中國傘形蜈蚣藻和亞櫛狀蜈蚣藻的合種研究
——基于形態(tài)觀察、早期發(fā)育及分子分析

馬 躍 卞 瑤 溫 馨 張昕陶 王宏偉

(1. 遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116081; 2. 遼寧師范大學(xué)，遼寧省植物生物技術(shù)重點實驗室，大連 116081)

傘形蜈蚣藻Grateloupia corymbcladia僅記載于《中國海藻志》[1], 是李偉新等根據(jù)采自浙江省溫州市南麂島構(gòu)托的四分孢子體的外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征建立的新種。 《中國海藻志》共記載了31種蜈蚣藻屬Grateloupia海藻, 其中有10種是根據(jù)外部形態(tài)及部分內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征命名的新種, 但是由于蜈蚣藻屬海藻的外部形態(tài)具有多樣的特點, 僅通過外部形態(tài)很難對藻體進(jìn)行區(qū)分; 《中國海藻志》對于藻體內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征的記錄也不甚完整; 受到當(dāng)時實驗條件的限制, 沒有更為準(zhǔn)確的方法用于海藻分類, 這些新種是否成立存在著爭議。針對這些問題, 作者團(tuán)隊運用形態(tài)觀察、早期發(fā)育和生活史等與分子分析相結(jié)合的分子輔助的形態(tài)分類學(xué)方法,對海藻志中記載的我國產(chǎn)的部分蜈蚣藻屬新種進(jìn)行了重新鑒定, 其中除陽江蜈蚣藻G. yangjiangensisLi et Ding[2]作為新種成立外, 其余種類陸續(xù)被重新修訂。李芳等[3]運用分子輔助形態(tài)分類學(xué)方法對帚狀蜈蚣藻G. fastigiataLi et Ding進(jìn)行了重新鑒定,結(jié)果顯示帚狀蜈蚣藻與亞洲蜈蚣藻G. asiaticaKawaguchi et Wang為同一種; 劉芳等[4]運用相同的方法將對枝蜈蚣藻G. didymecladiaLi et Ding進(jìn)行了重新鑒定, 結(jié)果表明對枝蜈蚣藻為亞櫛狀蜈蚣藻G. subpectinata的同物異名; Liu等[5]對青島蜈蚣藻G. qingdaoensisLi et Ding重新鑒定, 同樣發(fā)現(xiàn)其作為新種不成立, 并將其作為亞洲蜈蚣藻的同物異名。

亞櫛狀蜈蚣藻是在1912年由Holmes[6]最初命名的, 由于其多變的外部形態(tài), 有學(xué)者又將其作為長枝蜈蚣藻G. prolongataJ. Agardh和G. filicina(Lamouroux) C. Agardh的同物異名[7—9], 直到2004年, Faye等[10]的研究才將其恢復(fù)為一個獨立的種。21世紀(jì)以來, 法國、西班牙、新西蘭、日本和韓國等多個地方被證實有亞櫛狀蜈蚣藻的分布[11,12],2016年劉芳等[4]將對枝蜈蚣藻修訂為亞櫛狀蜈蚣藻, 證明了亞櫛狀蜈蚣藻在中國也有分布。

本研究利用分子輔助的形態(tài)分類學(xué)方法對分布于我國浙江省溫州市南麂島(模式標(biāo)本產(chǎn)地)的傘形蜈蚣藻和亞櫛狀蜈蚣藻進(jìn)行了比較研究, 明確了二者的分類地位及關(guān)系。本研究結(jié)果將為《中國海藻志》內(nèi)容的更新及修訂提供新信息和資料。

1 材料與方法

1.1 材料的采集與處理及形態(tài)觀察

傘形蜈蚣藻樣本和亞櫛狀蜈蚣藻雌配子體樣本于2017年5月26日和2019年5月19日采自模式標(biāo)本產(chǎn)地浙江省溫州市的南麂島。

將采集到的傘形蜈蚣藻標(biāo)本去除附著在表面的雜質(zhì)和其他藻類, 選擇成熟帶有囊果的活體標(biāo)本空運回實驗室, 其他結(jié)構(gòu)完整的藻類用于制作臘葉標(biāo)本, 硅膠干燥標(biāo)本?；铙w標(biāo)本用于孢子早期發(fā)育研究, 臘葉標(biāo)本用來觀察藻體外部形態(tài), 冰凍切片用于觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu), 硅膠干燥標(biāo)本用于提取DNA;將采集到的成熟有囊果的亞櫛狀蜈蚣藻活體標(biāo)本空運回實驗室用于孢子早期發(fā)育研究。冰凍切片用Olympus BH2數(shù)字顯微鏡觀察, 再從中選取效果好的切片通過Nikon HFX-IIA照相機(jī)記錄。本研究所用標(biāo)本存放于遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物標(biāo)本室(LNU; 表 1)。

表1 傘形蜈蚣藻標(biāo)本采集地點、標(biāo)本號及基因登錄號Tab. 1 Collection location, specimen numbers and GenBank accession numbers of G. corymbcladia

1.2 早期發(fā)育

首先, 玻璃培養(yǎng)容器提前用清水沖洗并用75%酒精浸泡的脫脂棉擦拭, 晾干后再用滅菌海水沖洗3次。然后, 在培養(yǎng)容器底部鋪滿載玻片, 將處理干凈的新鮮藻體及滅菌的氧氣泵放入容器中, 倒入滅菌海水直至沒過海藻。氧氣泵通電, 將培養(yǎng)容器放入光照培養(yǎng)箱(LRH-250-GB)內(nèi), 培養(yǎng)條件設(shè)置為溫度20 ℃, 光照強(qiáng)度80 μmol/(m2·s), 光周期(Light∶Dark)12L∶12D, 等待孢子釋放。24h后, 觀察孢子釋放情況, 當(dāng)顯微鏡視野(10×10)下孢子釋放量達(dá)到20—30個時, 把載玻片移入培養(yǎng)液中, 放進(jìn)光照培養(yǎng)箱(LRH-250-GB)繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察一次孢子的變化, 并用Olympus BX53熒光顯微鏡和Olympus BH2數(shù)字顯微鏡觀察記錄。每2天更換1次培養(yǎng)液。

1.3 分子分析

按照植物基因組DNA提取試劑盒(TIAGEN,Valencia, CA, Beijing)的步驟提取傘形蜈蚣藻藻體全基因組DNA, 用于PCR擴(kuò)增。rbcL和COⅠ基因引物設(shè)計參考并改進(jìn)Wang等[13]的方法, 引物組合為:rbcF57—rbcR753,rbcF654—rbcR1381,COⅠF1-COⅠR1(表 2)。根據(jù)Yang等[14]的設(shè)計進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的電泳檢測, 引物合成、擴(kuò)增產(chǎn)物的純化和測序均由上海生工生物公司完成。

表2 PCR擴(kuò)增所需引物Tab. 2 Primers used for PCR

rbcL序列分析: 從GenBank中選取并下載了包括產(chǎn)地為浙江省溫州市南麂島的亞櫛狀蜈蚣藻(基因登錄號為: KY047357)在內(nèi)的23個蜈蚣藻屬物種[2,4,10,13—22]及海膜屬Halymenia的H. durvillei和海柏屬Polyopes的P. constrictus[23]2個外群種的rbcL基因序列與6個傘形蜈蚣藻rbcL基因序列進(jìn)行比對分析。

COⅠ基因序列: 從GenBank中選取下載了包括產(chǎn)地為浙江省溫州市南麂島的亞櫛狀蜈蚣藻(基因登錄號為: KY047379)在內(nèi)的14個蜈蚣藻屬物種及2個外群種H. floresia和P. affinis[14,24]的COⅠ基因序列與6個傘形蜈蚣藻COⅠ基因序列進(jìn)行比對分析。

基因序列比對應(yīng)用軟件Clustalx(1.83)。應(yīng)用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹并分析各物種堿基之間的差異度, 計算遺傳距離的模型為Number of differences和雙參數(shù)遺傳距離(K2-P), Bootstrap值設(shè)置為1000次。

2 結(jié)果

2.1 傘形蜈蚣藻的外部形態(tài)

藻體直立(圖 1a), 紫紅色, 軟骨質(zhì), 高15—30 cm。主枝扁平, 長4—6 cm, 末端延長為亞扁形, 寬2—5 mm。藻體主枝兩側(cè)分布有小羽枝, 分布方式為對生或互生, 且基部不縊縮(圖 1b和1c); 主枝兩側(cè)也分布有1—2回羽狀分枝, 基部縊縮, 有的分枝上不生小枝,有的則在分枝上再生出小羽枝, 分布方式亦為對生或互生。囊果呈球形, 稍突出藻體表面, 散亂分布于除固著器外的整個藻體上(圖 1d)。

圖1 傘形蜈蚣藻的外部形態(tài)及表面觀Fig. 1 External morphology and surface view of G. corymbcladia

2.2 傘形蜈蚣藻的內(nèi)部結(jié)構(gòu)

營養(yǎng)結(jié)構(gòu): 藻體厚度約為85—110 μm, 由皮層及髓部構(gòu)成(圖 2a和2b)。皮層由5—11層細(xì)胞構(gòu)成,其中外皮層細(xì)胞有3—5層, 呈圓形或長橢圓形, 內(nèi)皮層細(xì)胞2—6層, 呈不規(guī)則多角邊形。髓部由髓絲組成, 髓絲長16—36 μm, 寬2—3 μm, 在髓部縱走或交織在一起。藻體幼嫩時髓部致密, 且髓絲隨著藻體生長而增長, 藻體衰老時髓部中空或髓絲少。

生殖結(jié)構(gòu): 果胞枝生殖枝叢產(chǎn)生于內(nèi)皮層細(xì)胞, 其主枝由5個細(xì)胞構(gòu)成, 分別為末端帶有受精絲的壺形果胞, 1個橢圓形的下位細(xì)胞和3個卵圓形細(xì)胞。主枝上的每個細(xì)胞都帶有不育側(cè)枝, 且這些不育側(cè)枝以指向藻體表面并向內(nèi)彎曲的狀態(tài)共同形成瓶狀體(圖 2c和2d)。輔助細(xì)胞生殖枝叢也產(chǎn)生于內(nèi)皮層細(xì)胞, 其主枝包括4個細(xì)胞, 其中相對較大的細(xì)胞為輔助細(xì)胞。該枝叢主枝上的每個細(xì)胞同樣都帶有不育側(cè)枝, 同時也以與果胞枝生殖枝叢同樣的狀態(tài)形成瓶狀體(圖 2e)。

精子是由雄配子體藻體表面的精子囊釋放的,精子囊由皮層細(xì)胞產(chǎn)生。精子可以通過雌配子體表面的受精絲到達(dá)果孢, 與其中的卵子結(jié)合完成受精作用。受精后的果胞先后與下位細(xì)胞和果胞枝上的基細(xì)胞融合形成融合細(xì)胞。融合細(xì)胞能夠產(chǎn)生聯(lián)絡(luò)絲, 聯(lián)絡(luò)絲逐漸延伸與相鄰的輔助細(xì)胞相連,隨后相近的融合細(xì)胞與輔助細(xì)胞發(fā)生融合。融合后的輔助細(xì)胞再與周圍的瓶狀體中其他細(xì)胞繼續(xù)融合形成融合復(fù)合體(圖 2f)。接著融合復(fù)合體中一部分細(xì)胞橫向分裂延伸成營養(yǎng)絲, 另一部分向藻體表面縱向分裂延伸成產(chǎn)孢絲, 并在產(chǎn)孢絲的頂端產(chǎn)生果孢子。而后營養(yǎng)絲與周圍髓絲相互纏繞逐漸發(fā)育為囊果被, 果孢子被包裹在其中, 即為囊果(圖 2g和2h)。隨著囊果的成熟, 果孢子會從藻體表面的囊果孔釋放(圖 2i)。成熟囊果可在藻體表面觀察到(圖 1d), 其直徑范圍為180—240 μm。

圖2 傘形蜈蚣藻內(nèi)部結(jié)構(gòu)Fig. 2 The internal structure of gametophyte of G. corymbcladia

圖3a為傘形蜈蚣藻四分孢子體表面觀, 四分孢子囊產(chǎn)生于藻體皮層細(xì)胞, 成熟的四分孢子囊稍突出于藻體表面, 散落分布于傘形蜈蚣藻的主枝和小枝上(圖 3a)。成熟的四分孢子囊呈十字形分裂, 長為50—60 μm, 寬15—20 μm, 由四分孢子囊母細(xì)胞(圖 3b)經(jīng)減數(shù)分裂先形成二分體(圖 3c), 再分裂形成四分體(圖 3d)。

圖3 傘形蜈蚣藻四分孢子體內(nèi)部結(jié)構(gòu)(LNU2017052601)Fig. 3 The internal structure of tetrasporophyte of G. corymbcladia (LNU2017052601)

2.3 傘形蜈蚣藻和亞櫛狀蜈蚣藻的早期發(fā)育

在實驗室條件下同時培養(yǎng)了傘形蜈蚣藻和亞櫛狀蜈蚣藻。傘形蜈蚣藻成熟雌配子體表面分布有囊果, 藻體上成熟的囊果釋放大量果孢子至載玻片(圖 4d)。果孢子球形, 紫紅色, 直徑20 μm左右(圖 4a)。24h后, 果孢子一端形成萌發(fā)管且原生質(zhì)體開始向萌發(fā)管移動, 原位置會形成空泡, 空泡中含有透明的膠狀物質(zhì)(圖 4b)。當(dāng)原生質(zhì)體全部移動入萌發(fā)管后, 原生質(zhì)體與空泡間形成隔膜(圖 4c和4e)。隨后, 原生質(zhì)體開始分裂, 隨著分裂產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)量的增多, 空泡及其內(nèi)部的透明膠質(zhì)逐漸變小消失, 至此到達(dá)細(xì)胞團(tuán)階段(圖 4f—j)。當(dāng)細(xì)胞團(tuán)水平方向分化出基細(xì)胞且垂直方向分化出頂細(xì)胞時進(jìn)入到盤狀體階段(圖 4k)。幾個盤狀體會相互靠近并發(fā)生盤狀體融合(圖 4l—m), 當(dāng)盤狀體到達(dá)一定大小, 會逐漸向上發(fā)育為直立枝(圖 4n), 而后進(jìn)一步發(fā)育為幼苗(圖 4o)。亞櫛狀蜈蚣藻早期發(fā)育過程與傘形蜈蚣藻完全一致。

圖4 傘形蜈蚣藻的早期發(fā)育Fig. 4 Early development of G. corymbcladia

2.4 基因序列分析

rbcL基因序列分析 本研究共獲得6條傘形蜈蚣藻的rbcL基因序列, 序列長度均為1317 bp, 比對校正后的長度為1124 bp。

rbcL基因序列比對(MAGE6.0)結(jié)果顯示(圖 5),傘形蜈蚣藻的6個樣本之間無堿基差異, 與亞櫛狀蜈蚣藻無堿基差異, 形成一個單獨的小分支, 區(qū)別于其他種。傘形蜈蚣藻和亞櫛狀蜈蚣藻與帶形蜈蚣藻G. turuturu的堿基差異為12 bp(1.089%), 與東方蜈蚣藻G.orientalis的堿基差異為38 bp(3.366%);與2個外群種H. durvillei和P. constrictus的堿基差異分別為63 bp(5.564%)和65 bp(5.780%)。

圖5 基于rbcL基因構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree based on partial rbcL sequences data

COⅠ基因序列分析本研究共獲得6條傘形蜈蚣藻的COⅠ基因序列, 序列長度均為649 bp,比對校正后長度為552 bp。

COⅠ基因序列比對(MAGE6.0)結(jié)果顯示(圖 6),傘形蜈蚣藻的6個樣本之間無堿基差異, 與亞櫛狀蜈蚣藻無堿基差異, 形成一個單獨的小分支, 區(qū)別于其他種。傘形蜈蚣藻和亞櫛狀蜈蚣藻與帶形蜈蚣藻的堿基差異為16 bp(2.983%), 與鏈狀蜈蚣藻G. catenata的堿基差異為35 bp(6.440%); 與2個外群種H.floresia和P. affinis的堿基差異分別為42 bp (7.570%)和48 bp(8.638%)。

圖6 基于COⅠ基因構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 6 Phylogenetic tree based on partial COⅠ sequences data

3 討論

海藻分類最初運用的是經(jīng)典的形態(tài)學(xué)分類方法, 該方法主要通過藻體的外部形態(tài)及生殖結(jié)構(gòu)來區(qū)分鑒定物種, 但當(dāng)面對形態(tài)相似的藻類時, 其鑒定結(jié)果就會缺乏準(zhǔn)確性[25]。隨著分子技術(shù)的發(fā)展,分子分析逐漸取代形態(tài)觀察成為更為準(zhǔn)確的鑒定種的方法, 而形態(tài)觀察更傾向于用作藻類的初步歸類以及作為分子結(jié)果的補充, 在這種趨勢下, 分子

輔助的形態(tài)分類學(xué)方法應(yīng)運而生。分子輔助的形態(tài)分類學(xué)方法的提出不但解決了形態(tài)分類學(xué)與分子分類學(xué)之間的矛盾, 還可以通過分析基因序列建立新的形態(tài)學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn), 對鑒定已知種和發(fā)現(xiàn)新種等都具有重要意義。該方法一經(jīng)提出便在國際上獲得廣泛認(rèn)可, 不僅成為國外海藻分類重要方法[26—28],在國內(nèi)也得到了廣泛應(yīng)用: 作者團(tuán)隊?wèi)?yīng)用該方法對蜈蚣藻屬藻類進(jìn)行了更為準(zhǔn)確的鑒定, 報道了鶯歌海蜈蚣藻G. yinggehaiensisWang et Luan和齒狀蜈蚣藻G. serraWang et Lou等8個新種[15—20,29], 獲得普遍認(rèn)可。以上事實充分顯示了分子輔助的形態(tài)分類學(xué)方法在海藻分類學(xué)中的地位及其可靠性。

本研究運用分子輔助的形態(tài)分類學(xué)方法對傘形蜈蚣藻和亞櫛狀蜈蚣藻進(jìn)行了研究。通過觀察外部形態(tài)發(fā)現(xiàn)二者基本相同但略有差異(表 3)。2016年李芳等[3]指出蜈蚣藻屬海藻外部形態(tài)變化較大,同一物種也會因為標(biāo)本采集的時間、地點和生態(tài)環(huán)境的不同而存在差異; 傘形蜈蚣藻的內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征與亞櫛狀蜈蚣藻相關(guān)研究中報道的內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征一致, 二者的輔助細(xì)胞生殖枝叢類型均為Grateloupia型(5cpb-4auxb型)。1970年Chiang[30]指出海膜科的輔助細(xì)胞生殖枝叢類型有5種, 其中Grateloupia型為蜈蚣藻屬典型類型, 可作為鑒定蜈蚣藻屬海藻的重要特征, Kawaguchi等[31]隨后再次明確了生殖枝叢結(jié)構(gòu)對于蜈蚣藻屬分類鑒定的重要意義; 在實驗室條件下培養(yǎng)傘形蜈蚣藻和亞櫛狀蜈蚣藻的雌配子體, 觀察到二者釋放的孢子均先產(chǎn)生萌發(fā)管再分裂形成盤狀體, 孢子早期發(fā)育類型均為“間接盤狀體”型。作者團(tuán)體還對縊基蜈蚣藻和披針形蜈蚣藻等[32—36]幾種蜈蚣藻的孢子早期發(fā)育進(jìn)行了研究, 結(jié)果均為“間接盤狀體”型, 可見“間接盤狀體”型為蜈蚣藻屬海藻孢子早期發(fā)育的一種重要類型; 基于rbcL和COⅠ基因序列分析結(jié)果顯示, 傘形蜈蚣藻與產(chǎn)自浙江省溫州市的亞櫛狀蜈蚣藻之間無堿基差異, 聚集在一個單獨的分支上。2016年李芳等[3]提出rbcL序列在蜈蚣藻屬中的種內(nèi)遺傳變異為0.0—1.0%, 2015年Yang等[14]提出COⅠ基因序列在蜈蚣藻屬中的種內(nèi)遺傳變異為0.0—1.6%, 本研究中傘形蜈蚣藻和亞櫛狀蜈蚣藻與蜈蚣藻屬其他種之間的差異均大于上述范圍, 屬于種間差異。綜合上述結(jié)果, 傘形蜈蚣藻與亞櫛狀蜈蚣藻在外部形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、早期發(fā)育及分子分析等方面均一致, 即《中國海藻志》記載的傘形蜈蚣藻和亞櫛狀蜈蚣藻為同一種。同時我們也可以得出, 相比于傳統(tǒng)分類學(xué)參照的形態(tài)學(xué)分類方法, 分子輔助的形態(tài)學(xué)方法從多個方面研究并最終明確傘形蜈蚣藻的分類學(xué)地位, 得到的結(jié)果更具科學(xué)性和可靠性,對傳統(tǒng)分類方法具有指導(dǎo)意義。

表3 傘形蜈蚣藻和亞櫛狀蜈蚣藻的形態(tài)特征比較Tab. 3 Comparison of morphological characteristics of G. corymbcladia and G. subpectinata

4 結(jié)論

本研究運用分子輔助的形態(tài)分類學(xué)方法, 從形態(tài)觀察、早期發(fā)育及分子分析等方面對傘形蜈蚣藻與亞櫛狀蜈蚣藻進(jìn)行了詳細(xì)研究, 結(jié)果顯示二者為同一種, 傘形蜈蚣藻不成立。根據(jù)優(yōu)先法則, 將傘形蜈蚣藻作為亞櫛狀蜈蚣藻的同物異名。