考。