響應(yīng)曲面法優(yōu)化敗毒散提取工藝△

徐坤勇，郭建忠，顏娟，韻國(guó)萍*

1.張家口市第一醫(yī)院 藥學(xué)部，河北 張家口 075000；

2.河北北方學(xué)院 附屬第一醫(yī)院 藥學(xué)部，河北 張家口 075000

敗毒散最早源于宋代《太平惠民和劑局方》，現(xiàn)收錄于《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版，為成方制劑，由枳殼（100 g）、黨參（100 g）、茯苓（100 g）、甘草（50 g）、川芎（100 g）、羌活（100 g）、獨(dú)活（100 g）、柴胡（100 g）、前胡（100 g）及桔梗（100 g）組成。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，敗毒散有發(fā)汗解表、散風(fēng)祛濕的功能，臨床主要用于外感熱病、憎寒壯熱、項(xiàng)強(qiáng)頭痛、四肢酸痛、噤口痢疾、無(wú)汗鼻塞、咳嗽有痰[1]。敗毒散在現(xiàn)代臨床中主要用于治療急性頜下淋巴結(jié)炎、呼吸系統(tǒng)疾病、流行性腮腺炎、急性病毒性肝炎等[2]。枳殼的主要成分為柚皮苷和新橙皮苷，具有誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡、抗基因突變、抗菌、抗炎、抗過(guò)敏、抗微生物、抗腫瘤、保護(hù)受損心肌等藥理作用[3-6]，故柚皮苷和新橙皮苷常作為評(píng)價(jià)枳殼藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)[7-9]。

敗毒散方原用法為燉湯內(nèi)服，存在煎煮、服用和攜帶不方便等問(wèn)題。其顆粒劑具有服用和攜帶方便、載藥量大、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可以滿足患者長(zhǎng)期服用和臨床用藥需要[10]。響應(yīng)曲面法能直觀反映各影響因素之間的交互關(guān)系，快速得到最佳工藝時(shí)各因素的水平[11]。經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于敗毒散提取工藝的報(bào)道不多。因此，本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以收膏率和柚皮苷、新橙皮苷含量的綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)選敗毒散提取工藝，擬將其制備成顆粒劑，為敗毒散制劑后續(xù)研究開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；FW-400A 型傾斜式萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；GZX-9140MBE 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇榮華儀器有限公司）；AE/240 型電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］。

1.2 試藥

枳殼、黨參、茯苓、甘草、川芎、羌活、獨(dú)活、柴胡、前胡及桔梗10 味中藥均購(gòu)自張家口市張?jiān)兴庯嬈邢薰荆ㄅ?hào)分別為20190901、20191002、20200203、20200301、20191201、20190701、20190602、20200401、20181101、20190301），經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心楊光副研究員鑒定均為正品。

對(duì)照品柚皮苷（重慶對(duì)照品科技有限公司，批號(hào)：110722-201312，純度≥98%）；對(duì)照品新橙皮苷（西安旭煌技術(shù)有限公司，批號(hào)：N-19020，純度≥97%）；乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 新橙皮苷、柚皮苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 參考《中國(guó)藥典》2020 年版[1]，色譜柱為Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.4%磷酸水溶液（20∶80）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量為5 μL；理論板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。見(jiàn)圖1。

圖1 敗毒散中柚皮苷及新橙皮苷HPLC圖

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱定新橙皮苷對(duì)照品80.03 mg、柚皮苷對(duì)照品80.00 mg，置于100 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，超聲使溶解，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。使用時(shí)，精密量取上述溶液5 mL，置于25 mL 量瓶中，適量甲醇稀釋，制成新橙皮苷和柚皮苷質(zhì)量濃度均為160 μg·mL-1的溶液，冰箱冷藏備用。

2.1.3 供試品溶液及陰性樣品溶液的制備 按敗毒散處方比例分別稱取各飲片，總量為95 g，粉碎成粗粉，過(guò)篩，混勻。取上述粗粉約20 g，精密稱定，按各因素條件提取，放冷后濾過(guò)，使用蒸發(fā)皿蒸干，加適量甲醇溶解，并用甲醇洗滌干凈，溶液及洗滌液轉(zhuǎn)移至1000 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，超聲，搖勻，作為供試品儲(chǔ)備液。使用時(shí)，移取上述儲(chǔ)備液10 mL，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取中間續(xù)濾液5 mL，即得。同法制備不含敗毒散的溶液即為陰性樣品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取2.1.2項(xiàng)下新橙皮苷、柚皮苷混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為8、32、64、120、160、240 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積。分別以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=5.49×103X+4.36×104，r=0.999 4，質(zhì)量濃度為8～240 μg·mL-1線性關(guān)系良好；柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=4.93×103X+3.77×104，r=0.999 7，質(zhì)量濃度為8～240 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密量取2.1.2 項(xiàng)下新橙皮苷、柚皮苷混合對(duì)照品溶液5 μL，按照2.1.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，分別測(cè)定新橙皮苷、柚皮苷峰面積，新橙皮苷峰面積RSD 為0.97%，柚皮苷峰面積RSD為0.82%。說(shuō)明該方法精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批敗毒散（批號(hào)：20200402）粗粉6份，按2.1.3項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果新橙皮苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.13 mg·g-1（每克敗毒散含枳殼以新橙皮苷計(jì)，下同），RSD 為1.56%，柚皮苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.08 mg·g-1（每克敗毒散含枳殼以柚皮苷計(jì)，下同），RSD為1.42%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密量取2.1.3 項(xiàng)下同一供試品溶液5 μL，分別于0、1、3、6、12、18、24 h按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果新橙皮苷峰面積RSD 為1.84%、柚皮苷峰面積RSD 為1.27%。說(shuō)明在制備后24 h內(nèi)供試品溶液質(zhì)量穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)含量的敗毒散（含新橙皮苷約為4.15 mg·g-1、含柚皮苷約為7.06 mg·g-1）粗粉6 份，精密稱定，每份約2 g。分別加入新橙皮苷對(duì)照品約8.30 mg，柚皮苷對(duì)照品約14.12 mg，按2.1.3項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定（表1）。新橙皮苷平均回收率為98.90%，RSD 為1.97%；柚皮苷的平均回收率為97.74%，RSD為1.76%，說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表1 敗毒散中柚皮苷及新橙皮苷含量測(cè)定的加樣回收率試驗(yàn)

2.2 收膏率測(cè)定

精密量取2.1.3 項(xiàng)下供試品儲(chǔ)備液200 mL，轉(zhuǎn)移至已干燥質(zhì)量恒定的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，烘箱105 ℃干燥3 h，干燥器中冷卻，待降至常溫，立即稱質(zhì)量。收膏率按公式（1）計(jì)算。

2.3 提取工藝單因素考察

2.3.1 提取工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)的建立 在實(shí)際生產(chǎn)中，收膏率常作為控制指標(biāo)之一，確定為次要指標(biāo)，賦予20%的權(quán)重；主要指標(biāo)確定為柚皮苷、新橙皮苷含量，各賦予40%的權(quán)重。按公式（2）計(jì)算綜合得分（Y）[12]。

式中，R為收膏率，Rmax為收膏率最大值；Cn為柚皮苷含量，Cnmax為柚皮苷含量最大值；C為新橙皮苷含量，Cmax為新橙皮苷含量最大值。

2.3.2 提取方法考察

2.3.2.1 超聲提取法 取敗毒散粗（批號(hào)：20200402）粉約20 g，精密稱定，加無(wú)水乙醇200 mL 超聲（400 W，40 kHz）提取2 次，每次2 h，提取液按2.1.3 項(xiàng)下供試品溶液制備方法處理。測(cè)定收膏率和柚皮苷、新橙皮苷含量，并計(jì)算綜合得分，試驗(yàn)平行3次。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2.2 乙醇回流提取法 取敗毒散（批號(hào)：20200402）粗粉約20 g，精密稱定，加無(wú)水乙醇200 mL回流提取提取2次，每次2 h，其余同超聲提取法。見(jiàn)表2。

表2 敗毒散提取方法考察

2.3.2.3 水煎煮法 取敗毒散（批號(hào)：20200402）粗粉約20 g，精密稱定，200 mL 水煎煮提取2 次，每次2 h，其余同超聲提取法。見(jiàn)表2。

結(jié)果表明，水煎煮法收膏率最高；柚皮苷、新橙皮苷含量及綜合得分略低于回流提取法和超聲提取法，但相差不大，從經(jīng)濟(jì)因素考慮，確定提取方法為水煎煮法。

2.3.3 液料比的考察 取敗毒散（批號(hào)：20200402）粗粉約20 g，精密稱定，水煎煮法提取2次，每次2 h，考察不同液料比時(shí)綜合得分，平行3份。見(jiàn)表3。綜合得分隨液料比增加而增大，而后減小，綜合得分最高時(shí)，液料比為12∶1，故液料比中心點(diǎn)確定為12∶1。

表3 敗毒散不同液料比對(duì)各評(píng)價(jià)指標(biāo)及綜合得分的影響

2.3.4 提取時(shí)間的考察 取敗毒散（批號(hào)：20200402）粗粉約20 g，精密稱定，200 mL 水煎煮提取2次，考察不同提取時(shí)間時(shí)綜合得分，平行3份。見(jiàn)表4。綜合得分隨提取時(shí)間增加而增大，而后減小，綜合得分最高時(shí)，提取時(shí)間為3 h，故提取時(shí)間中心點(diǎn)確定為3 h。

表4 敗毒散不同提取時(shí)間對(duì)各評(píng)價(jià)指標(biāo)及綜合得分的影響

2.3.5 提取數(shù)的考察 取敗毒散（批號(hào)：20200402）粗粉約20 g，精密稱定，200 mL 水煎煮提取2 h，考察不同提取數(shù)時(shí)綜合得分，平行3 份。見(jiàn)表5。綜合得分最高時(shí)，提取數(shù)為4次，提取數(shù)為3次時(shí)略低于4次，考慮生產(chǎn)成本和提取效率，故提取數(shù)確定為3次。

表5 敗毒散不同提取數(shù)對(duì)各評(píng)價(jià)指標(biāo)及綜合得分的影響

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化敗毒散提取工藝

2.4.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件建立響應(yīng)面分析模型。通過(guò)單因素考察確定3 個(gè)影響因素，分別為液料比（A）、提取時(shí)間（B）及提取數(shù)（C）。因素水平見(jiàn)表6。響應(yīng)值為敗毒散提取評(píng)價(jià)綜合得分，建立Box-Behnken 分析模型，進(jìn)行提取工藝優(yōu)選，響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 敗毒散提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

2.4.2 模型建立及顯著性檢驗(yàn) 將表7 試驗(yàn)條件及結(jié)果導(dǎo)入Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行回歸分析。Y對(duì)A、B、C 的多項(xiàng)二次回歸模型為Y=86.21+15.41A+2.82B -2.34C -4.06AB -5.28AC+0.50BC-21.25A2-3.04B2-5.93C2，通過(guò)方差分析考察其顯著性。結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可知，失擬項(xiàng)P=0.101 8＞0.05，模型P<0.000 1，r=0.991 4，表明未知因素干擾小，失擬項(xiàng)不顯著，回歸模型具極顯著性，擬合程度好，該模型可用于敗毒散提取工藝條件的分析和預(yù)測(cè)。由方差分析可知，一次項(xiàng)B、C 因素對(duì)綜合得分影響顯著，A 因素影響具極顯著性；交互項(xiàng)BC 因素對(duì)綜合得分影響不顯著，AB 因素影響具顯著性，AC因素影響具極顯著性；二次項(xiàng)B2因素對(duì)綜合得分影響顯著，A2、C2因素影響具極顯著性。由方差分析單因素F值可看出，C 因素對(duì)綜合得分影響最小，B 因素次之，A 因素最大。綜上所述，各因素的影響順序?yàn)镃

表7 敗毒散提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表8 敗毒散提取工藝響應(yīng)面方差分析結(jié)果

2.4.3 響應(yīng)面分析 二維平面圖等高線形狀和三維曲面圖坡度可反映各因素交互作用水平，當(dāng)?shù)雀呔€呈橢圓形且密集時(shí)，表明交互作用強(qiáng)，當(dāng)三維曲面圖陡峭，坡度大時(shí)，說(shuō)明影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[13]。通過(guò)Design Expert 8.0.6 軟件分析得到反映三因素交互作用水平的二維平面等高線圖和三維曲面圖。見(jiàn)圖2～4。圖2～3中二維平面圖等高線呈橢圓形且密集，三維響應(yīng)曲面坡度大，說(shuō)明A因素和B、C因素交互作用強(qiáng)，圖4 中二維平面圖等高線雖近似橢圓形但不密集，且三維響應(yīng)曲面坡度小，說(shuō)明B、C因素交互作用弱，與方差分析結(jié)果相符。

圖2 液料比與提取時(shí)間對(duì)敗毒散提取工藝影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖

圖3 液料比與提取數(shù)對(duì)敗毒散提取工藝影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖

圖4 提取時(shí)間與提取數(shù)對(duì)敗毒散提取工藝影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖

2.4.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 以Design Expert 8.0.6 軟件分析敗毒散提取工藝，當(dāng)液料比為13.81∶1，提取時(shí)間為2.84 h，提取數(shù)為2.32 次時(shí)，綜合得分最大，預(yù)測(cè)值為89.13%?？紤]生產(chǎn)實(shí)際，將敗毒散提取工藝參數(shù)調(diào)整為液料比14∶1，提取時(shí)間170 min，提取2 次。按敗毒散處方比例分別稱取各飲片，總量為950 g，平行3 次，以驗(yàn)證工藝的可靠性和模型的合理性。結(jié)果RSD 為0.55%，表明工藝可靠且模型合理。

3 討論

創(chuàng)制中藥新劑型過(guò)程中，提取工藝對(duì)中藥提取效果有直接影響，進(jìn)而影響療效。傳統(tǒng)復(fù)方中藥組分復(fù)雜，為充分提取藥效組分，故選用多指標(biāo)對(duì)敗毒散提取工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)。收膏率可反映其他組分的提取程度，為考察中藥提取效果的重要指標(biāo)[14]；新橙皮苷和柚皮苷為枳殼含量較高的主要活性物質(zhì)，也是《中國(guó)藥典》2020 年版枳殼藥材考察含量的指標(biāo)，且在《中國(guó)藥典》2020 年版敗毒散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定項(xiàng)，以枳殼中柚皮苷含量作為唯一控制指標(biāo)，因此，在許多含有枳殼的中藥制劑中，大多采用柚皮苷和新橙皮苷作為考察指標(biāo)。本研究以收膏率和新橙皮苷、柚皮苷含量為綜合考察指標(biāo)優(yōu)化敗毒散提取工藝。

對(duì)中藥提取因素多參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，各影響因素與響應(yīng)值之間往往線性關(guān)系不佳。通過(guò)考察各影響因素之間的交互作用，擬合最佳提取工藝，建立非線性回歸模型的響應(yīng)曲面法，是一種精度高、預(yù)測(cè)性好且應(yīng)用范圍大的統(tǒng)計(jì)方法，近幾年廣泛應(yīng)用于中藥活性成分提取工藝的優(yōu)化[15-17]。響應(yīng)曲面法中擬合結(jié)果和單因素的取值范圍關(guān)系密切，本研究通過(guò)考察單因素影響試驗(yàn)，先確定敗毒散提取方法為水煎煮法，后確定各因素的中心點(diǎn)和取值范圍。其中液料比的中心點(diǎn)為12∶1，提取時(shí)間的中心點(diǎn)為3 h，提取數(shù)的中心點(diǎn)為3 次。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件分析，得到擬合度好、極顯著的多項(xiàng)二次回歸模型。方差和響應(yīng)面分析結(jié)果表明，優(yōu)選工藝方法可靠、準(zhǔn)確性好。敗毒散最佳提取工藝條件為液料比14∶1，提取時(shí)間170 min，提取2 次，在該條件下，綜合得分為87.67%，與預(yù)測(cè)值接近。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)選工藝重復(fù)性好、條件可靠。