二氫楊梅素磷脂復合物及其滴丸的制備及其體內藥動學比較

魏永鴿，黃賀梅，徐 凱，孫永武，李姝穎，范明松

(1.鄭州鐵路職業(yè)技術學院，河南 鄭州 450052；2.黃河科技學院，河南 鄭州 450005；3.上海雷允上藥業(yè)有限公司技術中心，上海 201401)

二氫楊梅素是從蛇葡萄科葡萄屬AmpelopsisMichx植物中提取分離出來的二氫黃酮醇類化合物，具有降血脂、抗炎、抗腫瘤、降血壓、預防心腦血管疾病等多種藥理作用[1-4]，但該成分水溶性差，導致溶出受限；脂溶性較低[4]，導致透膜吸收困難，故其口服生物利用度很低[5]。為了改善上述問題，已有關于二氫楊梅素制劑新技術的報道，如自微乳、脂質體、微囊等[6-8]，但制備工藝復雜。

磷脂復合物是在非質子溶劑中藥物分子和磷脂(或磷脂酰膽堿)通過分子間作用力結合在一起[9-10]，對藥物脂溶性改善作用較大，但分散性差，溶出困難[11]。滴丸是通過將基質加熱熔融后加入藥物進而形成均一溶液，滴入冷凝液而形成的丸劑，具有制備過程簡單、工業(yè)化程度高、質量易控制等優(yōu)勢，可加快藥物溶出，提高生物利用度[12]。本實驗首先制備二氫楊梅素磷脂復合物，并考察其存在狀態(tài)、溶解度等基本情況，再將其進一步制成滴丸，以期為相關制劑開發(fā)提供研究策略和參考資料。

1 材料

1.1 儀器 MSE125P-CE型電子天平(德國Sartorius公司)；R2000型旋轉蒸發(fā)儀(艾卡儀器設備有限公司)；Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司，配置DAD檢測器、自動進樣器)；D-QCGY-12型氮吹儀(上海助乘實業(yè)有限公司)；D-8型X射線粉末衍射儀(德國Bruker公司)；DWJ-2000S-D型滴丸機(煙臺康達爾藥業(yè)有限公司)；RC-6D型智能藥物溶出試驗儀(天津創(chuàng)興電子設備制造有限公司)；2401PC型可見分光光度儀(日本島津公司)。

1.2 試劑、藥物與動物 二氫楊梅素對照品(批號P20151015，質量分數(shù)為99.1%，上海愛啟醫(yī)藥科技技術有限公司)。卵磷脂(批號181010，磷脂酰膽堿質量分數(shù)>98%，上海輔必成醫(yī)藥科技有限公司)；PEG 6000(批號190515，國藥集團化學試劑有限公司)。四氫呋喃(色譜純，批號C10303495)、磷酸(批號P816338-1L)(上海麥克林生化科技有限公司)。SD大鼠購自河南省動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(豫)2016-0001，實驗室飼養(yǎng)1周，選擇體質量(300±20)g者進行藥動學實驗。

2 方法與結果

2.1 二氫楊梅素含量測定

2.1.1 色譜條件 Waters C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈-0.1%磷酸(40∶60)；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長291 nm；進樣量20 μL。理論塔板數(shù)以二氫楊梅素計，不低于8 500。

2.1.2 線性關系考察 稱取二氫楊梅素對照品20 mg，溶于10 mL乙腈，作為2.0 mg/mL貯備液，流動相逐步稀釋成1.0、5.0、10.0，20.0、40.0、50.0 μg/mL的對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以二氫楊梅素質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得方程為Y=0.912 7X+2.697 8(r=0.999 9)，在1.0～50.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.3 供試品溶液制備 取磷脂復合物滴丸10粒，置于100 mL量瓶中，加入約80 mL 85%乙醇超聲溶解并定容至刻度，精密量取0.5 mL至10 mL量瓶中，流動相稀釋定容至刻度，即得。

2.1.4 方法學考察 取50.0 μg/mL(高)、20.0 μg/mL(中)、1.0 μg/mL(低)對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得日內精密度RSD分別為0.08%、0.11%、0.14%，表明儀器精密度良好。取“2.1.3”項下供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得二氫楊梅素峰面積RSD為0.53%，表明溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。按“2.1.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得二氫楊梅素峰面積RSD為1.07%，表明該方法重復性良好。取磷脂復合物滴丸10粒，置于100 mL量瓶中，平行9份，分別加入對照品12、24、36 mg各3份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得二氫楊梅素平均加樣回收率分別為99.42%、100.17%、99.42%，RSD分別為0.98%、0.67%、1.13%。

2.2 磷脂復合物制備 按文獻[7]報道的方法，稱取二氫楊梅素50 mg、大豆磷脂120 mg(摩爾比1∶1)，置于三角燒瓶中，加入45 mL四氫呋喃制得混懸液，45 ℃水浴磁力攪拌一定時間至溶液澄清，在45 ℃下減壓旋蒸除去有機溶劑，即得，密封后置于干燥器中。平行制備3批樣品，按文獻[7]報道的方法，測得其平均復合率為99.47%。

2.3 磷脂復合物表征

2.3.1 紫外吸收光譜 取二氫楊梅素、磷脂復合物適量，加入甲醇溶解，再以甲醇為空白，在190～400 nm波長處進行掃描，結果見圖1。由此可知，兩者特征吸收峰完全一致，表明二氫楊梅素結構中的生色基團未發(fā)生變化，與文獻[10]報道的磷脂復合物紫外吸收光譜與原料藥相比未發(fā)生變化一致。

圖1 各樣品紫外吸收圖譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectra of various samples

2.3.2 晶型 通過X射線粉末衍射(XRPD)對二氫楊梅素、物理混合物、磷脂復合物進行掃描，采用Cu-Kα靶，掃描速度為8°/min，掃描范圍(2θ)為3°～45°，結果見圖2。由此可知，二氫楊梅素圖譜中在9°～ 29°范圍內出現(xiàn)多處晶型峰；物理混合物圖譜中仍可明顯觀察到二氫楊梅素晶型峰；磷脂復合物圖譜中二氫楊梅素的典型晶型峰全部消失，表明該成分以無定型狀態(tài)存在。

圖2 各樣品XRPD圖譜Fig.2 XRPD patterns for various samples

2.3.3 表觀溶解度 取二氫楊梅素、物理混合物、磷脂復合物適量，加入正辛醇或蒸餾水，25 ℃、800 r/min攪拌48 h，取混懸液，8 000 r/min離心15 min，取上清液，測定表觀溶解度，結果見表1。由此可知，與二氫楊梅素比較，磷脂復合物在正辛醇的表觀溶解度提高1.41倍，具有顯著差異(P<0.01)，由微溶改善至略溶；在水中的表觀溶解度提高1.59倍，也具有顯著差異(P<0.01)，但仍屬于幾乎不溶。由于磷脂復合物黏性較大，不利于藥物溶出，故需要聯(lián)合其他制劑技術加以改善。

表1 二氫楊梅素表觀溶解度測定結果Tab.1 Results of apparent solubility determination of dihydromyricetin (μg/mL,

2.4 滴丸制備 以圓整度為指標，本實驗考察了基質種類(PEG 4000、PEG 6000及兩者等量混合物)、磷脂復合物與基質比例(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)、滴距(5、8、10 cm)、滴速(45、50、55滴/min)，最終選擇PEG 6000作為基質，磷脂復合物與基質比例為1∶4，滴距為8 cm，滴速為50滴/min。滴丸制備工藝為取20 g PEG 6000至燒杯中，75 ℃水浴加熱熔融，邊攪拌邊加入5 g磷脂復合物，繼續(xù)攪拌0.5 h至完全混勻，立即倒入貯液槽內(恒溫75 ℃)，滴頭型號3.0 mm/5.0 mm，滴入具有溫度梯度的二甲基硅油中(管口35 ℃，管底8 ℃)，滴距為8 cm，滴速為50滴/min，即得，濾紙吸干，置于容器中。平行制備3批滴丸，按照2020年版《中國藥典》要求檢測，測得平均溶散時限為(9.54±0.25)min，丸重差異為(3.89±0.17)%，直徑為(3.91±0.06)mm，每粒丸重為(40.10±0.23)mg。

2.5 溶出度測定 取二氫楊梅素、磷脂復合物(以二氫楊梅素計，含量為40 mg)適量，加入3 mL蒸餾水，置于截留分子量8 000～10 000 Da的透析袋中。另取17粒滴丸(以二氫楊梅素計，含量約為40 mg),置于透析袋中，同法操作[13]，平行6份，在溫度37 ℃、轉速100 r/min、釋放介質900 mL蒸餾水的條件下，于0、5、15、30、60、90、120、240、480 min各取樣3 mL，并補加3 mL空白溶出介質，0.45 μm微孔濾膜過濾，測定溶出度，結果見圖3。由此可知，二氫楊梅素240 min內累積溶出度為31.93%，制成磷脂復合物后提高至63.74%，再進一步制成滴丸后在30 min內基本溶出完畢，累積溶出度達95.43%。

圖3 二氫楊梅素體外溶出曲線(n=6)Fig.3 In vitro dissolution curves for dihydromyricetin (n=6)

2.6 體內藥動學研究

2.6.1 灌胃液制備 取二氫楊梅素、磷脂復合物、滴丸適量，0.5%CMC-Na溶液制成含二氫楊梅素15 mg/mL的混懸液，即得。

2.6.2 分組、給藥及采血 18只大鼠隨機分為3組，按100 mg/kg劑量分別灌胃給予“2.6.1”項下3種灌胃液，于0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10 h乙醚麻醉，眼眶采血各約0.3 mL，棉球止血，將血樣置于離心管中(滴入2滴1%肝素)，搖勻，4 000 r/min離心2 min，取上層血漿，作好標記，冷凍保存。

2.6.3 內標溶液制備及血漿樣品處理 參考文獻[7]報道，精密稱取芹菜素對照品10.0 mg，溶于50 mL乙腈中，再用乙腈稀釋至400 ng/mL，即得。取血漿樣品、內標溶液各100 μL，混勻后加入0.5 mL乙酸乙酯，渦旋5 min，8 000 r/min離心10 min，取上層有機溶劑，N2吹干得殘渣，100 μL乙腈復溶，轉移至帶有內襯管的進樣瓶中。

2.6.4 方法學考察 將對照品溶液稀釋至4.0、2.0、1.0、0.5、0.1、0.05 μg/mL，進樣針分別吸取100 μL，N2吹干得殘渣，加入空白血漿、內標溶液各100 μL，按“2.6.3”項下方法操作，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以二氫楊梅素質量濃度為橫坐標(X)，二氫楊梅素、芹菜素峰面積比值為縱坐標(Y)進行回歸，得方程為Y=0.031 8X-2.310 7(r=0.994 2)，在0.05～4.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

取0.05、1.0、4.0 μg/mL血漿對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下各進樣測定6次，測得峰面積RSD分別為4.24%、3.69%、3.03%，表明儀器精密度良好。取磷脂復合物給藥1 h后的血漿樣品，室溫下于0、4、8、12、18、24 h在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得二氫楊梅素、芹菜素峰面積比值RSD為7.11%，表明樣品在24 h內穩(wěn)定性良好。再取上述3個質量濃度的血漿對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得平均加樣回收率分別為91.68%(RSD=3.06%)、87.07%(RSD=4.13%)、94.65%(RSD=2.74%)。

2.6.5 結果分析 圖4、表2顯示，與二氫楊梅素比較，磷脂復合物Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.05，P<0.01)，但tmax無明顯變化(P>0.05)；與磷脂復合物比較，滴丸Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，tmax縮短(P<0.01)；磷脂復合物、滴丸分別將二氫楊梅素的口服吸收生物利用度提高至1.68、3.72倍。

表2 二氫楊梅素主要藥動學參數(shù)Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for

圖4 二氫楊梅素血藥濃度-時間曲線(n=6)Fig.4 Plasma concentration-time curves for dihydromyricetin (n=6)

3 討論

目前國內尚無官方提供二氫楊梅素對照品，故課題組采用定量核磁技術對原料藥含量進行了標定[14]。磷脂復合物的制備一般要求在非質子溶劑中進行，趙薪苑等[4]采用質子溶劑(甲醇)也制備了二氫楊梅素磷脂復合物，但其復合率往往會受到影響[10]，而且也會影響磷脂復合物穩(wěn)定性，不利于保存。

為了改善二氫楊梅素磷脂復合物的分散性，課題組進一步將其制成滴丸，發(fā)現(xiàn)其溶出速率及溶出度得到有效改善，tmax、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞均有顯著變化，生物利用度提高至3.72倍(磷脂復合物口服僅提高至1.68倍)。很多研究者采用固體脂質納米粒、納米結構脂質載體、脂質體等[15-16]技術來改善磷脂復合物溶出問題，但由于該制劑難免會接觸水相，容易導致其發(fā)生解離[17]，故穩(wěn)定性存在一定問題。本實驗將二氫楊梅素磷脂復合物制成滴丸，避免了水相的使用，可使其溶出度及生物利用度大大提高，而且操作過程簡單，適合國內中藥公司實際生產(chǎn)水平，推廣意義較大。