代謝組學(xué)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相關(guān)研究中的應(yīng)用

龔俊杰，劉秀秀，王 平*，張璐璐*

1浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014；2南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211166

隨著高通量檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和數(shù)據(jù)分析方法的建立，代謝組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生，在疾病的研究中逐漸受到重視。代謝組學(xué)位于組學(xué)下游，相比于轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)能更加直觀、準(zhǔn)確地反映體內(nèi)在生理或病理狀態(tài)下的代謝變化，是基因表達(dá)調(diào)控和蛋白執(zhí)行功能在代謝水平上的最終體現(xiàn)。近年來，代謝組學(xué)在人類常見的腫瘤如肺癌、肝癌和胃腸道癌等研究領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用，并在揭示其病理機(jī)制的研究中做出了重要的貢獻(xiàn)［1-3］。結(jié)合本課題組前期的工作發(fā)現(xiàn)，作為神經(jīng)血管單元（neurovascular unit，NVU）的重要組成部分神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞之間存在密切的相互調(diào)控關(guān)系，例如血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能異常會(huì)損害海馬神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致動(dòng)物認(rèn)知功能障礙，星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能異常會(huì)加劇神經(jīng)元的異常放電誘導(dǎo)癲癇發(fā)生等，據(jù)此我們有理由相信維持神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)對(duì)于神經(jīng)血管單元的結(jié)構(gòu)和功能同樣具有重要意義［4-5］。換而言之，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的異常增殖形成的神經(jīng)膠質(zhì)瘤將嚴(yán)重影響腦功能甚至威脅人類的生命。基于以上兩點(diǎn)，本文重點(diǎn)探討代謝組學(xué)在治療較為困難且預(yù)后較差的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的應(yīng)用。

1 代謝組學(xué)概述

代謝組學(xué)（metabonomics）的概念最早在1999年被提出，它是研究生物體在生理、病理狀態(tài)時(shí)或外界理化因子刺激下內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體特征及其變化規(guī)律的一門學(xué)科［6］。其核心任務(wù)是通過高通量檢測(cè)平臺(tái)鑒定能夠反映生物表型的生物標(biāo)志物和利用模式識(shí)別將生物標(biāo)志物與生物學(xué)功能進(jìn)行關(guān)聯(lián)。代謝組學(xué)從研究特點(diǎn)上分為靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)，在腫瘤生物標(biāo)志物研究中使用較多的是非靶向代謝組學(xué)，其特點(diǎn)是無偏向的檢測(cè)樣本中所有能檢測(cè)到的代謝物分子，對(duì)代謝物進(jìn)行相對(duì)定量，通過生物信息學(xué)方法進(jìn)行差異分析和通路分析，尋找具有顯著生物學(xué)意義的生物標(biāo)志物。代謝組學(xué)的研究對(duì)象主要包括體液（如血液、尿液、腦脊液等）、細(xì)胞、組織等生物系統(tǒng)中所有小分子量（＜1.0～1.5 kDa）內(nèi)源性代謝物的完整集合，例如碳水化合物、脂質(zhì)、氨基酸、小分子肽以及維生素等［7］。值得強(qiáng)調(diào)的是，科學(xué)的樣本收集是確保待檢樣本的代謝特征能準(zhǔn)確表征生物性狀或表型的前提，因此能否快速實(shí)現(xiàn)取材部位的代謝淬滅和能否做到精準(zhǔn)取材以及樣本制備的方法學(xué)是否可靠是確保代謝組學(xué)研究意義的關(guān)鍵所在，最終的目的是代謝組學(xué)的結(jié)果能更符合腫瘤本身的代謝特征［8-9］。

核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance，NMR）和高效液相色譜/氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography/gas chromatogra?phy?mass spectrometry/ mass spectrometry，HPLC/GC?MS/MS）是代謝組學(xué)常采用的兩種檢測(cè)技術(shù)。核磁共振波譜技術(shù)包括氫譜（1H?NMR）、碳譜（13C?NMR）以及二維譜（2D?NMR）等檢測(cè)類型，主要提供代謝物的碳骨架和氫原子環(huán)境等化學(xué)結(jié)構(gòu)相關(guān)信息，該技術(shù)具有樣本制備量少、可重復(fù)性好、樣本物態(tài)（液體、固體、半固體）選擇靈活等優(yōu)勢(shì)［7］。將核磁共振的波譜學(xué)特征與核磁共振的影像學(xué)特征相結(jié)合發(fā)展出磁共振波譜成像（magnetic resonance spectro?scopic imaging，MRSI）技術(shù)，該技術(shù)在代謝組學(xué)相關(guān)研究中被廣泛應(yīng)用，尤適合在體研究腦部疾?。ㄈ缒X部腫瘤、阿爾茨海默癥等）的代謝規(guī)律［10-11］。高分辨魔角旋轉(zhuǎn)核磁共振波譜（high resolution magic an?gle rotation?NMR，HRMAS?NMR）是NMR 在代謝組學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的代表性技術(shù)，已成為一種以非破壞方式直接分析生物樣本的重要手段，尤適合分析半固體狀的生物組織樣本（如組織、細(xì)胞等），可以有效避免分子運(yùn)動(dòng)受限以及磁化率不均勻引起的譜線增寬，提高代謝物檢測(cè)分辨率［12］。

質(zhì)譜主要提供代謝物相對(duì)分子質(zhì)量等信息，具有檢測(cè)范圍寬泛、靈敏度高、專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。在代謝組學(xué)的研究中，質(zhì)譜通常與液相色譜、氣相色譜聯(lián)用，充分發(fā)揮色譜對(duì)復(fù)雜生物代謝物樣本的前期分離作用，有利于后續(xù)更有針對(duì)性的質(zhì)譜檢測(cè)。相比于常規(guī)色譜，超高效液相（ultra performance liq?uid chromatography，UPLC）使用超高壓輸液泵和小孔徑固定相顆粒，提高用于檢測(cè)的代謝組學(xué)樣本成分的分離度，從而達(dá)到更好的分辨率［13］。高效毛細(xì)管電泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE）則適合高極性和帶電代謝物的分離，并且能與質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)聯(lián)用［14］。另外，質(zhì)譜串聯(lián)（tandem mass spectrometry）適合進(jìn)行代謝通量分析，旨在揭示復(fù)雜生化網(wǎng)絡(luò)中的代謝反應(yīng)速率，是代謝組學(xué)研究領(lǐng)域一種新的實(shí)驗(yàn)方法［15］。質(zhì)譜成像（imaging mass spectrometry，IMS）被用于研究復(fù)雜生物樣本中代謝物的空間分布，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于組織中脂質(zhì)、糖類等物質(zhì)的成像，有助于更好地呈現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)重要物質(zhì)的分布情況［16-17］。

此外，代謝產(chǎn)物的鑒定和定量能夠讓我們了解生物體代謝情況，但不能反映它們之間相互流通和轉(zhuǎn)化等信息。穩(wěn)定同位素（如13C）標(biāo)記技術(shù)能夠在體內(nèi)監(jiān)測(cè)和追蹤細(xì)胞內(nèi)的代謝反應(yīng)，有助于揭示某種代謝產(chǎn)物的來源或去向，使人們更好地了解病理以及生理狀態(tài)下的代謝規(guī)律的動(dòng)態(tài)變化［18］。

代謝組學(xué)研究趨向于整合化、定量化、標(biāo)準(zhǔn)化方向發(fā)展，特別是規(guī)范的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析備受關(guān)注。代謝組學(xué)儀器平臺(tái)能夠?qū)δ[瘤樣本內(nèi)成百上千個(gè)代謝物進(jìn)行高通量檢測(cè)，產(chǎn)生龐大且多維度的代謝譜數(shù)據(jù)，必須應(yīng)用多元統(tǒng)計(jì)學(xué)等學(xué)科方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維或聚類分析，以便能宏觀上把握復(fù)雜的數(shù)據(jù)，從而更有效地挖掘信息。代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理的主要流程包括數(shù)據(jù)歸一化、模型構(gòu)建、模型評(píng)價(jià)、差異代謝物篩選和代謝通路富集分析。其中模型構(gòu)建是對(duì)多元變量統(tǒng)計(jì)分析的關(guān)鍵步驟，主要方法包括無監(jiān)督的主成分分析法（principal component analysis，PCA）和有監(jiān)督的偏最小二乘法判別分析法（partial least squares discriminant analysis，PLS?DA），目的是對(duì)代謝組學(xué)的高維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理。前者適用于分類信息未知的樣品，反映不同組別間自然的聚類趨勢(shì)，在代謝組學(xué)中主要用于質(zhì)控評(píng)價(jià)或分組。后者是代謝組學(xué)使用較多的方法，強(qiáng)調(diào)自變量對(duì)因變量的解釋和預(yù)測(cè)作用，去除對(duì)回歸無益噪聲的影響，使分類模型包含最少的變量數(shù)，為避免模型因過擬合而造成的預(yù)測(cè)作用不佳，還要對(duì)模型進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證以使模型具有更高的可靠性。

綜上，代謝組學(xué)擁有一套完整的方法體系，其工作流程如圖1所示。相比于其他組學(xué)（基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)），代謝組學(xué)位于組學(xué)終端，代謝產(chǎn)物的變化往往更能代表腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的各種生理生化反應(yīng)的整體信息和最終結(jié)果，被認(rèn)為是反映生物表型最有效的分子，能為腫瘤的機(jī)制研究、藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)、生物標(biāo)志物研究和臨床診療等提供更多有價(jià)值的信息。

2 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤與代謝異常機(jī)制

圖1 代謝組學(xué)工作流程圖Figure 1 Working flowchart of metabolomics

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的腦部惡性腫瘤，約占腦部惡性腫瘤的80%，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblasto?ma，GBM）屬于神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的級(jí)別最高的分型（Ⅳ級(jí)），惡性程度相對(duì)較高，治療后的5 年生存率僅為2%［19］。目前，GBM 的治療多采用手術(shù)切除癌灶再輔助放化療的策略［20］。替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是目前膠質(zhì)瘤治療的一線藥物，臨床試驗(yàn)表明接受放療聯(lián)合TMZ治療的患者的中位生存期明顯長(zhǎng)于僅接受放療的患者［21］。另外，合用TMZ能延長(zhǎng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者手術(shù)后的生存期［22］。亞硝基脲類烷化劑如卡莫司汀（carmustine）、洛莫司汀（lomustine）等，常單用或與其他化療藥物如甲基芐肼（procarba?zine）和長(zhǎng)春新堿（vincristine）等組成聯(lián)合化療方案應(yīng)用于惡性膠質(zhì)瘤的治療［23］。另外，靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的重組人單克隆IgG1 抗體貝伐珠單抗（bevacizum?ab）是目前唯一獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)的GBM分子靶向藥，它通過抑制腫瘤血管新生而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［24］。

代謝失調(diào)是細(xì)胞癌變的重要標(biāo)志之一，該特征在GBM中也得到充分體現(xiàn)，推測(cè)其原因可能是腫瘤細(xì)胞為更好維持其在體內(nèi)的生存、增殖和侵襲所做出的適應(yīng)性調(diào)整，包括對(duì)細(xì)胞內(nèi)糖類、谷氨酰胺、脂質(zhì)、核苷酸等重要物質(zhì)進(jìn)行的代謝重編程（metabol?ic reprogramming）［25］。因此，解析其異常的代謝機(jī)制是阻止腫瘤發(fā)生發(fā)展，提高治療收益以及改善預(yù)后的關(guān)鍵所在。Marin?Valencia等［26］研究表明，通過18F?脫氧葡萄糖正電子發(fā)射斷層成像（18F deoxyglu?cose?positron emission tomography，18FDG?PET），證實(shí)在GBM中葡萄糖代謝十分活躍，同位素標(biāo)記顯示從葡萄糖衍生的谷氨酸合成谷氨酰胺的生化反應(yīng)異?；钴S是GBM的重要代謝特征，由于谷氨酰胺酶（glutaminase，GLS）水平下調(diào)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量谷氨酰胺不能被代謝而逐漸積累，在缺乏外界供應(yīng)條件下胞內(nèi)谷氨酰胺的量也完全滿足GBM 細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的需要，但在缺乏葡萄糖供應(yīng)的環(huán)境中GBM細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，這種現(xiàn)象間接表明了GBM細(xì)胞內(nèi)的谷氨酰胺是過度積累的且細(xì)胞對(duì)其依賴度不高，而GBM細(xì)胞對(duì)葡萄糖代謝的依賴則高于谷氨酰胺。Shibao 等［27］對(duì)小鼠GBM 干細(xì)胞的代謝特征研究后發(fā)現(xiàn)，它們會(huì)消耗更多的葡萄糖和氧氣，產(chǎn)生大量乳酸并保持較高水平的ATP通量，且本身較大依賴氧化磷酸化產(chǎn)能的細(xì)胞會(huì)響應(yīng)代謝壓力而切換為糖酵解產(chǎn)能模式，證明GBM干細(xì)胞的代謝具有異質(zhì)性和可塑性。三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）處于物質(zhì)代謝的中心樞紐，為細(xì)胞提供大量能量和產(chǎn)生某些代謝所需的中間產(chǎn)物，是糖類、脂質(zhì)和某些氨基酸分解代謝最后階段的共通途徑。一般認(rèn)為，葡萄糖經(jīng)氧化代謝產(chǎn)生的乙酰輔酶A是進(jìn)入TCA循環(huán)的主要碳源。然而，Maher等［28］的研究得出了相異的結(jié)論，他們對(duì)人腦部腫瘤的原位代謝狀況進(jìn)行了研究，認(rèn)為來源于葡萄糖氧化的乙酰輔酶A 不足50%，TCA 循環(huán)的初始碳源發(fā)生了改變。Mashimo等［29］利用13C標(biāo)記乙酸鹽和葡萄糖，發(fā)現(xiàn)在GBM 組織與正常組織中乙酸鹽氧化和葡萄糖氧化存在明顯差異，正常組織的碳源主要依賴于葡萄糖氧化代謝，而在GBM中乙酸鹽氧化代謝和葡萄糖氧化代謝對(duì)碳源的貢獻(xiàn)相當(dāng)。因此，在GBM中乙酸鹽氧化也是重要的碳源途徑。并且，該項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)GBM中存在脂質(zhì)合成反應(yīng)異?；钴S的現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為GBM 中乙酰輔酶A 合成酶2（acetyl coen?zyme A synthetase 2，ACSS2）的活性上調(diào)，其具有催化乙酸和輔酶A 生成乙酰輔酶A 的功能，下調(diào)AC?SS2 的表達(dá)會(huì)抑制GBM 神經(jīng)球的生長(zhǎng)和活力。在此基礎(chǔ)上推測(cè)，大量的乙酰輔酶A 可能作為原料被源源不斷地提供給脂質(zhì)合成反應(yīng)，對(duì)于滿足GBM細(xì)胞快速增殖所需的高物質(zhì)能量需求具有重要意義。最近，Gularyan等［30］利用飛行時(shí)間?二次離子質(zhì)譜技術(shù)（time of flight?secondary ion mass spectrome?try，TOF?SIMS），實(shí)現(xiàn)正常腦組織和腫瘤組織表面特異性分子的可視化成像，從而清晰地觀察到GBM組織存在高水平膽固醇積累這一分子特征，進(jìn)一步證實(shí)了GBM發(fā)生了脂質(zhì)代謝紊亂。另外，Wang等［31-32］發(fā)現(xiàn)嘧啶和嘌呤的合成在神經(jīng)膠質(zhì)瘤干性細(xì)胞中異?；钴S，表明核苷酸的合成加速，可能與腫瘤高度的增殖性有關(guān)。值得注意的是，基因組測(cè)序表明，約有77%的繼發(fā)性GBM患者攜帶異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）突變基因，但在原發(fā)性GBM患者中并不常見，僅約為9%［33］。IDH1突變導(dǎo)致GBM 代謝機(jī)制異常，IDH1 失去原有正常的催化異檸檬酸生成α?酮戊二酸（α?Ketoglutarate，α?KG）的功能，獲得生成2?羥基戊二酸（2?hydroxyglu?taric acid，2?HG）這一新的酶活性。2?HG 是一種促癌代謝物，2?HG 可競(jìng)爭(zhēng)性抑制α?KG 依賴組蛋白去甲基化酶（histone demethylase，HDM）和脯氨酰羥化酶（prolyl hydroxylase，PHD）活性，HDM 與組蛋白甲基化的表觀遺傳修飾有關(guān)，參與調(diào)控某些癌癥相關(guān)基因的激活與抑制，最終影響癌細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)［34］，后者是低氧誘導(dǎo)因子?1α（hypoxia?inducible factor?1α，HIF?1α）降解的調(diào)節(jié)器，PDH 羥基化HIF?1α后招募泛素將其降解，抑制PDH的活性則上調(diào)HIF?1α誘導(dǎo)的靶基因（GLUT1、VEGF和PDK1）的表達(dá)水平，這些靶基因所編碼的蛋白均與腫瘤的增殖有關(guān)［35］。

綜上，GBM的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞代謝異常改變關(guān)系密切，其中伴隨許多復(fù)雜的生物學(xué)過程和涉及多種物質(zhì)代謝的分子機(jī)制，解析和明確GBM代謝重編程相關(guān)分子機(jī)制，對(duì)于指導(dǎo)代謝組學(xué)方法在GBM診斷、治療及預(yù)后的研究上具有重要意義。

3 代謝組學(xué)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤診斷

惡性腫瘤的早期多無癥狀或無明顯發(fā)病特征，一般患者處于病變晚期時(shí)才易被確診，因而延誤了最佳的治療時(shí)機(jī)。鑒于此，腫瘤早期的精準(zhǔn)診斷對(duì)于腫瘤后期的有效治療和預(yù)后至關(guān)重要。關(guān)于GBM的診斷，除了常規(guī)的問診、觸診外，還需結(jié)合其他診斷學(xué)資料，包括測(cè)定腫瘤標(biāo)記物的血清學(xué)檢查，判斷腫瘤形態(tài)和性質(zhì)的影像學(xué)檢查，以及目前鑒定腫瘤分期和分型相對(duì)可靠的病理學(xué)檢查。然而這些檢查手段在GBM 的診斷上都具有一定局限性［36-38］。近年來，代謝組學(xué)相關(guān)技術(shù)在GBM診斷上得到廣泛的應(yīng)用，并具有常規(guī)檢測(cè)手段無法比擬的優(yōu)勢(shì)。腫瘤是機(jī)體在致癌因子的作用下，細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生改變而使細(xì)胞獲得了無限增殖和異常分化能力所形成的異常新生物。因而，腫瘤細(xì)胞內(nèi)往往發(fā)生了代謝重編程，與正常細(xì)胞之間存在明顯的代謝譜差異，通過比較和分析這種差異，進(jìn)一步鑒定與腫瘤密切相關(guān)的代謝通路或生物標(biāo)志物，以此區(qū)分腫瘤的分型和基因型，準(zhǔn)確診斷是腫瘤精準(zhǔn)治療的前提。

Dang 等［39］通過代謝組分析，發(fā)現(xiàn)在IDH1（R132H）突變的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和人腦惡性膠質(zhì)瘤樣本中，2?HG濃度均顯著高于其相對(duì)應(yīng)的野生型和正常人腦樣本，這種差異達(dá)到數(shù)十倍甚至上百倍。顯然，2?HG 的水平可作為診斷和鑒別攜帶IDH1 基因突變GBM患者的重要指標(biāo)。此外，Prabhu等［40］提出一條促進(jìn)GBM增殖的新代謝途徑，即半胱氨酸分解途徑。他們發(fā)現(xiàn)，高級(jí)別GBM與低級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤比較，半胱氨酸雙加氧酶1（cysteine dioxygenase 1，CDO1）表達(dá)上調(diào)，超高效液相?串聯(lián)質(zhì)譜（ultra per?formance liquid chromatography?mass spectrometry/mass spectrometry，UHPLC?MS/MS）定量結(jié)果表明，CDO1催化產(chǎn)物半胱氨酸亞磺酸（cysteinesulfinic ac?id，CSA）水平在GBM 中顯著升高，相比于低級(jí)別膠質(zhì)瘤其積累量增加23倍以上。并且發(fā)現(xiàn)，暴露于缺乏葡萄糖和丙酮酸的環(huán)境下的GBM 細(xì)胞系耗氧量降低，究其原因可能是GBM 中CDO1 活性上調(diào)，通過加速半胱氨酸的分解使得CSA的合成增加，后者抑制丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）的活性，導(dǎo)致糖酵解產(chǎn)物丙酮酸無法成為TCA循環(huán)的底物而被進(jìn)一步氧化代謝，從而抑制細(xì)胞氧化磷酸化產(chǎn)生ATP 的能量代謝過程。因此，CSA 的積累能使丙酮酸進(jìn)入TCA循環(huán)途徑受阻，推測(cè)腫瘤細(xì)胞以代償性增加有氧糖酵解的方式獲取能量，即瓦伯格效應(yīng)（Warburg effect）。此外，另一代謝產(chǎn)物還原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）的水平在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中亦表現(xiàn)為升高，GSH可能有助于腫瘤抵抗內(nèi)源性氧自由基（oxygen free radical，ROS）的脅迫，以此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的凈化，減少氧化損傷引起的凋亡效應(yīng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活。綜上，檢測(cè)CSA水平一定程度上能夠?yàn)榕袆e低級(jí)別膠質(zhì)瘤和高級(jí)別的GBM 提供參考。另外，Gao等［41］利用毛細(xì)管電泳?質(zhì)譜技術(shù)（capillary electro?phoresis?mass spectrum，CE?MS）對(duì)分級(jí)不同的神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本進(jìn)行代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)組織中的亞?；撬幔╤ypotaurine，HT）水平與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的分級(jí)呈正相關(guān)，癌組織中的HT 含量顯著高于癌旁對(duì)照組織，HT 具有促進(jìn)GBM 細(xì)胞系增殖和轉(zhuǎn)移的作用。研究表明，HT 與α?KG、2?HG 三者共享PHD 的結(jié)合位點(diǎn)，并且HT 的結(jié)合自由能高于促癌代謝物2?HG。提示HT 可能是繼發(fā)現(xiàn)2?HG 后又一重要的PHD的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可能機(jī)制為HT與α?KG競(jìng)爭(zhēng)性占據(jù)同一活性位點(diǎn)而抑制PHD酶活性，增加HIF?1α的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管新生。因此，HT的含量可作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷的指標(biāo)之一，并且高水平的HT提示腫瘤具有較高的分級(jí)。最近，Yu等［42］基于色譜?質(zhì)譜的代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)分析不同級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織以發(fā)掘神經(jīng)膠質(zhì)瘤分級(jí)相關(guān)的差異代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)惡性程度越高的膠質(zhì)瘤短鏈?；鈮A（short?chain acylcarnitines）含量越高，而溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamines，LPEs）減少。此外，通過分析相關(guān)基因和途徑，發(fā)現(xiàn)與脂肪酸氧化有關(guān)的短/支鏈乙?；o酶脫氫酶（Acyl?CoA dehydrogenase short/branched chain，ACADSB）的基因表達(dá)下調(diào)，提示在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中脂質(zhì)代謝發(fā)生了明顯改變。

4 代謝組學(xué)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療

GBM 的治療目前主要采取手術(shù)切除腫瘤組織輔以放射治療和藥物治療的綜合防治策略［20，43］。最近，研究人員從GBM 患者身上獲取腫瘤樣本，利用單細(xì)胞RNA 測(cè)序（single cell RNA sequencing，scRNA?seq）技術(shù)，鑒別出GBM細(xì)胞有4種不同的亞型，每種亞型都有自身獨(dú)特的基因激活程序［44］。Cuperlovic?Culf 等［45］對(duì)9種GBM細(xì)胞系的代謝物進(jìn)行核磁共振波譜分析，同樣也發(fā)現(xiàn)不同的GBM細(xì)胞系的代謝譜存在差異性，依據(jù)代謝譜差異能將9 種GBM細(xì)胞系大致分為4類細(xì)胞亞群?？梢姡珿BM腫瘤細(xì)胞系存在異質(zhì)性，每種亞型的遺傳學(xué)特征各異，由此決定了各細(xì)胞亞型代謝上的差異性，標(biāo)準(zhǔn)的治療方案可能難以滿足不同病患個(gè)性化治療的需求，腫瘤異質(zhì)性是GBM治療面臨的潛在困難。此外，GBM 化療藥物替莫唑胺等屬于烷化劑，該類藥物的藥理機(jī)制是通過破壞細(xì)胞內(nèi)DNA 的結(jié)構(gòu)和功能，抑制細(xì)胞增殖和分裂等而引起細(xì)胞死亡。然而，GBM 細(xì)胞存在具有DNA 損傷修復(fù)功能的O6?甲基鳥嘌呤?DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（O6?methylguanine DNA methyltranferase，MGMT）和DNA合成過程中的核苷酸堿基錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)（mismatch repair system，MMRs），誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞在藥物治療過程中產(chǎn)生抗藥性，治療難以達(dá)到預(yù)期的目標(biāo)［46］。另外，血腦屏障（blood?brain barrier，BBB）是腦瘤治療藥物在腦內(nèi)擴(kuò)散的主要障礙，藥物難以在病灶區(qū)達(dá)到合適的血藥濃度，影響其療效的發(fā)揮，增加血腦屏障的通透性也是腦瘤治療必須克服的問題［47］。綜上，GBM 的治療依然面臨著腫瘤異質(zhì)性、腫瘤細(xì)胞耐藥、腦內(nèi)給藥困難等諸多難題。代謝組學(xué)的引入將為GBM 治療用藥相關(guān)的療效評(píng)價(jià)、耐藥性監(jiān)測(cè)、靶標(biāo)鑒定等科學(xué)問題的解決提供一套有力的研究方法。

腫瘤在治療后病灶縮小和避免腫瘤發(fā)生耐藥（drug resistance）是腫瘤治療的理想目標(biāo)，代謝組學(xué)通過檢測(cè)腫瘤治療后代謝譜的變化，發(fā)現(xiàn)某些小分子代謝物的含量變化在藥物療效評(píng)價(jià)上具有代表性，能夠反映藥物對(duì)敏感腫瘤的有效性和耐藥腫瘤的無效性等信息。St?Coeur 等［48］發(fā)現(xiàn)，在替莫唑胺耐藥的GBM 細(xì)胞系中，葡萄糖、檸檬酸和異檸檬酸等代謝物水平升高，而在替莫唑胺敏感的GBM細(xì)胞系中，丙氨酸、膽堿、肌酸以及磷酸膽堿等代謝物水平上調(diào)。這些結(jié)果揭示了特定的GBM 模型具有其對(duì)應(yīng)的代謝特征，此項(xiàng)研究為敏感和耐藥的腫瘤表型鑒別提供相關(guān)分子標(biāo)記物參考。Survivin 一種是細(xì)胞凋亡抑制蛋白，在惡性腦膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)Sur?vivin 蛋白上調(diào)，免疫組織化學(xué)結(jié)果提示在GBM 中的定位為強(qiáng)陽(yáng)性，并且與GBM 產(chǎn)生耐藥性和預(yù)后不良有關(guān)［49］。Hvinden 等［50］研究了Survivin 蛋白抑制劑YM155 對(duì)原發(fā)性GBM 干細(xì)胞代謝組的影響。結(jié)果表明，GBM 干細(xì)胞在給予YM155 治療后，檸檬酸水平在耐藥的腫瘤細(xì)胞系中明顯上調(diào)，而乳酸水平則在敏感和耐藥的腫瘤細(xì)胞中均表現(xiàn)為一致性的下降。因此，通過監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)乳酸和檸檬酸含量變化反映GBM 細(xì)胞對(duì)化療藥物的應(yīng)答性和耐藥性具有一定的指征意義。最近，Chandra 等［51］基于代謝組學(xué)研究了貝伐珠單抗誘導(dǎo)的GBM 腫瘤耐藥微環(huán)境的形成機(jī)制，發(fā)現(xiàn)GBM 中發(fā)生了以糖酵解上調(diào)和氧化磷酸化抑制為特征的代謝改變，揭示了GBM 在貝伐珠單抗治療下營(yíng)造的腫瘤缺血缺氧微環(huán)境中的適應(yīng)機(jī)制，靶向上述生化途徑有利于預(yù)防腫瘤在接受抗血管生成治療時(shí)耐藥性的產(chǎn)生。

腫瘤代謝標(biāo)志物的鑒定是代謝組學(xué)研究的核心任務(wù)，同時(shí)也是腫瘤診治的基礎(chǔ)。Palanichamy等［52］基于液質(zhì)聯(lián)用的代謝組學(xué)方法，檢測(cè)了GBM組織和正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，鑒定出色氨酸、蛋氨酸、犬尿氨酸、5?甲基硫代腺苷等4種在GBM細(xì)胞中上調(diào)的代謝產(chǎn)物，這些差異代謝產(chǎn)物激活了一系列如PI3K、Akt、ERK、p38?MAPK 等致癌蛋白激酶，促進(jìn)異常的腫瘤增殖信號(hào)的傳遞和相關(guān)增殖通路的啟動(dòng)。他們發(fā)現(xiàn)，相比于正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞，GBM 細(xì)胞的增殖過程對(duì)蛋氨酸更具有依賴性。并且，在GBM 腫瘤細(xì)胞中色氨酸?犬尿氨酸代謝途徑異?；钴S，加之缺乏犬尿氨酸相關(guān)代謝酶類，犬尿氨酸在腫瘤細(xì)胞內(nèi)顯示出進(jìn)一步積累。目前已證實(shí)，犬尿氨酸是腫瘤發(fā)生免疫逃逸的關(guān)鍵介質(zhì)［53］。因此，犬尿氨酸可能是反映GBM治療效果不甚理想的指征性代謝物。另外，Kesarwani等［54］通過代謝組學(xué)研究也得到了類似的結(jié)論，GBM中出現(xiàn)色氨酸代謝異常，參與色氨酸代謝的限速酶IDO1和TDO2表達(dá)增加，色氨酸?犬尿氨酸途徑在GBM 中被過度激活，抑制IDO1 酶活性可以顯著增強(qiáng)GBM 對(duì)放療的敏感性。綜上，代謝組學(xué)鑒定的某些代謝產(chǎn)物能夠反映腫瘤的狀態(tài)和患者獲得的治療收益，以此綜合評(píng)估腫瘤的進(jìn)展情況，及時(shí)調(diào)整治療方案，有利于實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)、多途徑、多層次的腫瘤干預(yù)。

5 代謝組學(xué)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后

GBM是神經(jīng)膠質(zhì)瘤中惡性程度最高的腫瘤，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，具有侵襲性，腫瘤組織與周圍正常腦組織無明顯邊界，手術(shù)難以全部切除，并且放化療治療效果有限，患者的預(yù)后通常不甚理想。目前認(rèn)為，GBM 不同亞型的遺傳變異會(huì)誘導(dǎo)多種代謝表型，這種代謝異質(zhì)性解釋了不同患者對(duì)于目前通用療法的敏感性存在差異的原因，同時(shí)這也為評(píng)價(jià)患者的治療獲益和腫瘤預(yù)后狀況提供了參考［55］。此外，GBM 中存在神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cell，GSC）已得到證實(shí)，并與腫瘤的復(fù)發(fā)息息相關(guān)［56］。代謝組學(xué)通過識(shí)別和鑒定腫瘤預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)記物，有助于評(píng)估和預(yù)測(cè)腫瘤的后續(xù)發(fā)展。

M?rén 等［57］將診斷后存活時(shí)間長(zhǎng)（≥3 年）的GBM患者和診斷后不久死亡（≤4個(gè)月）的GBM患者的腫瘤組織樣本代謝譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)3?磷酸甘油酯、肌醇、核糖醇和果糖等代謝物的水平與存活時(shí)間呈正相關(guān)性。Shen 等［58］對(duì)數(shù)百名GBM 患者的血漿樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析以獲取預(yù)后相關(guān)信息，他們?cè)谟?xùn)練集樣本中鑒定出與2年無病生存顯著相關(guān)的10種血漿代謝物，其中精氨酸、蛋氨酸、犬尿氨酸在測(cè)試集樣本中得到了進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)前二者水平升高與2 年總生存率增高相關(guān)，而犬尿氨酸的水平則與生存期呈負(fù)相關(guān)性。Chinnaiyan等［59］基于高通量的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本進(jìn)行全局的代謝組學(xué)分析，從包含大量純化標(biāo)準(zhǔn)品的代謝組學(xué)文庫(kù)中比對(duì)到308 種代謝物，這些代謝物大部分涉及脂質(zhì)、氨基酸、糖類等代謝過程，隨機(jī)森林分類器（random forest，RF）依據(jù)代謝譜將神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)行等級(jí)區(qū)分，發(fā)現(xiàn)高級(jí)別GBM具有代謝合成加速的特征，具體表現(xiàn)為糖酵解途徑代謝物3?磷酸甘油酸酯（3?phosphoglycerate，3?PG）和磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）顯著增加；脂質(zhì)合成及利用有關(guān)的肉堿（carnitine）顯著增加；核苷酸合成有關(guān)的5?磷酸核糖（5?ribose phosphate，R5P）、絲氨酸（serine）、甘氨酸（glycine）顯著增加?？梢?，高級(jí)別GBM 新陳代謝旺盛，腫瘤處于快速增殖狀態(tài)。比較發(fā)現(xiàn)，此類患者的中位生存期大約為15個(gè)月，相比于低級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后較差。最近，Rusu等［60］發(fā)現(xiàn)3?磷酸甘油酸脫氫酶（3?phosphoglyceric acid dehydroenase，GPD1）在休眠的腦腫瘤干細(xì)胞（brain tumor stem cell，BTSC）中特異性表達(dá)，與化療后神經(jīng)膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)有關(guān)，代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)分析證實(shí)，BTSC 中甘油磷脂代謝途徑較神經(jīng)干細(xì)胞（neu?ral stem cell，NSC）發(fā)生了顯著的改變。GPD1 是甘油磷脂代謝過程中的重要酶類，參與催化糖酵解產(chǎn)物磷酸二羥丙酮脫氫生成3?磷酸甘油，GPD1 過表達(dá)或其催化產(chǎn)物的增加預(yù)示著GBM 患者不理想的預(yù)后狀況。另外，該研究還證實(shí)了牛磺酸和亞?；撬岽x途徑在BTSC 中高度富集，途徑相關(guān)的代謝物也可作為預(yù)后評(píng)價(jià)的參考指標(biāo)。綜上，代謝組學(xué)鑒定的某些代謝標(biāo)志物對(duì)于患者的預(yù)后狀況有很好的評(píng)估和預(yù)測(cè)作用，這對(duì)于臨床醫(yī)生判斷患者的生存期和后期的隨訪以了解腫瘤進(jìn)展情況有重要的指導(dǎo)意義。

6 代謝組學(xué)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤藥物研發(fā)

目前應(yīng)用于臨床的GBM化療藥物品種有限，主要包括以替莫唑胺和洛莫司汀為代表的細(xì)胞毒類藥物和以貝伐珠單抗為代表的分子靶向藥物。細(xì)胞毒類藥物具有化療藥物常見的胃腸道不良反應(yīng)以及較為嚴(yán)重的骨髓抑制毒性。貝伐珠單抗因易產(chǎn)生耐藥性使得它的療效十分有限，并且對(duì)適用的患者人群具有一定的基因選擇性，難以很好發(fā)揮分子靶向藥物的優(yōu)勢(shì)［61］。因此，研發(fā)安全有效的新藥成為GBM治療領(lǐng)域的迫切任務(wù)。近年來，結(jié)合代謝組學(xué)方法的藥物重定位（drug reposition）即老藥新用成為藥物研發(fā)的重要思路［62］。代謝組學(xué)通過監(jiān)測(cè)腫瘤在藥物作用后引起的代謝變化，推測(cè)藥物可能干預(yù)的生化反應(yīng)途徑，結(jié)合藥物已有的藥理學(xué)和毒理學(xué)等基礎(chǔ)研究資料，能更加快速地篩選出若干候選藥物，并進(jìn)行深入研究，可以節(jié)省藥物研發(fā)的成本和提高藥物研發(fā)的成功率。

5?脂氧合酶（5?lipoxygenase，5?LO）抑制劑齊留通（Zileuton）能阻斷過敏性介質(zhì)白三烯（leukotri?enes，LT）的合成，用于防治哮喘等過敏性疾?。?3］。然而，Morin 等［64］發(fā)現(xiàn)治療GBM 可能是齊留通新的適應(yīng)證。他們采用核磁共振波譜檢測(cè)經(jīng)齊留通處理后的3種GBM細(xì)胞系代謝譜的變化，發(fā)現(xiàn)在5?LO高表達(dá)的GBM 細(xì)胞系中乳酸和腺苷的含量明顯減少，表明齊留通可能通過干擾腫瘤細(xì)胞的能量代謝而起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。其他研究也提示抑制5?LO的活性能夠誘導(dǎo)GBM細(xì)胞凋亡［65］。因此，齊留通在GBM 的治療上具有潛在的研發(fā)價(jià)值，同時(shí)也進(jìn)一步表明代謝組學(xué)又是藥物研發(fā)過程中揭示藥物如何影響生化代謝途徑的重要手段之一。

7 展 望

代謝組學(xué)在GBM 的研究領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，圍繞GBM 的早期診斷、治療優(yōu)化、預(yù)后評(píng)估、藥物研發(fā)等內(nèi)容，代謝組學(xué)以其獨(dú)特的研究思路和方法在相關(guān)研究中取得了大量成果，但仍然存在很多亟待解決的問題。其一，代謝組學(xué)最大的技術(shù)瓶頸在于代謝物的鑒定，目前質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析多依賴于代謝物標(biāo)準(zhǔn)品庫(kù)的建立，代謝物的圖譜很難做到通用性，隨著分析平臺(tái)、檢測(cè)條件、樣本前處理方式的不同均會(huì)有一定的差異性。因此，在實(shí)際代謝物鑒定工作中，自建適合自身分析條件和要求的標(biāo)準(zhǔn)品庫(kù)對(duì)于代謝組的物質(zhì)鑒定尤為重要。其二，代謝組學(xué)得到的大量代謝分子標(biāo)志物，但與其相關(guān)的生化代謝通路和生理調(diào)控機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，難以理清其中關(guān)系，加之缺乏交叉、多對(duì)象、多層次的驗(yàn)證，導(dǎo)致很多成果因缺乏可靠性而不能進(jìn)行從實(shí)驗(yàn)室向臨床的轉(zhuǎn)化，研究的價(jià)值和意義難以實(shí)現(xiàn)最大化。其三，代謝是一個(gè)生物體內(nèi)微妙的動(dòng)態(tài)過程，受到很多生理生化因素的影響，目前代謝組學(xué)的研究尚未能實(shí)現(xiàn)在體的原位檢測(cè)，許多來源于離體的GBM細(xì)胞系樣本、動(dòng)物GBM 移植樣本以及取自患者的GBM 樣本均不能很好模擬GBM 在腦內(nèi)真實(shí)的生理生化環(huán)境，導(dǎo)致代謝組學(xué)獲得的信息對(duì)GBM 的診斷、治療、預(yù)后等工作發(fā)揮的指導(dǎo)作用十分有限。因此，代謝組學(xué)未來可能朝著整合化的方向發(fā)展，實(shí)現(xiàn)代謝組學(xué)與其他組學(xué)或?qū)W科的有機(jī)銜接，多組學(xué)聯(lián)合分析和學(xué)科間多重交叉驗(yàn)證將為代謝組學(xué)的研究證據(jù)提供更有力的支撐。另外，為彌補(bǔ)體外研究的不足，自動(dòng)化和智能化的在體檢測(cè)也是代謝組學(xué)在腫瘤應(yīng)用上的發(fā)展方向。相信隨著代謝組學(xué)技術(shù)的日益成熟和人們對(duì)腫瘤的理解不斷深入，代謝組學(xué)必將在腦部腫瘤疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后過程中發(fā)揮重要作用，并為創(chuàng)新臨床診療方案和尋找治療靶標(biāo)提供理論依據(jù)。