長豐地區(qū)南瓜白粉病病原菌生理小種鑒定

夏偉偉 鄧竹根 戴祖云 韋小飛 李曼

摘? ? 要：為明確安徽省合肥市長豐地區(qū)南瓜白粉病病原菌種類及其生理小種，于2020年春季在長豐縣吳山鎮(zhèn)、水湖鎮(zhèn)、崗集鎮(zhèn)、造甲鄉(xiāng)等地采集16份白粉病病原菌。通過觀察病原菌的形態(tài)，并以長豐縣吳山地區(qū)的白粉病菌總DNA為模板擴(kuò)增其rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列，經(jīng)過測序比對，推斷其為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。最后采用國際公認(rèn)的13個(gè)甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主進(jìn)行接種，根據(jù)抗感反應(yīng)，確定長豐地區(qū)南瓜白粉病病原菌生理小種為Podosphaera xanthii race 1。初步明確了2020年春季合肥長豐地區(qū)南瓜白粉病病原菌的生理小種，為下一步該地區(qū)南瓜抗白粉病新品種選育奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：南瓜;白粉病菌;生理小種;鑒定

中圖分類號：S642.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）11-024-06

Identification of physiological race of pumpkin powdery mildew in Changfeng region

XIA Weiwei1， DNEG Zhugen1， DAI Zuyun1，2， WEI Xiaofei1， LI Man2

（1. Anhui Jianghuai Hortriculture Seeds Co.， Ltd.， Hefei 230031， Anhui， China; 2. Anhui Agricultural University， Hefei 230036， Anhui， China）

Abstract： In order to verify the species and physiological races of pumpkin powdery mildew in Changfeng region， Hefei City， Anhui Province. In the spring of 2020， a total of 16 powdery mildew pathogens were collected in Wushan， Shuihu， Gangji， and Zaojia in Changfeng region. Through morphological observation， and using powdery mildew DNA from Wushan area of Changfeng region as a total DNA template to amplify its rDNA internal transcribed spacer （ITS） sequence. After sequencing and comparison， it was inferred to confirm that it was Podosphaera xanthii. Then the 13 internationally recognized? race differenciation host were used to identify the races. Based on the resistance to susceptibility， Podosphaera xanthii physiology race 1 was determined as the pathogenic physiology race of pumpkin powdery mildew in Changfeng region on the spring of 2020. In this study， we had identified the physiological races of powdery mildew pathogen of pumpkin in Changfeng area of Hefei in the spring of 2020， which laid a foundation for breeding new varieties of pumpkin resistant to powdery mildew in this area.

Key words： Pumpkin; Powdery mildew; Physiological race; Identification

南瓜屬于葫蘆科（Cucurbitaceae）南瓜屬（Cucurbita）一年生蔓生草本植物，營養(yǎng)豐富，具有藥用和食用價(jià)值[1]。南瓜原產(chǎn)于墨西哥到中美洲一帶，明代傳入中國，并被廣泛種植。南瓜在生長周期內(nèi)易受多種病害侵染，白粉病是主要病害之一。白粉病在南瓜生長中后期發(fā)病，后期植株葉片布滿白粉病病菌孢子，形成一層厚厚的白粉層，嚴(yán)重阻礙植物進(jìn)行光合作用，導(dǎo)致果實(shí)減產(chǎn)、品質(zhì)下降[2-4]。

瓜類白粉病病原菌主要有3個(gè)屬6個(gè)種：白粉菌屬（Erysiphe）、內(nèi)絲白粉菌屬（Leveillula）及單囊殼屬（Podosphaera），6個(gè)種分別是白粉菌屬4個(gè)，為E. cichoracearum、E. communis、E. polygoni和E. polyphaga;內(nèi)絲白粉菌屬1個(gè)，為L. taurica;單囊殼屬1個(gè)，為 P. xanthii [5]。其中對P. xanthii研究最多，已發(fā)現(xiàn)其有11個(gè)生理小種，分別是生理小種 0、1、2 US、2 France、3、4、5、N1、N2、N3和N4[6]。

白粉病病原菌主要是通過形態(tài)觀察、ITS rDNA序列分析及鑒別寄主抗感反應(yīng)的方法進(jìn)行鑒定。張怡等[7]利用形態(tài)觀察及 ITS rDNA 序列分析方法鑒定河南省周口市和商丘市的瓜類白粉病病原菌，結(jié)果表明白粉病病原菌均為Podosphaera xanthii。肖仲久等[8]利用同樣的方法對貴州省貴陽市、遵義市、六盤水市以及安順市南瓜白粉病菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，白粉病病原菌均為 Podosphaera xanthii 。李蘋芳、蘇瑞、劉東順等[9-10]采用國際通用13個(gè)甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主對不同地區(qū)的白粉病菌進(jìn)行鑒定，確定江浙滬和新疆地區(qū)生理小種分別為race1、race5，甘肅地區(qū)白粉病生理小種為2 Frace和N2。屈淑平等[1]通過形態(tài)觀察、ITS rDNA序列分析方法及甜瓜生理小種鑒別體系抗感反應(yīng)表現(xiàn)，鑒定出黑龍江地區(qū)白粉病病原菌為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii），生理小種為2 France。

近幾年來，由于南瓜的經(jīng)濟(jì)效益逐年提高，特別是西洋板栗小南瓜口感、風(fēng)味及營養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，加上政府財(cái)政支持，長豐縣種植面積達(dá)到667 hm2。為調(diào)查長豐地區(qū)侵染南瓜白粉病病原菌種類及生理小種，筆者通過對長豐地區(qū)白粉病病原菌形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察、分析白粉病病原菌ITS序列，同時(shí)采用國際通用的13個(gè)甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主試驗(yàn)，以確定長豐地區(qū)病原菌種類及其生理小種，為該地區(qū)南瓜抗白粉病新品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用國際通用鑒別寄主：Iran H、Top mark、Vedran-tais、PMR45、PMR5、MR29、Edisto47、PI 414723、MR1、PI 124111、PI 124112、PMR6、Nantais 和Oblong，由淮北師范大學(xué)、武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院和東北農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈。白粉病寄主選用易感病南瓜自交系5802，由安徽江淮園藝種業(yè)股份有限公司提供。南瓜自交系5802于2020年春季種植在合肥市長豐縣吳山鎮(zhèn)江淮園藝農(nóng)業(yè)示范園，用于病原菌分離與鑒定。甜瓜鑒別寄主于2020年秋季種植于合肥市長豐縣吳山鎮(zhèn)江淮園藝農(nóng)業(yè)示范園大棚。甜瓜鑒別寄主白粉病的抗感反應(yīng)見表1。

于2020年春季在長豐縣吳山鎮(zhèn)、水湖鎮(zhèn)、崗集鎮(zhèn)和造甲鄉(xiāng)等地采集16份自然發(fā)病的南瓜植株葉片。

1.2 方法

1.2.1 白粉病病原菌分離純化 參照屈淑平等[1]的方法，將2020年6月中旬收集的白粉病菌分離純化，將純化后的單菌落置于吐溫-20溶液中，制成濃度為2.5×105～5.0×105個(gè)·mL-1孢子懸浮液，通過噴霧法對生長至2片真葉的健康南瓜幼苗進(jìn)行接種，置于28 ℃、濕度80%環(huán)境中培養(yǎng)，經(jīng)4次分離純化后利用易感病南瓜植株擴(kuò)繁，活體保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 白粉病病原菌形態(tài)觀察 參照王佩鈴等[11]、梁巧蘭等[12]方法，觀察白粉病病菌分生孢子特征。

1.2.3 致病性檢測 按照科赫氏法則檢驗(yàn)白粉病病原菌致病性。參照屈淑平等[1]的方法，取分離純化后南瓜葉片白粉菌于吐溫-20溶液中，制成2.5×105～5.0×105個(gè)·mL-1孢子懸浮液。種植30株南瓜幼苗。當(dāng)植株長至2片真葉時(shí)，取15株幼苗噴施孢子懸浮液于南瓜葉片上，15株幼苗噴施滴加吐溫-20的無菌水溶液作對照。置于28 ℃、濕度80%環(huán)境中培養(yǎng)，觀察植株發(fā)病情況。

1.2.4 白粉病病原菌分子鑒定 南瓜白粉病病原菌總DNA提取采用天根植物基因組DNA提取試劑盒（DP305）。以南瓜白粉病病原菌總DNA為模板，利用真菌核糖體ITS區(qū)段通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）、ITS4（5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 體 系 為 20 μL：10× Buffer 2 μL，dNTP 0.2 μL，上下游引物各1.0 μL，Taq酶0.2 μL，ddH2O 14.6 μL，DNA模板1.0 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共32個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并進(jìn)行純化。把純化的PCR產(chǎn)物送上海英濰捷基生物公司測序。將南瓜白粉病病原菌ITS序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，利用軟件Lasergene進(jìn)行序列處理、分析。采用MegAlign方法進(jìn)行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 白粉病病原菌生理小種鑒定 甜瓜白粉病病原菌13個(gè)鑒別寄主分別播種于12 cm×12 cm塑料花盆中，在4葉1心期進(jìn)行噴霧接種，接種濃度為105個(gè)·mL-1，每個(gè)材料接10株苗，3次重復(fù)。接種后放置于長1.5 m、寬0.4 m、高1.8 m的2層不銹鋼架內(nèi)，架子四周與頂部用塑料薄膜封閉，架子置于組培室內(nèi)。使用空調(diào)及加濕器，控制溫度28 ℃、濕度80%，接菌 15 d 后觀察鑒別寄主發(fā)病情況。鑒定標(biāo)準(zhǔn)見表1，病情指數(shù)（DI）計(jì)算參照文獻(xiàn)[1]見表2。

病情指數(shù)（DI）計(jì)算如下：DI=Σ（sini）·（5N）-1·100。式中，si為發(fā)病等級，ni為相應(yīng)發(fā)病等級植株數(shù)目，N為調(diào)查總株數(shù)觀測量。0

1.3 室內(nèi)分子鑒定及小種鑒定

白粉病病原菌分離純化、形態(tài)觀察、分子及小種鑒定試驗(yàn)于2020年6—8月在安徽省合肥市長豐縣吳山鎮(zhèn)橋沖村江淮園藝示范園分子實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜白粉病病原菌的形態(tài)鑒別

將采集的16份南瓜白粉病病原菌分別進(jìn)行顯微觀察，結(jié)果顯示，視野下不同來源的白粉菌分生孢子均呈廣橢圓形，內(nèi)含多個(gè)纖維狀體，且串生成念珠狀，其分生隔膜有2～4個(gè)（圖1）?？沙醪脚卸?，16份南瓜白粉病菌都是單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。

2.2 病原菌致病性檢測

將長豐吳山地區(qū)的白粉病病原菌分離純化，純化后白粉病病原菌制作成懸浮液，采用噴霧接種法接種于5802南瓜幼苗葉片上。15 d后南瓜葉片表面出現(xiàn)小的圓形白色粉狀斑點(diǎn)，25 d后植株葉片白粉斑點(diǎn)擴(kuò)散變大直至布滿整個(gè)南瓜葉片，發(fā)病狀態(tài)與自然發(fā)病情況相似（圖2）。再次觀察白粉病病原菌形態(tài)，發(fā)現(xiàn)其分生孢子、纖維狀體等形態(tài)特征與自然發(fā)病植株表現(xiàn)一致。結(jié)果表明，長豐吳山地區(qū)純化的白粉菌為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。其余3個(gè)地區(qū)檢測方法一致，顯示均為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。鑒定結(jié)果表明，16份白粉病病原菌均為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。

2.3 病原菌的分子檢測

以長豐吳山地區(qū)南瓜白粉菌總DNA為模板，用通用引物 ITS1、ITS4 進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)電泳可見一條約為564 bp的特異性條帶（圖3）。

該特異性條帶經(jīng)純化測序，在NCBI上進(jìn)行BLAST比對分析，同時(shí)運(yùn)用軟件Lasergene MegAlign將序列與不同地區(qū)、不同作物的白粉菌序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明，該南瓜白粉菌序列與Podosphaera xanthii序列一致性高達(dá)95%，同源性較高（圖4）。運(yùn)用軟件Lasergene MegAlign建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，南瓜白粉菌ITS序列與長壽花單囊殼（Podosphaera xanthii-KB）、茄子單囊殼（Podosphaera xanthii-SM）、番茄單囊殼（Podosphaera xanthii-SL）等親緣關(guān)系較近。其余3個(gè)地區(qū)檢測方法一致，顯示均與Podosphaera xanthii序列一致性在95%～98%。結(jié)果表明，長豐地區(qū)的南瓜白粉病病原菌為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。

2.4 南瓜白粉病病原菌生理小種的鑒別結(jié)果

采用孢子懸浮液噴霧法，將長豐吳山地區(qū)白粉病病原菌純化后接種于13個(gè)國際通用鑒別寄主葉片上，觀察分析寄主的抗感反應(yīng)（表3）。觀察發(fā)現(xiàn)，鑒別寄主Iran H 、Top-mark、Vedrantais、 Nantais Oblong接種白粉菌15 d發(fā)病，出現(xiàn)肉眼可見近圓形粉狀斑點(diǎn);25 d充分發(fā)病，整株植物葉片及莖干布滿白粉，感病嚴(yán)重。而寄主PMR45、PMR5、MR29、Edisto47、PI 414723、MR1、PI 124111、PI 124112、PMR6均表現(xiàn)為抗病。鑒定結(jié)果表明，長豐吳山地區(qū)南瓜白粉病病原菌生理小種是Podosphaera xanthii中的race1（表1～2）。其余3個(gè)地區(qū)白粉病病原菌采用同樣鑒定方法，顯示南瓜白粉病病原菌生理小種均為Podosphaera xanthii中的race1。結(jié)果表明，長豐地區(qū)16份白粉病病原菌生理小種均為Podosphaera xanthii中的race1。

3 討論與結(jié)論

單囊殼白粉菌屬于白粉菌目（Erysiphales）白粉菌科（Erysiphaceae）單囊殼屬（Podosphaera），其寄主廣泛[1]。白粉病病原菌可通過分生孢子和分生孢子梗進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，根據(jù)分生孢子內(nèi)是否含有纖維狀體判斷其是否為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）[1，13-14]。筆者觀察視野下不同來源的白粉菌分生孢子均呈廣橢圓形，內(nèi)含多個(gè)纖維狀體，且串生成念珠狀，其分生隔膜有2～4個(gè)不等，判斷其均為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。

rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列分析廣泛應(yīng)用于病原菌分類[15-16]，通過rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列分析表明，本試驗(yàn)中白粉菌與Podosphaera xanthii聚類在同一分支，結(jié)果進(jìn)一步證明長豐地區(qū)南瓜白粉病病原菌為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。

筆者運(yùn)用了形態(tài)學(xué)觀察、分子鑒定以及國際通用甜瓜白粉病菌生理小種鑒別方法對安徽合肥長豐地區(qū)2020年春季南瓜白粉病病原菌進(jìn)行鑒定，確認(rèn)其為單囊殼白粉菌的race1。白粉病病原菌生理小種多樣，而且分化速度快。同種作物不同時(shí)期生理小種不同[17-18]，同時(shí)露地和大棚生長環(huán)境的不同導(dǎo)致同種作物生理小種也不同[19]。因此，下一步要針對長豐地區(qū)南瓜不同種植環(huán)境、不同季節(jié)的白粉病病原菌進(jìn)行監(jiān)測，以更好地掌握當(dāng)?shù)匕追鄄∩硇》N變化情況，為南瓜抗白粉病選育提供依據(jù)。

筆者通過多種方法初步確定了長豐地區(qū)南瓜白粉病病原菌為單囊殼白粉菌的race1，并沒有發(fā)現(xiàn)其他生理小種，為長豐地區(qū)南瓜抗白粉病選育及種質(zhì)資源相關(guān)研究提供了依據(jù)。

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