人類(lèi)精子體外發(fā)生的研究展望

郭雪江

南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，組織與胚胎學(xué)系，江蘇 南京 211166

全球不孕不育癥的發(fā)病率約為15%，其中男性因素導(dǎo)致的病例占50%［1］。在過(guò)去的幾十年中，男性不育的發(fā)病率不斷上升，影響大約7%的男性［2］。男性不育主要是由于精子發(fā)生障礙導(dǎo)致，臨床表現(xiàn)為少、弱、畸形精子癥以及無(wú)精子癥。無(wú)精子癥中的非梗阻性無(wú)精子癥（nonobstructive azoospermia，NOA）由于患者睪丸中嚴(yán)重的精子發(fā)生障礙，是男性不育中精子發(fā)生障礙最嚴(yán)重的一種疾病。NOA在男性不育患者中約占10%［3］，其中40%～50%的NOA 患者無(wú)法被臨床醫(yī)生獲取可以用于胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)（intracytoplasmic sperm injection tech?nique，ICSI）的功能性精子［4］。因此，NOA 患者中部分睪丸活檢可獲得精原細(xì)胞，如能完成體外精子發(fā)生，則有望獲得可用于輔助生殖的成熟精子。此外，在人類(lèi)青春期前，精子發(fā)生尚未進(jìn)入減數(shù)分裂階段。兒童期腫瘤的放/化療治療可以導(dǎo)致生殖細(xì)胞的丟失。兒童腫瘤發(fā)病率為1.0‰～1.5‰，大約30%的患者由于腫瘤放療或化療會(huì)導(dǎo)致永久不育。對(duì)于兒童期放/化療之前的生育力保存，由于保留的睪丸組織中生精細(xì)胞尚未進(jìn)入減數(shù)分裂，沒(méi)有形成成熟精子，利用體外精子發(fā)生技術(shù)完成體外精子發(fā)生以及睪丸組織重建精子發(fā)生，有著非常重要的意義［5］。對(duì)于挽救NOA 患者的生育力及青春期前患者的生育力保存，目前臨床尚無(wú)好的方法。因此，建立并維持一個(gè)穩(wěn)定的體外精子發(fā)生體系，不僅將有助于上述問(wèn)題的有效解決，還可以幫助豐富人類(lèi)生殖生物學(xué)基礎(chǔ)理論研究，評(píng)價(jià)藥物的生殖安全性，為生育力重建提供方法。

精子發(fā)生是多步的驟復(fù)雜過(guò)程，包括在體細(xì)胞微環(huán)境幫助下，原始生殖細(xì)胞分化而來(lái)的精原細(xì)胞的有絲分裂，精母細(xì)胞的減數(shù)分裂以及精子細(xì)胞的變形產(chǎn)生蝌蚪狀精子，上述任一過(guò)程的缺陷均會(huì)導(dǎo)致精子發(fā)生障礙。近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，科學(xué)家們一直努力嘗試在體外重復(fù)上述過(guò)程，其中最關(guān)鍵的是通過(guò)體外減數(shù)分裂形成單倍體細(xì)胞。從體外精子發(fā)生的策略來(lái)說(shuō)，可以分別從體外干細(xì)胞培養(yǎng)分化形成精子細(xì)胞，或者通過(guò)體外性腺組織培養(yǎng)形成精子細(xì)胞，本文圍繞該兩種策略進(jìn)行了闡述與分析，并展望體外精子發(fā)生的應(yīng)用前景與倫理挑戰(zhàn)。

1 體外干細(xì)胞培養(yǎng)分化精子細(xì)胞

在體外干細(xì)胞分化精子細(xì)胞方面，已有很多的嘗試和研究。在精原干細(xì)胞體外分化方面，2002年，F(xiàn)eng 等報(bào)道了在缺乏支持細(xì)胞的情況下，將端粒酶永生化的小鼠A 型精原細(xì)胞系進(jìn)行體外分化，最終獲得精母細(xì)胞和精子細(xì)胞。然而，這批由小鼠精原細(xì)胞培養(yǎng)得到的圓形精子細(xì)胞是否具有受精能力尚不清楚。2003年，Tanaka等報(bào)道了將無(wú)精子癥患者的初級(jí)精母細(xì)胞與Vero細(xì)胞體外共培養(yǎng)，獲得了具有23條染色體的單倍體圓形精子細(xì)胞，最高成功率約為10%。2014年，Yang等對(duì)隱睪來(lái)源的精原干細(xì)胞體外分化進(jìn)行了研究，通過(guò)使用視黃酸（retinoic acid，RA）和干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）培養(yǎng)后，隱睪患者精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cell，SSC）中表達(dá)了許多減數(shù)分裂和減數(shù)分裂后的男性生殖細(xì)胞標(biāo)志物，并最終獲得單倍體精子細(xì)胞，但未能評(píng)價(jià)使人類(lèi)卵子受精以及胚胎發(fā)育的能力。

在多能干細(xì)胞分化方面，Yang等成功將小鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iP?SC）體外誘導(dǎo)分化為陽(yáng)性表達(dá)VASA、c?Kit 與SCP3等生殖細(xì)胞標(biāo)志物的生殖細(xì)胞。2015 年，Sasaki 等將人類(lèi)多能干細(xì)胞經(jīng)過(guò)早期中胚層樣細(xì)胞（incipi?ent mesoderm?like cell，iMeLC）誘導(dǎo)為人原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞（human primordial germ cell?like cell，hPG?CLC）［6］。2016年，中科院動(dòng)物研究所周琪院士與趙小陽(yáng)教授，及南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室沙家豪教授首次報(bào)道了小鼠胚胎干細(xì)胞體外完成減數(shù)分裂過(guò)程，獲得功能性精子細(xì)胞的研究。該研究利用小鼠胚胎干細(xì)胞，通過(guò)誘導(dǎo)分化形成原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞（primordial germ cell like cell，PG?CLC），并將PGCLC 與睪丸體細(xì)胞（neonatal testicu?lar somatic cell）在睪丸性激素的作用下進(jìn)行體外共培養(yǎng)，觀察到遺傳印記的擦除（erasure of genetic im?printing）和染色體聯(lián)會(huì)和重組（chromosomal synap?sis and recombination），產(chǎn)生的單倍體精子樣細(xì)胞（spermatid?like cell）具有正確的核DNA和染色體含量。在卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)注射精子樣細(xì)胞，可產(chǎn)生有活力和可育的后代，表明該方法成功重建了體外雄性配子發(fā)生，為未來(lái)研究人類(lèi)體外精子發(fā)生奠定了基礎(chǔ)。

2 體外性腺組織培養(yǎng)誘導(dǎo)精子發(fā)生

組織培養(yǎng)法通常是利用多種方法培養(yǎng)組織碎片或小器官來(lái)完成體外精子發(fā)生的。體外組織培養(yǎng)的核心優(yōu)勢(shì)在于，當(dāng)生殖細(xì)胞在體外生長(zhǎng)時(shí)，用于培養(yǎng)的組織可以保持生殖細(xì)胞及體細(xì)胞的空間排列，可以最大限度地模擬睪丸組織的微環(huán)境。近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，人們進(jìn)行了許多關(guān)于利用器官組織培養(yǎng)法進(jìn)行生殖細(xì)胞培養(yǎng)的嘗試，最早的體外睪丸組織培養(yǎng)可以追溯到100 年前。1920 年，法國(guó)科學(xué)家Champy 有史以來(lái)第一次報(bào)道了用器官組織培養(yǎng)法進(jìn)行生殖細(xì)胞體外分化。1959年，Trowell發(fā)明了一種培養(yǎng)方法：將大鼠睪丸小管放在空腔玻片中，同時(shí)使用Eagle 的最低基本培養(yǎng)基（minimum essen?tial media，MEM），生精小管可存活6 d。這一時(shí)期，體外睪丸組織培養(yǎng)的主要目標(biāo)是維持睪丸組織的活力。盡管做出極大努力，但精子體外發(fā)生的研究進(jìn)展不如期望，體外產(chǎn)生具有受精發(fā)育能力的單倍體精子細(xì)胞更是困難重重。

直到2011年，Yokonishi等用鑷子將新生小鼠的睪丸組織分成2～8 塊，分別在3 種不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（alpha?MEM、DMEM、StemPro?34?SFM）中培養(yǎng)，并輔以胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），利用瓊脂糖凝膠支撐培養(yǎng)睪丸組織。所產(chǎn)生的精子細(xì)胞和精子分別通過(guò)圓形精子細(xì)胞注射（round spermatid in?jection，ROSI）和ICSI 成功產(chǎn)生了可存活的后代［7］。隨后，在2012年，Sato等利用這項(xiàng)技術(shù)，將c?Kit配體（c?kit ligand，KitL）基因缺陷的不育小鼠睪丸組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，并且加入外源性的重組KITL 蛋白，最終得到了可育精子，這項(xiàng)研究為遺傳性精子發(fā)生缺陷患者開(kāi)辟了新的治療策略。并進(jìn)一步使用成年小鼠睪丸組織進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示成熟成年小鼠睪丸組織的培養(yǎng)是有效的，可以從精原細(xì)胞誘導(dǎo)精子發(fā)生直到有效的單倍體細(xì)胞形成［8］。

然而，盡管經(jīng)過(guò)一個(gè)世紀(jì)的努力，人睪丸器官發(fā)生的體外研究依然非常局限。直到2020年，本實(shí)驗(yàn)室課題組以及中科院動(dòng)物研究所課題組實(shí)現(xiàn)了人類(lèi)睪丸器官的體外精子發(fā)生體系構(gòu)建［9］。這一人類(lèi)睪丸類(lèi)器官培養(yǎng)體系采用流產(chǎn)胎兒的生殖嵴，在體外成功建立了包含生精上皮和各級(jí)生殖細(xì)胞的培養(yǎng)體系，通過(guò)添加骨形成蛋白（bone morphogenet?ic protein，BMP）、干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）等細(xì)胞因子，最終獲得了功能性精子。值得注意的是，上述3 種因子都通過(guò)受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）通路發(fā)揮功能，提示激酶磷酸化通路在體外精子發(fā)生中的重要作用［10-11］。體外培養(yǎng)的單倍體精子細(xì)胞經(jīng)歷了減數(shù)分裂重組，達(dá)到了體外生殖細(xì)胞培養(yǎng)的金標(biāo)準(zhǔn)［12］，這些精子細(xì)胞能夠使人類(lèi)卵母細(xì)胞受精并支持隨后的囊胚（blastocyst）形成。

3 挑戰(zhàn)與展望

經(jīng)過(guò)一個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，體外精子發(fā)生已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。目前這一領(lǐng)域進(jìn)入了一個(gè)挑戰(zhàn)與機(jī)遇并存的時(shí)代。體外精子發(fā)生主要基于體外干細(xì)胞培養(yǎng)分化精子細(xì)胞或體外性腺組織培養(yǎng)誘導(dǎo)精子發(fā)生兩種體系，無(wú)論采用何種方法，都需要獲得生殖細(xì)胞，生殖細(xì)胞經(jīng)歷有絲分裂增殖、啟動(dòng)并完成減數(shù)分裂形成單倍體精子細(xì)胞。其中體外減數(shù)分裂產(chǎn)生單倍體精子細(xì)胞的過(guò)程最為關(guān)鍵，所以Handel 等在2014 年提出了體外減數(shù)分裂的一系列金標(biāo)準(zhǔn)，包括對(duì)減數(shù)分裂的同源染色體聯(lián)會(huì)配對(duì)、同源重組的觀察，染色體與DNA 的含量和結(jié)構(gòu)分析，以及單倍體細(xì)胞的功能評(píng)價(jià)［12］。對(duì)于體外培養(yǎng)獲得的精子，可以通過(guò)分析染色體倍體和基因組完整性、表觀遺傳如印記基因甲基化模式建立、頂體等精子特有結(jié)構(gòu)的形成，并評(píng)價(jià)精子支持胚胎發(fā)育的能力，系統(tǒng)評(píng)價(jià)體外分化精子的功能。

體外精子發(fā)生在面臨挑戰(zhàn)的同時(shí)，也是一個(gè)充滿機(jī)遇的新領(lǐng)域。一方面，由于模式動(dòng)物并不能完全模擬人類(lèi)精子發(fā)生過(guò)程，人類(lèi)體外精子發(fā)生的研究將會(huì)進(jìn)一步闡明人類(lèi)生殖生物學(xué)的相關(guān)機(jī)制及環(huán)境因子和藥物對(duì)生育力的影響。另一方面，人類(lèi)男性青春期前，尚無(wú)精子的產(chǎn)生。青春期前兒童腫瘤的放療和化療會(huì)導(dǎo)致部分患者生育力的喪失。如果這部分青少年的睪丸組織可以被保存，并得以用于未來(lái)的體外精子發(fā)生培養(yǎng)，將對(duì)于這部分患者的不孕不育治療提供巨大的幫助。此外，40%～50%NOA 患者經(jīng)睪丸活檢無(wú)“單倍體”精子［4］，其中約20%患者為唯支持細(xì)胞綜合征（sertoli cell only syn?drome，SCOS）或僅存在精原干細(xì)胞或部分精母細(xì)胞等生精階段早期的生殖細(xì)胞［4］，體外精子發(fā)生將有助于上述患者產(chǎn)生遺傳學(xué)父子關(guān)系的子代?？梢韵胂?，不遠(yuǎn)的將來(lái)，在相關(guān)技術(shù)的支持和法規(guī)的監(jiān)管下，科學(xué)家和醫(yī)生可以直接通過(guò)微創(chuàng)手術(shù)獲得不育患者的睪丸組織樣本或者通過(guò)生育力保存的青春期前睪丸組織，通過(guò)體外培養(yǎng)方法獲得單倍體精子，解決男性不育的難題。