微型生物群落eDNA-PFU監(jiān)測(cè)

姜傳奇 熊 杰 黃 潔 馮偉松 龔迎春 繆 煒

(中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072)

主要由藻類和原生動(dòng)物等組成的微型生物群落在水生態(tài)系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用, 是水生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。微型生物個(gè)體小, 對(duì)環(huán)境變化響應(yīng)靈敏, 非常適合用于環(huán)境的生物監(jiān)測(cè)。大量研究表明微型生物群落的結(jié)構(gòu)和功能可以很好地反映不同生境的水質(zhì)特征。

1991年發(fā)布的《水質(zhì) 微型生物群落監(jiān)測(cè) PFU法》(GB/T 12990-91)[1]是我國(guó)自行制訂的首個(gè)生物監(jiān)測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用聚氨酯泡沫塑料塊(PFU)作為人工基質(zhì)采集微型生物, 并根據(jù)該生物群落的結(jié)構(gòu)與功能參數(shù)評(píng)價(jià)水質(zhì)。相比于直接采水樣, PFU法可采集到水體中85%以上的微型生物,同時(shí)還可避免河流等流水生境中采集的瞬時(shí)性和隨機(jī)性等問題[2]。標(biāo)準(zhǔn)頒布后, PFU法在全國(guó)范圍內(nèi)對(duì)不同河流(包括長(zhǎng)江、漢江、烏江、清江和沅江等)的水質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià), 被證明是一種快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)方法[3]。

PFU法需要專業(yè)人員利用顯微鏡對(duì)微型生物進(jìn)行種類鑒定, 對(duì)專業(yè)知識(shí)要求高、費(fèi)時(shí)耗力且不易標(biāo)準(zhǔn)化。環(huán)境DNA(eDNA)技術(shù)的發(fā)展則突破了以往監(jiān)測(cè)人員無法準(zhǔn)確鑒定微型生物的瓶頸, 能更為高效和準(zhǔn)確地鑒定出水環(huán)境中包括微型生物在內(nèi)的各種水生生物[4—6]。eDNA方法在進(jìn)行物種鑒定時(shí)依賴的參考序列庫具有通用性和標(biāo)準(zhǔn)性, 所獲鑒定數(shù)據(jù)更客觀且可比性強(qiáng)。尤其在萬種原生生物基因組計(jì)劃[7]支撐下, 微型生物基因組和條形碼數(shù)據(jù)庫不斷豐富和完善, 使得微型生物種類的鑒定更為準(zhǔn)確; 同時(shí)由于DNA測(cè)序成本的降低和設(shè)備的國(guó)產(chǎn)化, 檢測(cè)快速、經(jīng)濟(jì), 易于推廣。

基于此提出微型生物群落(藻類和原生動(dòng)物)eDNA-PFU法, 即基于eDNA技術(shù)改進(jìn)的PFU法, 對(duì)微型生物群落的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行監(jiān)測(cè), 并將藻類和原生動(dòng)物種類數(shù)、指示種類和功能類群等微型生物群落的結(jié)構(gòu)和功能參數(shù)作為湖泊河流水庫等水體的生態(tài)考核指標(biāo)。為了對(duì)上述提議進(jìn)行驗(yàn)證, 我們針對(duì)武漢東湖水體中的原生動(dòng)物群落開展了預(yù)實(shí)驗(yàn), 全面評(píng)價(jià)了eDNA-PFU法監(jiān)測(cè)微型生物群落的準(zhǔn)確性和有效性。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與制備

2020年8月12日至9月12日, 本研究在湖北武漢東湖中設(shè)置了一個(gè)采樣點(diǎn)(30°53′95″N, 114°37′51″E;圖 1)。實(shí)驗(yàn)方法參照《水質(zhì) 微型生物群落監(jiān)測(cè)PFU法》(GB/T 12990-91), 將PFU(孔徑為100—150 μm)制作成5 cm×6.5 cm×8 cm的小塊, 采用沉式掛放法將PFU塊掛放于距離岸邊20 m處, 掛放深度為距離水面30—50 cm。分別在放置3d、5d、7d、9d、11d、13d、15d、17d、19d、23d和30d后隨機(jī)取6塊PFU樣品, 采集的PFU塊放到密封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室, 獲取各PFU塊中的水樣, 同時(shí)在PFU周圍利用采水器采集3 L原位水環(huán)境樣品帶回實(shí)驗(yàn)室。取PFU樣品和原位水環(huán)境樣品分別進(jìn)行微型生物活體鑒定, 另取等量的PFU樣品和水環(huán)境樣品進(jìn)行eDNA樣品制備(每組樣品設(shè)置3個(gè)平行)。

圖1 PFU在武漢東湖的樣點(diǎn)位置及PFU的放置方式Fig. 1 Location and PFU systems applied in East Lake, Wuhan

1.2 原生動(dòng)物的形態(tài)學(xué)鑒定與豐度測(cè)定

吸取一定體積的PFU擠出液或原位水在倒置顯微鏡下進(jìn)行物種鑒定和計(jì)數(shù)。

原生動(dòng)物的鑒定和計(jì)數(shù)都是在顯微鏡(OLYMPUS BX53, 日本)下進(jìn)行[3]。鏡檢時(shí)用微吸管從含PFU擠出液或原位水的燒杯底部吸3滴水樣進(jìn)行觀察。第一片在高倍鏡下觀察, 第二、三片分別用中倍鏡和低倍鏡觀察。計(jì)數(shù)時(shí)先把燒杯中的水樣搖勻, 用微吸管吸0.1 mL水樣于0.1 mL的技術(shù)框內(nèi),全片進(jìn)行活體計(jì)數(shù)。原生動(dòng)物的物種鑒定主要參考《微型生物監(jiān)測(cè)新技術(shù)》[8]和《原生動(dòng)物學(xué)》[9]。

1.3 eDNA的提取、測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

采用十六烷基三甲基溴化銨(Cetyltrimethylammonium Bromide, CTAB )法對(duì)樣本的DNA進(jìn)行提取, 即將適量的樣品加入到CTAB裂解液中, 然后經(jīng)酚-氯仿-異戊醇抽提除去蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì), 再加入乙醇沉淀分離出核酸[10]。用2%的瓊脂糖凝膠對(duì)DNA的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè), 對(duì)于質(zhì)量合格的DNA, 使用M220聚焦超聲儀(Covaris Inc., Woburn,MA, USA)將DNA破碎成大約300 bp的片段, 以建立文庫。在檢驗(yàn)文庫質(zhì)量后, 所有樣品均基于MGISEQ-T1進(jìn)行測(cè)序。

對(duì)測(cè)序所得的原始序列用fastQC(v0.11.9)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估, 并移除低質(zhì)量堿基, 得到測(cè)序質(zhì)量較好的Reads(Clean data), 將經(jīng)過質(zhì)控的Reads, 通過BLASTN比對(duì)至SILVA數(shù)據(jù)庫[11], 設(shè)置e值小于1e-5, 篩選出符合要求的Reads, 使用Megahit (v1.1.3)將這些Reads組裝到一起得到全部樣本的 rDNA contigs。用nhmmer判定組裝得到的 rDNA contigs中屬于18S rDNA的部分并進(jìn)行截取, 經(jīng)97%相似度聚類后得到最終18S contigs用于物種鑒定。使用Bwa(0.7.17-r1188)將每個(gè)樣品的 Reads分別比對(duì)至18S contigs上, 得到比對(duì)結(jié)果文件, 并利用Featurecounts(v1.6.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 然后采用RPKM(Reads Per Kilobase per Million mapped reads)的方式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化得到OTU(Operational Taxonomic Units)豐度表。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究主要對(duì)eDNA-PFU法和傳統(tǒng)PFU法在物種鑒定的全面性和準(zhǔn)確性等方面進(jìn)行了比較, 包括兩種方法在不同天數(shù)所監(jiān)測(cè)到的種數(shù)和具體物種組成等數(shù)據(jù)的比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 eDNA-PFU法在物種鑒定多樣性方面的特征

經(jīng)過持續(xù)30d共11次的樣品采集, 通過顯微鏡活體觀察分別從PFU塊和原位水樣檢測(cè)到153種(11門)和79種(9門)原生動(dòng)物; 通過eDNA宏基因組測(cè)序法分別從PFU塊和原位水樣中獲得473個(gè)OTU(14門)和440個(gè)OTU(14門)的原生動(dòng)物序列。eDNA-PFU法鑒定到原生動(dòng)物的物種數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)PFU法及原位水環(huán)境樣品中所檢出的數(shù)目, 監(jiān)測(cè)到的多樣性更高。eDNA鑒定出的物種比傳統(tǒng)方法高這么多倍的原因主要是因?yàn)榍罢呖梢澡b定出許多豐度相對(duì)較低的物種及在形態(tài)上很難辨別的物種。

基于累積所檢出的原生動(dòng)物進(jìn)行比較分析, 發(fā)現(xiàn)eDNA-PFU法逐次累加檢測(cè)物種數(shù)目均顯著高于PFU法和水樣eDNA檢測(cè)方法, 通過可重復(fù)雙因素方差分析發(fā)現(xiàn), eDNA-PFU法所檢測(cè)到的原生動(dòng)物數(shù)目與PFU法和單次eDNA-水樣檢測(cè)到的物種數(shù)目均有顯著差異, 并且eDNA-PFU法檢測(cè)穩(wěn)定性更高, 僅在前兩次采樣時(shí)存在部分偏差, 之后數(shù)次采樣偏差均較小(圖 2)。此外, eDNA-PFU法較傳統(tǒng)PFU法達(dá)到檢測(cè)飽和的速度更快, 第7天即檢測(cè)到原生動(dòng)物總物種數(shù)的98.19%, 而傳統(tǒng)的PFU法僅可達(dá)到60.78%(圖 3)。

圖2 eDNA-PFU法與水樣eDNA法和傳統(tǒng)PFU法累積采集原生動(dòng)物物種數(shù)比較分析Fig. 2 Comparative analysis of the number of protozoan species collected by eDNA-PFU and water eDNA and traditional PFU methods

圖3 eDNA-PFU法和傳統(tǒng)PFU法累積采集原生動(dòng)物物種數(shù)所占比例Fig. 3 The proportion of the number of protozoa species collected by eDNA-PFU and traditional PFU method

2.2 eDNA-PFU法在物種鑒定準(zhǔn)確性方面的特征

將eDNA-PFU法和傳統(tǒng)PFU法所檢出的原生動(dòng)物進(jìn)行比較(表 1), 發(fā)現(xiàn)eDNA-PFU法鑒定到種級(jí)階元的有64.4%, 到屬級(jí)階元的有20.0%, 鑒定到科及以上階元的有15.6%; PFU法鑒定到種級(jí)階元的有62.4%, 到屬級(jí)階元的有34.8%, 鑒定到科及以上階元的有2.8%。隨后對(duì)兩種方法所鑒定的原生動(dòng)物在各分類階元進(jìn)行比較(圖 4), 發(fā)現(xiàn)在門水平100%覆蓋, 綱、目和科水平的覆蓋程度較好, 均大于70%,傳統(tǒng)PFU法所檢出的原生動(dòng)物大部分包含在eDNAPFU法檢出的原生動(dòng)物中, 且在屬水平的覆蓋度也較高, 可達(dá)到45%。但值得注意的是兩種方法在種類水平上匹配度很低, 鏡檢確定的70個(gè)種類, 僅有5種被eDNA監(jiān)測(cè)到, 僅6%鑒定為同一物種(圖 4)。我們分析一方面可能是由于傳統(tǒng)PFU法是根據(jù)活體特征對(duì)原生動(dòng)物進(jìn)行物種鑒定, 而原生動(dòng)物個(gè)體微小, 運(yùn)動(dòng)較快, 因此很難鑒定到種, 其種水平上的鑒定結(jié)果很難保證準(zhǔn)確性, 從而造成兩種方法在種水平的鑒定結(jié)果偏差較大; 另一方面由于原生動(dòng)物的多樣性極為豐富, 很多物種還沒有可以使用的分子序列信息, 從而影響了eDNA-PFU法在物種鑒定中的準(zhǔn)確性。此外, 本研究加入內(nèi)參(嗜熱四膜蟲細(xì)胞)作為鑒定參照, 發(fā)現(xiàn)eDNA-PFU法可以鑒定到種, 而傳統(tǒng)PFU法僅可鑒定到四膜蟲屬。因此, 整體而言, eDNA-PFU法與傳統(tǒng)PFU法比, 覆蓋度和靈敏度均更高。

表1 eDNA-PFU法和傳統(tǒng)PFU法鑒定原生動(dòng)物的精準(zhǔn)度比較Tab. 1 Comparison of accuracy in identifying protozoa by eDNA-PFU and traditional PFU methods

圖4 eDNA-PFU法和傳統(tǒng)PFU法所檢出的原生動(dòng)物各階元比較圖Fig. 4 Comparison of each category of protozoa detected by eDNA-PFU and conventional PFU methods

3 結(jié)論與展望

本研究提出利用eDNA-PFU法對(duì)水體中的微型生物群落(藻類和原生動(dòng)物)進(jìn)行監(jiān)測(cè), 在東湖水體中對(duì)該方法監(jiān)測(cè)微型生物群落的有效性進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果表明eDNA-PFU法較傳統(tǒng)PFU法覆蓋度更高, 可以全面地揭示水體中微型生物群落結(jié)構(gòu)特征。此外, 本文發(fā)現(xiàn)eDNA-PFU法鑒定到原生動(dòng)物的物種數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)PFU法以及原位水環(huán)境樣品中所檢出的數(shù)目, 檢測(cè)到的物種多樣性更高, 且與傳統(tǒng)PFU法相比, 基于eDNA-PFU法的檢測(cè)在科屬水平上具有較高的覆蓋度和準(zhǔn)確性。因此, 我們的結(jié)果表明eDNA-PFU法可以全面、真實(shí)、準(zhǔn)確地揭示水體中微型生物群落結(jié)構(gòu)特征。

然而, eDNA-PFU法在水質(zhì)監(jiān)測(cè)的應(yīng)用中仍有許多亟待解決和完善的地方。首先, 由于原生動(dòng)物和藻類等微型生物的多樣性極為豐富, 其分子序列信息也十分多樣, 為了更好地對(duì)eDNA-PFU加以應(yīng)用, 后續(xù)需要進(jìn)一步豐富和完善本土原生動(dòng)物等物種的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。再者, 基于eDNA-PFU法獲得的物種和豐度信息較之傳統(tǒng)PFU法在數(shù)據(jù)的呈現(xiàn)形式上不一樣, 例如傳統(tǒng)PFU法可以提供不同類群的絕對(duì)豐度(由于依據(jù)活體樣品對(duì)原生動(dòng)物的定量難度非常大, 因此在實(shí)際應(yīng)用中常常很難獲得這方面的數(shù)據(jù)), 而eDNA-PFU法只能提供相對(duì)豐度, 因此后續(xù)需要開展系統(tǒng)研究以制定和規(guī)范依據(jù)eDNA-PFU法的水質(zhì)監(jiān)測(cè)參數(shù)。最后, 由于原生動(dòng)物和藻類等微型生物的分布與季節(jié)、地理位置, 及局部小環(huán)境特征都有非常緊密的關(guān)系, 本文僅用了1個(gè)調(diào)查點(diǎn)的數(shù)據(jù), 雖然重復(fù)較多, 但仍不具備代表性。后續(xù)將增加調(diào)查樣點(diǎn)數(shù), 涵蓋多個(gè)浮游生物多樣性高、中、低梯度的樣點(diǎn)。通過比較不同生物多樣性背景的水體監(jiān)測(cè)結(jié)果的異同, 以對(duì)eDNAPFU法和傳統(tǒng)PFU方法做進(jìn)一步的比較和評(píng)價(jià), 并全面分析基于eDNA-PFU獲得的微型浮游生物種類數(shù)、指示種類和功能類群等微型生物群落的結(jié)構(gòu)和功能參數(shù)對(duì)生態(tài)考核的支撐作用, 從而為湖泊河流水庫等水體的生態(tài)考核提供新一代的生物監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)?？傊? 通過進(jìn)一步完善, eDNA-PFU法有望成為水體微型生物群落監(jiān)測(cè)的新一代監(jiān)測(cè)方法。

致謝:

感謝中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所何舜平研究員對(duì)于eDNA評(píng)估水質(zhì)方法的提出給予的指導(dǎo), 感謝劉國(guó)祥研究員在藻類的eDNA監(jiān)測(cè)評(píng)估中給予的建議, 感謝徐軍研究員在長(zhǎng)江中下游水生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能方面提供的信息, 感謝水生生物數(shù)據(jù)分析管理平臺(tái)的曾宏輝高級(jí)工程師在水生生物DNA條形碼庫構(gòu)建中給予的支持。