氮沉降背景下土壤微生物對入侵植物烏桕葉綠素熒光特征的影響

方海富,馮為迅,羅來聰,高 宇,王佰慧,Shad Nasir,魏啟軒,鄒 瑜,蘇思思,張 令

江西農(nóng)業(yè)大學林學院,江西省森林培育重點實驗室,江西特色林木資源培育與利用2011協(xié)同創(chuàng)新中心, 南昌 330045

生物入侵是一個全球性的問題,不僅對入侵地農(nóng)林牧副漁生產(chǎn)造成經(jīng)濟損失和人類的健康造成傷害,而且也對生態(tài)系統(tǒng)的過程也造成一定的影響[1- 4]。在全球變化的背景下,當外來植物入侵到新的環(huán)境,可能會因為一些環(huán)境因子的改變,導致外來植物對環(huán)境的響應及適應機制發(fā)生變化,具有較強的入侵潛力。因而,生物入侵已經(jīng)成為許多專家和學者關注的熱點問題[5- 6]。

光合作用對植物的生長和繁殖至關重要,直接影響入侵植物的建群、擴散和成功入侵等過程[7]。葉綠素熒光特性與植物的光合作用密切相關,能夠準確迅速地反映光合作用的能量轉化過程。植物的葉綠素熒光參數(shù)可通過分析技術測得,能反映環(huán)境變化對光合作用的影響規(guī)律[8- 9],是決定產(chǎn)量和質量的重要因素,因而被視為揭示植物光合作用與環(huán)境關系的內(nèi)在探針,成為研究作物光合生理的有力工具。幾乎所有光合作用過程的變化都可通過葉綠素熒光反映出來,因此在國際上得到了廣泛的應用。土壤微生物是影響植物入侵潛力和植物性能的重要因素[10- 11]。土壤共生菌(如根瘤菌,叢枝菌根真菌等)和拮抗菌(如病原菌)對植物的入侵性能有不同程度的影響[12]。入侵植物相比于本地植物具有較高的菌根結合力,這可能會影響土壤的理化性質[13]。入侵植物可能會逃脫土壤束縛的物種特有的敵人,在其自然范圍內(nèi)產(chǎn)生負面影響。因此,土壤殺菌處理可能會對入侵植物在其自然生長范圍內(nèi)的表現(xiàn)產(chǎn)生積極的影響[6]。近幾年,有關植物熒光特性與其抗性生理[14- 15]及不同品種間和施肥調控對葉綠素熒光特征[16]比較的研究較多,但對入侵植物葉綠素熒光特征與土壤微生物調控的關系等方面的研究鮮有報道。

氮素是最為重要的環(huán)境養(yǎng)分之一,其含量的高低對植物的生長發(fā)育和新陳代謝具有重要作用;由于動植物繁衍和人類活動都會導致大氣氮沉降加劇[17],對土壤氮素的水平顯著提高。有相關研究表明部分入侵植物相比本地植物具有較強的氮吸收速率[18],因此氮沉降加劇可能會促進外來植物的入侵[19]。氮沉降對植物光合生理作用有很大的變化。孫群等[20]研究發(fā)現(xiàn)在水分脅迫下隨著施氮的增加葉綠素含量增加。氮沉降加劇能夠促進入侵植物薇甘菊的光合效率[21]。凈光合速率隨施氮量的增加而增大[22]。氮沉降會顯著增大入侵植物葉綠素含量,對植物光合作用[23]和葉綠素參數(shù)[9]具有顯著變化。因此開展氮沉降加劇和土壤微生物變化對入侵植物葉綠素熒光的影響的研究,對揭示全球氣候變化背景下入侵植物響應和適應機制具有重要意義。

烏桕(Triadicasebifera)是大戟科烏桕屬落葉喬木,原產(chǎn)于中國,是一種重要的工業(yè)油料樹種,已有1400多年的栽培歷史。18世紀末,為了發(fā)展蠟燭和肥皂產(chǎn)業(yè)及作為觀賞樹種,首次將烏桕引入美國,如今在美國東南部迅速蔓延并呈現(xiàn)出嚴重地生物入侵現(xiàn)象[24- 27]。烏桕入侵種群會使得更多的資源分配到地上部分,入侵烏桕相對于原產(chǎn)地烏桕種群在株高、葉面積、葉生物量和氮吸收能力及實際光能轉化速率具有較強的優(yōu)勢[9,13,18,26,28- 30]。從而烏桕能入侵成功可能與生物和非生物因素有關,一些國內(nèi)外學者通過原產(chǎn)地和入侵烏桕對氮沉降與微生物交互作用[26],UV輻射增強[31],氮沉降與UV輻射和土壤滅菌交互作用[28],施肥,鹽度與土壤微生物交互作用[13],入侵植物防御策略演化對生物防治效果[27,32- 33]等相關研究。通過了解入侵種群和原產(chǎn)地種群烏桕在生物和非生物條件下形態(tài)學特征和生理學特征的變化,逐步探索出烏桕能成功入侵的主要原因,而生物抑制劑是否會影響植物脅迫生理葉綠素熒光參數(shù)的比較有待研究。

本研究采用盆栽模擬實驗,通過模擬全球變化因子氮沉降加劇和土壤微生物(細菌和真菌抑制劑),觀察原產(chǎn)地(中國)和入侵地(美國)烏桕種群葉綠素熒光參數(shù)的差異,擬解決以下3個科學問題：(1)探討細菌和真菌抑制劑對烏桕葉綠素熒光變化的相對影響;(2)是否氮沉降加劇和土壤微生物相互作用于烏桕的葉綠素熒光變化; (3)不同處理組合對原產(chǎn)地和入侵地烏桕種群葉綠素熒光影響有何差異。

1 材料與方法

1.1 盆栽土壤采集

1.2 烏桕種子采集和育苗

2018年,在中國(原產(chǎn)地)和美國(入侵地)分別采集4個種群的烏桕種子,共8個種群(表1),每個種群的種子分別采集于5—6棵樹。2019年4月份進行烏桕種源分類,育苗期間通過噴施蒸餾水使土壤保持濕潤,等到六月底對烏桕幼苗進行移栽(40 d左右)。選擇株高相近的烏桕幼苗,將烏桕幼苗移栽與對應的花盆(體積2 L,裝填土壤質量：1.5 kg)中。

表1 不同烏桕種源地理分布信息

1.3 實驗設計

實驗采用嵌套設計,包含氮沉降(對照VS.硝態(tài)氮),細菌處理(對照VS.細菌抑制劑),真菌處理(對照VS.真菌抑制劑),種源(原產(chǎn)地VS.入侵地),種群為種源嵌套因子,重復4次,共2×2×2×6×4=192盆幼苗,施用KNO3溶液模擬8 g N/m2氮沉降,分兩次施入,每次加入5 mL (相當于0.03 g N/kg土壤);細菌抑制劑使用濃度為3 g/kg鏈霉素處理[34],分兩次施入,每次施入5 mL液體;真菌抑制劑使用濃度為1g/kg撲海因處理[34],分兩次施入,每次施入5 mL液體。

1.4 實驗方法

采用SPAD- 502 Plus葉綠素測定儀(KONICA MINOLTA,Japan)進行相對葉綠素含量(SPAD)測定,測定時選擇每株植物中部完全展開的5—6個葉片,然后取平均值。采用PM2500調制葉綠素熒光儀(WALZ,Germany)測定葉綠素熒光參數(shù)。測定時,選擇每株植物頂端第3—5片完全展開的葉片中的其中2片[35],具體指標測定操作如下：① 光系統(tǒng)II(PSII)的最大量子產(chǎn)率Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm：通過暗適應葉夾使樣品經(jīng)過充分的暗適應(至少30 min)后,累計在質體醌(PQ)處的所有電子都被傳走,PSII的所有反應中心都處于開放狀態(tài),然后打開測量光(Measuring Light,ML),記錄暗適應后的最小熒光Fo。測量光一般很弱(小于1 μmol m-2s-1),只激發(fā)色素的本底熒光但不足以引起任何的光合作用;緊接著打開一個持續(xù)時間僅為0.2—1.5秒的飽和脈沖(Saturation Pulse,SP),此時PSII處釋放的電子迅速將PQ全部還原(電子門全部關閉),光化學反應被打斷,全部轉化為葉綠素熒光和熱量,熒光迅速達到最大值Fm,記錄暗適應后的最大熒光Fm;② PSII實際光合量子產(chǎn)率Y(II)=ΦPSII=ΔF/Fm′=(Fm′-F)/Fm′：在光照條件下進行光合誘導,在PQ處會累積電子,只有部分電子門處于開放態(tài)。此時給出一個飽和脈沖,本來處于開放態(tài)的電子門將本該用于光合作用的能量轉化為了葉綠素熒光和熱,此時得到的葉綠素熒光峰值為Fm′,而打開飽和脈沖之前記錄的熒光值為F。在光化光照射下,只有部分電子門處于關閉態(tài),因此實時熒光F比Fm要低,就會發(fā)生了熒光淬滅(quenching)。葉綠素熒光產(chǎn)量的下降(淬滅)可以由光合作用的增加引起,也可以由熱耗散的增加引起。由光合作用的引起的熒光淬滅稱之為光化學淬滅(photochemical quenching,qP或qL),由熱耗散引起的熒光淬滅稱之為非光化學淬滅(non-photochemical quenching,qN或NPQ)。③ 快速光響應曲線的測定：樣品經(jīng)過充分的暗適應后,依次開啟光強度分別為1、7、41、141、277、510、873、1377、1963 μmol m-2s-1的光化光,每個強度的光化光照射時間為10s,使用PamWin- 3軟件,采用Eilers和Peeters (1988)的公式進行快速光響應曲線的擬合,擬合公式如下：

相對電子傳遞速率(ETR)單位：μmol m-2s-1;光合有效輻射(PAR),單位：μmol m-2s-1;快速光曲線的初始斜率(α)潛在最大相對電子傳遞速率(ETRmax),單位：μmol m-2s-1;半飽和光強(Ik),單位：μmol m-2s-1。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用JMP 9.0(SAS Institute,Cary,NC,USA)軟件進行四因子嵌套方差分析,將氮沉降、細菌和真菌抑制劑、種源作為固定因素,種群作為種源嵌套因子。多重比較采用Tukey法進行,采用Origin 2018繪圖。

2 結果

2.1 相對葉綠素含量SPAD

與對照相比,氮沉降對SPAD具有極顯著正效應(+7.04%)。在氮沉降條件下,與對照相比,細菌、真菌抑制劑以及它們之間的交互作用對SPAD均具有顯著負效應(-10.78%, -7.35%, -1.69%);細菌和真菌抑制劑的交互作用與真菌抑制劑相比有顯著正效應(+6.10%),與細菌抑制劑相比有正效應(+10.19%)。在細菌抑制劑條件下,氮沉降和真菌抑制劑的交互作用下與氮沉降相比具有著負效應(-10.19%),與真菌抑制劑相比具有顯著正效應(+6.10%)。在真菌抑制劑條件下,氮沉降對SPAD具有顯著正效應(+1.73%),氮沉降和細菌抑制劑的交互作用下與氮沉降相比具有顯著負效應(-6.10%),與細菌抑制劑相比具有顯著正效應(+10.19%)。原產(chǎn)地烏桕相比入侵烏桕具有較高的SPAD(+15.88%)(圖1,表2)。

表2 氮沉降、細菌和真菌抑制劑對不同種群(種源)烏桕葉綠素熒光參數(shù)(Fv/Fm、Y(II)、NPQ、α、Ik、ETRmax)和相對葉綠素含量(SPAD)的影響方差分析

圖1 氮沉降,氮沉降、細菌和真菌抑制劑,種源對烏桕相對葉綠素含量(SPAD)的影響(平均值±標準誤) Fig.1 The dependence of relative chlorophyll content (SPAD) (mean±se) on nitrogen deposition, nitrogen, bacteria and fungus, Triadica sebifera origin(mean±se)Con：對照 Control;N：氮沉降 Nitrogen deposition;B：細菌抑制劑 Bacteria inhibitors;F：真菌抑制劑 Fungus inhibitors;Native, 原產(chǎn)地; Invasive, 入侵地;相同小寫字母表示沒有顯著差異(P>0.05)

2.2 Fv/Fm、Y(Ⅱ)和NPQ

在Fv/Fm方面,與對照相比,氮沉降、細菌抑制劑以及它們之間的交互作用都具有顯著正效應(+1.67%,1.41%,0.76%)。在NPQ方面,無論氮沉降還是細菌抑制劑對NPQ差異都不顯著,但是氮沉降與細菌抑制劑的交互作用與對照、細菌抑制劑和氮沉降相比,都具有顯著的正效應(+74.55%, +85.84%, +60.91%)。氮沉降對入侵烏桕NPQ差異不顯著,而對本地烏桕NPQ存在顯著正效應(+83.49%)。與對照相比,入侵烏桕與本地烏桕差異不顯著,但是在氮沉降條件下,原產(chǎn)地烏桕與入侵烏桕相比存在顯著正效應(+51.37%)(圖2,表2)。

圖2 不同處理對烏桕光系統(tǒng)Ⅱ最大量子產(chǎn)率(Fv/Fm),和非光化學淬滅NPQ的影響(平均值±標準誤)Fig.2 Effect of different treatments on Fv/Fm and NPQ of Triadica sebifera (mean±se)

在Y(II)方面,主要受不同烏桕種群,細菌抑制劑和種源的交互作用,氮沉降、細菌和真菌抑制劑和種源的交互作用的影響(圖3,表2)。細菌和真菌抑制劑對原產(chǎn)地烏桕具有顯著正效應,細菌抑制劑和氮沉降的交互作用對原產(chǎn)地烏桕具有顯著負效應。

圖3 不同處理對烏桕光系統(tǒng)Ⅱ實際光合量子產(chǎn)率Y(II)的影響(平均值±標準誤)Fig.3 Effect of different treatments on Y(II) of Triadica sebifera (mean±se)

2.3 快速光響應曲線(α、Ik和ETRmax)

與對照相比,氮沉降、細菌抑制劑及它們交互作用對Ik均具有顯著正效應(+9.85%,+15.52%,+25.95%)。在氮沉降條件下,細菌抑制劑對Ik具有顯著正效應(+14.65%);在細菌抑制劑條件下,氮沉降處理對Ik具有顯著正效應(+6.02%)(圖4,表2)。與對照相比,入侵烏桕相比本地烏桕對Ik具有顯著正效應(+4.06%);原產(chǎn)地和入侵烏桕在氮沉降作用下對Ik均具有顯著正效應(+21.92%, +11.85%);原產(chǎn)地烏桕在真菌抑制劑作用下對Ik具有顯著正效應(+27.81%),但入侵烏桕在真菌抑制劑作用下對Ik具有顯著負效應(-9.28%);原產(chǎn)地和入侵烏桕在氮沉降與真菌抑制劑的交互作用下對Ik均具有顯著正效應(+12.79%, +11.21%)。在氮沉降條件下,原產(chǎn)地與入侵烏桕相比對Ik具有顯著正效應(+4.75%)。在真菌抑制劑條件下,入侵烏桕相比原產(chǎn)地烏桕對Ik具有顯著負效應(-26.14%);在氮沉降與真菌抑制劑的交互作用下,原產(chǎn)地與入侵烏桕相比Ik沒有顯著差異(圖4,表2)。

圖4 不同處理對烏桕強光耐受力(Ik) 的影響(平均值±標準誤)Fig.4 Effect of different treatments on IK of Triadica sebifera (mean±se)

在α方面,主要受不同烏桕種群,氮沉降,細菌抑制劑和種源的交互作用,氮沉降與細菌抑制劑的交互作用,細菌和真菌抑制劑的交互作用,氮沉降、細菌和真菌抑制劑和種源交互作用的影響(圖5,表2)。細菌和真菌抑制劑的交互作用對原產(chǎn)地烏桕具有顯著負效應。氮沉降與細菌抑制劑的交互作用對原產(chǎn)地烏桕具有顯著負效應。細菌抑制劑對入侵烏桕具有顯著正效應。

圖5 不同處理對烏桕光能利用率(α)的影響(平均值±標準誤)Fig.5 Effect of different treatments on (α) of Triadica sebifera (mean±se)

在ETRmax方面,主要受不同烏桕種群,氮沉降、細菌和真菌抑制劑的交互作用,種源、氮沉降和細菌與真菌抑制劑交互作用的影響(圖6,表2)。氮沉降對原產(chǎn)地烏桕具有顯著正效應。真菌抑制劑對入侵地烏桕具有顯著負效應。

圖6 不同處理對烏桕潛在最大相對電子傳遞速率ETRmax的影響(平均值±標準誤)Fig.6 Effect of different treatments on ETRmax of Triadica sebifera (mean±se)

3 討論與結論

3.1 氮沉降對烏桕葉綠素熒光特征的影響

氮沉降對烏桕葉片NPQ、Ik、α、ETRmax和SPAD都具有顯著正效應(表2)。趙犇等[36]通過人為施氮可增加小麥葉片SPAD,張盼盼等[37]通過施氮可增加糜子葉片SPAD,鄭翔等[9]通過施氮也增加烏桕葉片SPAD,均與本實驗結果一致,這說明隨著氮源的不斷輸入,促進葉片葉綠素含量上升,使得烏桕葉片SPAD值不斷升高。氮沉降可以顯著增加烏桕葉片NPQ、Ik、α和ETRmax,這可能是氮源的輸入,為植物葉器官合成抗脅迫物質提供了大量的氮元素有關,增強對光的保護力,強光的耐受力,促進光能轉化率和潛在最大相對電子傳遞速率。氮沉降對烏桕Y(II)沒有顯著差異,鮑海泳等[21]對入侵植物薇甘菊的研究表明,氮沉降對Y(II)無顯著差異,與本實驗結果相吻合。但是張緒成等[38]通過開頂式氣室盆栽培養(yǎng)小麥實驗發(fā)現(xiàn)施加氮肥能顯著增加小麥葉片Y(II)。因此,氮沉降對植物Y(II)的影響可能與供試植物的歸化程度和土壤氮水平的共同作用有關。

3.2 氮沉降與細菌抑制劑之間具有顯著交互作用

與氮沉降相比,氮沉降與細菌抑制共同條件下,對NPQ和Ik都具有正效應,對α、SPAD具有負效應。Yang等[13]通過盆栽烏桕實驗研究表明,施肥處理和土壤滅菌處理在總生物量、生長速率和根莖比方面存在顯著的交互作用,說明氮沉降和土壤滅菌處理之間存在一定的顯著交互作用,這可能是隨著氮源的輸入,土壤中氨氧化細菌和氨氧化古菌的豐度發(fā)生了改變,引起土壤微生物群落結構發(fā)生改變[39- 42]。在本實驗中,細菌抑制劑鏈霉素具有內(nèi)部保護、外部治療和快速補充營養(yǎng)的功效,可抑制病菌細胞膜的形成,減緩氮源在植株中的活動,快速殺菌、快速補充營養(yǎng)、可在植株表面形成均勻細致的保護膜、治療膜和營養(yǎng)膜,故對植株起一定的保護作用。因此在NPQ和Ik方面,氮沉降與細菌抑制劑會產(chǎn)生協(xié)同效應,促進對光的保護力和對強光的耐受能力。在α和SPAD方面,細菌抑制劑緩解氮沉降對光能的利用率和烏桕葉片相對葉綠素含量的影響。

3.3 不同烏桕種源與細菌抑制劑之間的具有顯著交互作用

細菌抑制劑與不同烏桕種源在Y(II)方面具有顯著交互作用。鄭翔等[9]和Deng等[24]研究入侵烏桕相比于原產(chǎn)地具有較高的Y(II)。細菌抑制劑對入侵烏桕光能利用率(α)具有顯著正效應。有相關研究結果表明入侵烏桕種群具有“地上優(yōu)先”的分配策略和高耐性、低抗性的進化選擇[28,31,43],與原產(chǎn)地烏桕種群相比具有較高的比葉面積、氮吸收速率和相對生長速率等特征[18,26]。鄧邦良等[28]通過盆栽烏桕實驗表明原產(chǎn)地烏桕相比于入侵烏桕更加依賴于原產(chǎn)地土壤有益微生物,入侵烏桕在一定程度上卻擺脫了對原產(chǎn)地土壤有益微生物的依賴。因而,這可能是入侵地烏桕和細菌抑制劑具有協(xié)同作用,弱化了入侵地烏桕在Y(II)和α方面對原產(chǎn)地土壤微生物的依賴性。這表明在細菌抑制劑作用下,由于入侵烏桕相比原產(chǎn)地烏桕具有較好的生長優(yōu)勢,植株葉片能接收更多的光能、熱能和具有更好的選擇土壤有益微生物的協(xié)同互惠能力,增強入侵潛力,增強入侵烏桕葉片實際光能轉化率和光能利用率。細菌抑制劑對原產(chǎn)地的功效弱于對入侵烏桕葉片的功效。研究結果與生物抗性假說一致,細菌抑制劑能緩解原產(chǎn)地烏桕光能利用率和光能轉化率,這可能與相關基因誘導有關[44]。

3.4 氮沉降和真菌抑制劑與種源之間的交互作用

鄭翔等[9]通過盆栽烏桕實驗研究入侵烏桕相比與原產(chǎn)地烏桕具有較低的SPAD,與本實驗結果相吻合,這可能與烏桕不同種源自身基因誘導有關。氮沉降與原產(chǎn)地烏桕種源和入侵地烏桕種源相比,在NPQ方面具有顯著正效應,這可能與不同烏桕種源抵御氮元素的能力有關,從而氮沉降能增強原產(chǎn)地烏桕對光的保護能力。真菌抑制劑對原產(chǎn)地烏桕強光的耐受力具有顯著正效應,對入侵烏桕強光耐受力具有顯著負效應。真菌抑制劑對原產(chǎn)地烏桕Ik具有促進作用,入侵烏桕相比原產(chǎn)地更加會依賴于土壤有益微生物。增強了入侵烏桕在Ik方面對原產(chǎn)地土壤微生物的依賴性。入侵烏桕在入侵地會有選擇性的增強和弱化與某些有益微生物的協(xié)同互惠能力,因此具有較強的入侵能力[28]。真菌抑制劑使原產(chǎn)地烏桕具有較強的耐受能力,可能與不同烏桕種源對真菌抑制劑的抵御和修復能力各異有關,也可能與烏桕不同種源自身基因誘導有關,真菌抑制劑能緩解入侵烏桕對強光的耐受力[44- 45]。

致謝：美國萊斯大學Evan Siemann教授河南大學丁建清教授、田寶良博士提供不同種群烏桕種子,特此致謝。