艾柱揮發(fā)油和燃燒產(chǎn)物成分GC-MS分析及抗氧化活性比較

陳如一，史悅悅，張曉熙，趙鑫鈺，夏道宗

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053)

艾葉為菊科蒿屬植物艾ArtemisiaargyiLévi.et Vant.的干燥葉，為2020年版《中國(guó)藥典》一部所收錄的中藥材。艾葉性溫，味辛、苦，歸肝、脾、腎經(jīng)，具有溫經(jīng)止血、散寒止痛、理氣安胎等功效[1]。艾柱是由艾葉加工的艾絨填充而成的柱狀物，常用于中醫(yī)藥養(yǎng)生保健。研究表明，艾柱含揮發(fā)油、黃酮、萜類及多糖等成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等多種藥理作用[2-3]。艾灸療法是傳統(tǒng)針灸的重要組成部分，是一種由經(jīng)絡(luò)調(diào)節(jié)、溫?zé)嵝?yīng)、燃燒產(chǎn)物的成分共同作用的綜合效應(yīng)。艾柱的燃燒產(chǎn)物較為復(fù)雜，文獻(xiàn)報(bào)道其成分差異較大，除了與燃燒原材料有關(guān)外，還與燃燒裝置、測(cè)定方法等有關(guān)[4]。

氧化應(yīng)激是機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)氧化/抗氧化平衡失調(diào)的病理狀態(tài)，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[5]。目前有關(guān)艾葉抗氧化功能的文獻(xiàn)報(bào)道較多[6]，但關(guān)于其加工產(chǎn)品艾柱的研究很少。郭太虎等[7]研究發(fā)現(xiàn)艾灸可使D-半乳糖所致衰老大鼠腦組織超氧化物歧化酶(SOD)活性升高，丙二醛(MDA)水平下降，提示艾灸具有較好的抗氧化效果。因此，本研究主要對(duì)艾柱揮發(fā)油和燃燒產(chǎn)物成分進(jìn)行GC-MS分析，并通過自由基清除法和總抗氧化能力測(cè)定法比較其抗氧化活性，以期為深入分析艾柱及艾灸作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 7890-5977A型氣相色譜-質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司)；Concentrator Plus真空濃縮儀、移液槍(德國(guó)Eppendorf公司)；HA120-50-01超臨界萃取裝置(中國(guó)南通華安公司)；Synergy H1酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-Ⅲ 循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)；W201B 數(shù)控恒溫水浴鍋(上海申勝生物技術(shù)有限公司)；BSA224S-CW 電子天平[賽多利斯(北京)天平有限公司]；KQ-500DE型 數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥物與試劑 艾柱(浙江乾一生物科技有限公司，批號(hào)20190415)；無水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20190906)；95%乙醇(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20181011)；抗壞血酸(廣東光華化學(xué)廠有限公司，批號(hào)20190811)；2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(批號(hào)STBG8547)、2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(批號(hào)BCBT2871)、2,2-azino-bis (3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid diammonium salt)(批號(hào)SLBL5589V)均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；硫酸亞鐵七水合物(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)D172003)；過硫酸鉀(宜興市第二化學(xué)試劑廠，批號(hào)170501)；三氯化鐵六水合物(上海泰坦科技股份有限公司，批號(hào)P1519028)；其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 艾柱揮發(fā)油提取 采用超臨界二氧化碳萃取法。取艾柱150 g，置入CO2超臨界萃取釜中。萃取條件為萃取釜壓力21.5 MPa；溫度40 ℃；萃取時(shí)間120 min；分離釜Ⅰ壓力6.4 MPa，溫度45 ℃；分離釜Ⅱ壓力6.4 MPa，溫度35 ℃。首次萃取時(shí)，每0.5 h加入50 mL無水乙醇作為夾帶劑，循環(huán)萃取2次。得到的產(chǎn)品，離心除去蠟質(zhì)沉淀，濾液于40 ℃減壓回收乙醇，得到脫蠟質(zhì)艾柱揮發(fā)油。以40 mg/mL的質(zhì)量濃度溶于無水乙醇中，超聲波振蕩溶解，加入適量無水硫酸鈉脫水2 h，取上清液過0.22 μm微孔濾膜后，蒸發(fā)濃縮，得到艾柱揮發(fā)油[8]。計(jì)算得艾柱揮發(fā)油的平均得率為1.46%。

1.3.2 艾柱燃燒產(chǎn)物收集 取50 g艾柱于自制燃燒裝置的燃燒塔中，暗火燃燒，在吸收瓶中加入無水乙醇作為煙霧吸收溶劑，緩沖瓶與真空泵連接。調(diào)節(jié)循環(huán)水泵控制艾柱的燃燒速度，使燃燒產(chǎn)物能夠被充分吸收。將艾柱燃燒產(chǎn)物過濾，蒸餾濃縮后，離心取上清液，計(jì)算得艾柱燃燒產(chǎn)物的平均得率為1.01%。

1.3.3 艾柱揮發(fā)油GC-MS分析 氣相色譜條件為色譜柱Agilent HP-5MS (30 m × 250 μm，0.25 μm)；載氣高純氦氣，純度 ≥ 99.999%；進(jìn)樣量3 μL；體積流量1 mL/min；分流比20∶1，進(jìn)樣口溫度300 ℃；柱溫采用程序升溫(100 ℃保持10 min；8 ℃/min升溫至180 ℃；3 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min；1 ℃/min升溫至235 ℃；10 ℃/min升溫至285 ℃；最后以1 ℃/min升溫至300 ℃，保持5 min)。質(zhì)譜條件為EI離子源，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃。全掃描模式為掃描范圍m/z40～500；質(zhì)譜檢索標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)NIST14.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)。根據(jù)以上條件分析鑒定艾柱揮發(fā)油中的主要成分。

1.3.4 艾柱燃燒產(chǎn)物GC-MS分析 色譜柱、載氣同“1.3.3”項(xiàng)；進(jìn)樣量1 μL；體積流量1 mL/min；分流比10∶1；進(jìn)樣口溫度300 ℃；柱溫采用程序升溫(50 ℃保持10 min；4 ℃/min升溫至100 ℃，保持2.5 min；4 ℃/min升溫至180 ℃，保持1 min；5 ℃/min升溫至230 ℃；1 ℃/min升溫至235 ℃；10 ℃/min升溫至285 ℃，保持5 min；最后以1 ℃/min升溫至300 ℃，保持10 min)。質(zhì)譜條件同“1.3.3”項(xiàng)。

1.3.5 抗氧化活性測(cè)定

1.3.5.1 溶液制備 取適量艾柱揮發(fā)油、燃燒產(chǎn)物，分別制備成質(zhì)量濃度為50、100、250、500、1 000、2 500、5 000 μg/mL的樣品溶液，確保艾柱揮發(fā)油及燃燒產(chǎn)物樣品溶液在相同質(zhì)量濃度下，艾柱原料的量相同。精密稱取Vc適量，制備成5、10、25、50、100、250、500、1 000 μg/mL的對(duì)照品溶液，均存放于低溫避光處，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.5.2 DPPH 自由基清除能力測(cè)定 吸取100 μL 0.2 mmol/L DPPH和100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液于96孔板中，然后在室溫(避光)下孵育30 min,用95%乙醇做參比，在517 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)i。測(cè)定0.2 mmol/L DPPH溶液與等體積95%乙醇的混合液的吸光度Ac，以及待測(cè)液(樣品組)與等體積95%乙醇混合液的吸光度Aj[9]。重復(fù)3次，取平均值。按如下公式計(jì)算待測(cè)樣品的自由基清除率，清除率=(1-(Ai-Aj)/Ac)×100%。

1.3.5.3 ABTS+自由基清除能力測(cè)定 吸取180 μL ABTS分析溶液和20 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液于96孔板中，混勻后于暗處?kù)o置10 min，用95%乙醇做參比；在734 nm處測(cè)得吸光度值。以20 μL 95%乙醇替代樣品溶液作為對(duì)照管，加180 μL ABTS分析溶液配置，測(cè)定吸光度值[9]。重復(fù)3次，取平均值。按如下公式計(jì)算待測(cè)樣品的自由基清除率，清除率=(1-樣品管A734/對(duì)照管A734)×100%。

1.3.5.4 總抗氧化能力測(cè)定 吸取6 μL系列濃度為400、600、800、1 000、2 000、5 000 μmol/L的FeSO4溶液，與180 μL FRAP溶液混合，再加18 μL蒸餾水，在酶標(biāo)儀中37 ℃孵育4 min，于593 nm下讀取吸光值，以FeSO4溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取6 μL待測(cè)樣品，與180 μL FRAP溶液混合，再加18 μL蒸餾水，在37 ℃反應(yīng)4 min，于593 nm波長(zhǎng)下讀取吸光值(重復(fù)3次，取平均值)，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得待測(cè)樣品相應(yīng)的FeSO4濃度，定義為當(dāng)量濃度(FRAP值)。結(jié)果表示為每mg樣品中相當(dāng)于的FeSO4的量(mmol/L)[9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0以及Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖。

2 結(jié)果

2.1 艾柱揮發(fā)油中成分GC-MS分析 采用峰面積歸一化法確定艾柱揮發(fā)油中各個(gè)組分的相對(duì)含量，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)以及NIST14.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)，取匹配度在80以上的最高值對(duì)成分進(jìn)行歸屬。艾柱揮發(fā)油GC-MS總離子流圖(TIC)見圖1，分析結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，從艾柱揮發(fā)油中共鑒定出34種成分，主要為醇類、酚類、脂肪酸類、醛酮類、烯烴類。

圖1 艾柱揮發(fā)油總離子流圖

表1 艾柱揮發(fā)油成分分析結(jié)果

2.2 艾柱燃燒產(chǎn)物中成分GC-MS分析 艾柱燃燒產(chǎn)物中化學(xué)成分的分析鑒定方法同“2.1”項(xiàng)，其GC-MS總離子流圖見圖2，分析結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，從艾柱燃燒產(chǎn)物中也鑒定出34種成分，主要為酚類、醇類、酯類、酮類、羧酸類、烷烴類。

表2 艾柱燃燒產(chǎn)物成分分析結(jié)果

圖2 艾柱燃燒產(chǎn)物總離子流圖(TIC)

2.3 抗氧化活性評(píng)價(jià)

2.3.1 DPPH自由基清除作用 如圖3所示，艾柱揮發(fā)油及燃燒產(chǎn)物均可抑制DPPH自由基的產(chǎn)生，其IC50值分別為1 127、85.6 μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照Vc的IC50值為4.21 μg/mL。結(jié)果表明，艾柱燃燒產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力明顯強(qiáng)于艾柱揮發(fā)油。

圖3 艾柱揮發(fā)油及燃燒產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除作用

2.3.2 ABTS+自由基清除作用 如圖4所示，艾柱揮發(fā)油及燃燒產(chǎn)物均可抑制ABTS+自由基的產(chǎn)生，其平均IC50值分別為327.2、81.9 μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照Vc的平均IC50值為45.7 μg/mL。表明，艾柱燃燒產(chǎn)物對(duì)于ABTS+自由基的清除能力顯著強(qiáng)于艾柱揮發(fā)油，與對(duì)照品Vc相當(dāng)，顯示出極好的抗氧化活性。

圖4 艾柱揮發(fā)油及燃燒產(chǎn)物對(duì)ABTS+自由基的清除作用

2.3.3 總抗氧化能力測(cè)定 以FeSO4濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度值為縱坐標(biāo)(A)，進(jìn)行回歸，得回歸方程為A=3.322 3X-1.187 9(r=0.998 7)。經(jīng)過測(cè)定，艾柱揮發(fā)油的總抗氧化能力(FRAP均值)為0.278 4 mmol/L FeSO4當(dāng)量，艾柱燃燒產(chǎn)物的FRAP均值為0.802 mmol/L FeSO4當(dāng)量，對(duì)照品Vc的FRAP均值為8.003 mmol/L FeSO4當(dāng)量。結(jié)果表明，艾柱燃燒產(chǎn)物的總抗氧化能力要顯著優(yōu)于艾柱揮發(fā)油，F(xiàn)RAP值約為后者的2.9倍。

3 討論

艾灸療法具有溫通經(jīng)脈、運(yùn)行氣血、回陽(yáng)救逆、消毒散熱、祛瘀散結(jié)等作用，其療效的發(fā)揮與艾(柱)的藥理作用、燃燒產(chǎn)物及其類芳香療法作用等密切相關(guān)[10]。于密密等[11]采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)艾燃燒生成物中的苯酚含量進(jìn)行定量測(cè)定，指出即使在極端情況下診室內(nèi)所產(chǎn)生的艾煙中的苯酚含量仍小于工業(yè)企業(yè)設(shè)計(jì)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(TJ36-79)規(guī)定的車間空氣中有害物質(zhì)最高容許濃度，證實(shí)了艾灸療法的安全性。艾柱揮發(fā)油中含量最高的是以γ-谷甾醇(7.67%)為代表的醇類化合物，占總峰面積的19.73%，其他成分含量高低依次為酚類、脂肪酸類、醛酮類及烯烴類；其中一些化合物的生物活性已有報(bào)道，如γ-谷甾醇、α-生育酚、環(huán)氧石竹烯、龍腦、川陳皮素等具有抗氧化、抗炎抗菌、降脂、增強(qiáng)機(jī)體免疫力藥理作用[12-14]。

此外，本研究從艾柱燃燒產(chǎn)物中分析鑒定出34種化合物，但這些成分與艾柱揮發(fā)油有很大差異；所鑒定成分色譜峰面積之和占總峰面積的30.73%；其中含量最高的是以苯酚(3.01%)為代表的醇(酚)類化合物，占總峰面積的14.34%，其他成分含量高低依次為酯類、酮類、羧酸類及烷烴類；艾柱燃燒產(chǎn)物中苯酚、豆甾醇、羽扇烯酮等成分在抗氧化、消毒殺菌、抗炎鎮(zhèn)痛等方面具有重要作用[11,15]。

現(xiàn)已證明與自由基有關(guān)的疾病有上百種，進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)可以排除體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性，從而能夠更為直接地觀察受試物的作用效果，為受試物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供科學(xué)依據(jù)[16-17]。本研究通過自由基清除(DPPH、ABTS+)和總抗氧化能力(FRAP法)測(cè)定比較艾柱揮發(fā)油和艾煙燃燒產(chǎn)物的體外抗氧化活性，結(jié)果表明艾柱燃燒產(chǎn)物的抗氧化活性均明顯強(qiáng)于艾柱揮發(fā)油。結(jié)合成分鑒定結(jié)果，α-生育酚是艾柱揮發(fā)油的重要組分，也可能是艾柱揮發(fā)油的主要抗氧化物質(zhì)；此外，艾柱揮發(fā)油中具有較多的飽和及不飽和脂肪酸，但是烯烴類成分較少，這可能是其抗氧化活性弱于艾柱燃燒產(chǎn)物的重要原因。相反，在艾柱燃燒的過程中，產(chǎn)生了較多的苯酚、豆甾醇等活性物質(zhì)，均具有較好的抗氧化活性。需要指出的是，本研究中所采用的體外抗氧化體系是水環(huán)境體系，在一定程度上限制了脂溶性物質(zhì)抗氧化功能的發(fā)揮。另外，在以往對(duì)艾柱燃燒產(chǎn)物的研究中，多采用苯、正丁醇等有機(jī)溶劑進(jìn)行吸收，具有一定的危害性[4,11]。本實(shí)驗(yàn)采用乙醇作為艾柱燃燒產(chǎn)物的吸收溶劑，更加貼近臨床實(shí)際。

總之，本研究中艾柱揮發(fā)油和燃燒產(chǎn)物在成分組成上存在較大差異；在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，艾柱燃燒產(chǎn)物的抗氧化活性明顯優(yōu)于艾柱揮發(fā)油，結(jié)果表明艾柱燃燒后，產(chǎn)生了更多活性成分，以期為深入研究艾柱藥理作用機(jī)制和艾灸類芳香療法提供依據(jù)。