骨髓間充質干細胞分離與培養(yǎng)技術

段長偉，柴彥杰，趙疆東，薛 桐，孫 權，胡澤兵

1970年，F(xiàn)riedenstein首次從骨髓中分離出一種多能基質細胞，呈梭形，可以進行體外克隆和多向分化，被稱為CFU-Fs(colony-forming unit fibroblasts)，隨后發(fā)現(xiàn)這種骨髓來源的基質細胞是間葉組織細胞譜系的共同前體細胞，因其具有干細胞的部分特性，而被命名為骨髓間充質干細胞(BMSCs)。BMSCs是一種能夠進行體外貼壁增殖、具有成纖維細胞樣形態(tài)和多向分化潛能的異質性細胞群，其在特定誘導條件下可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等細胞譜系。由于BMSCs易于分離和保存，具有“歸巢”特性、免疫原性低、腫瘤風險低、倫理爭議小等優(yōu)勢，其在細胞治療和再生醫(yī)學領域表現(xiàn)出廣闊的應用價值。但因缺乏統(tǒng)一標準，BMSCs在體外擴增時的純度、活性、表型和分化潛能差異很大，這成為導致基礎研究結論各異和臨床試驗效果不一的重要原因[1]。因此，深入認識BMSCs不同分離方法和培養(yǎng)條件的優(yōu)缺點，并根據(jù)實驗目的做出相應選擇，是進行BMSCs實驗研究的關鍵環(huán)節(jié)。本文主要就BMSCs在分離培養(yǎng)中的實驗要點和研究進展進行綜述。

1 骨髓間充質干細胞的分離

BMSCs的種屬來源豐富、分離培養(yǎng)簡單，目前研究中主要使用的BMSCs來自于人、大鼠、小鼠、犬等，采用的方法主要有差速貼壁法、密度梯度離心法、免疫磁珠分選法、流式細胞分選法等。但是不同的種屬來源和分離方法對BMSCs的細胞表型和增殖分化能力具有較大影響，應根據(jù)具體試驗目的選取合適的技術才能最大程度地減少BMSCs研究的差異性。

1.1 差速貼壁法:差速貼壁法是傳統(tǒng)的BMSCs分離方法，它利用了BMSCs與骨髓中其他細胞的貼壁性能差異及酶消化敏感性差異而逐步達到純化擴增目的。骨髓中細胞譜系復雜，貼壁生長能力差異較大，其中以巨噬細胞和內皮細胞最容易貼壁，其次是成纖維細胞和成纖維樣細胞，最差是脂肪細胞和造血干細胞，同時BMSCs的酶消化敏感性較高，因此可以通過差速貼壁和胰酶消化的方式逐漸分離出富含BMSCs的細胞群。傳統(tǒng)操作方法是用培養(yǎng)基將骨髓沖制成細胞懸液，接種在培養(yǎng)皿中后每3 d換液以去除未貼壁細胞，經(jīng)過3～4次消化傳代后逐漸純化BMSCs[2]。由于換液和酶消化是貼壁法的關鍵步驟，也有研究從細化換液和消化時間、調整首次酶消化順序等方面做了調整[3]，而huang等人則嘗試先用骨髓團塊法貼壁，以保留BMSCs原始環(huán)境而促進其快速增殖[4]。差速貼壁法是一種快速、簡單、經(jīng)濟的BMSCs分選方法，但是獲得的細胞純度相對不高。和消化時間、調整首次酶消化順序等方面做了調整[3]，而huang等人則嘗試先用骨髓團塊法貼壁，以保留BMSCs原始環(huán)境而促進其快速增殖[4]。差速貼壁法是一種快速、簡單、經(jīng)濟的BMSCs分選方法，但是獲得的細胞純度相對不高。

1.2 密度梯度離心法:密度梯度離心法是針對骨髓中不同細胞的大小和密度差異進行分選。骨髓細胞懸液加入到密度梯度離心液上面，通過離心使得不同類型細胞沉降至其等密度點，然后吸取特定位置富集的細胞。在離心分層時，紅細胞及多核細胞因比重(1.080 g/mL)較大而沉降于底部，其次是單個核細胞(包括BMSCs、造血干細胞、單核細胞等)，懸浮密度位于(1.053～1.075)g/mL，血漿及其溶解物懸浮密度位于1.050 g/mL，而脂肪細胞將漂浮于上層。常見的梯度離心液有Ficoll、Ficoll-Paque、percoll、Lymphopre等，其具有低粘性和低滲透性，使用密度約為1.077 g/mL，經(jīng)過800 g轉速離心20 min后，可見離心管內液體明顯分層，位于分離液之上的灰白色云霧狀層即為單個核細胞層，在獲取該層細胞后再通過差速貼壁法去除未貼壁細胞[5-6]。密度梯度離心是一種非常經(jīng)濟的BMSCs分選技術，但其分選的細胞特異性有限。此外，即使它是常見的實驗室技術，密度梯度離心也是一個難以掌握的、緩慢的操作過程。

1.3 細胞表面標志物分選法:基于細胞表面標志物的分選方式主要通過特異性識別BMSCs上的表面抗原而針對性篩選出目的細胞。BMSCs的特異性分選和鑒定是分不開的，用來鑒定的表面抗原也常被當做識別靶標，但是由于BMSCs缺乏單一有效的特異性表面抗原，所以對于哪些標志物適宜作為靶標尚未有定論。目前已報道的有STRO-1、CD146、CD105、SUSD2、Sca-1/CD90/PDGFRa、leptin受體等[7-10]。在選定識別靶標后又可以采用熒光和磁珠等方式對其相應抗體進行標記或結合，即目前已經(jīng)成熟應用于BMSCs富集的方式主要有流式細胞熒光分選法(FACS)和免疫磁珠分選法(MACS),二者分別以電場和磁場形式施加作用力而分離目的細胞。在實際應用中，MACS操作簡單而快速，細胞通量高，成本相對低，對細胞活性影響低，但是無法同時標記兩個或多個生物標志物；而FACS法操作較復雜，對實驗要求高，價格昂貴，細胞通量低而分選時間長，對細胞活性影響相對較大，但是分選所獲細胞的純度更高，也可以同時對多個表面標志物乃至細胞內標準物進行識別[11]。

上述四種分選方法中，由于FACS和MACS分選法的細胞通量較低，難以滿足臨床BMSCs應用研究中細胞用量較大的需要，同時經(jīng)過了磁場或電場的作用難以評估對細胞功能的影響程度。所以，目前在臨床試驗中應用的BMSCs分離技術還是以差速貼壁法和梯度離心法為主[12]。

2 骨髓間充質干細胞的鑒定

BMSCs細胞形態(tài)呈梭形，可聚集成均勻集落，在光學纖維鏡下有類似成纖維細胞的特征。但是，體外培養(yǎng)的BMSCs缺乏特異性和唯一性的標記物，現(xiàn)在普遍采用的鑒定方法是ISCT于2006年提出的關于人源MSCs的最低鑒定標準[13]，包括:①在體外標準培養(yǎng)條件下，細胞必須是呈梭形形態(tài)的黏附細胞；②通過流式細胞術檢測，細胞表面抗原表達CD105，CD73和CD90必須≥95%，同時表達CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α，或CD19 和HLA-DR必須≤2%；③細胞在標準體外分化條件下能夠分化為成骨細胞、脂肪細胞和成軟骨細胞。在其他物種來源的BMSCs鑒定中，大部分研究也借鑒了這些標準，但是需要注意的是，不同物種來源的BMSCs某些表面抗原表達存在較大差異性。這些最低標準的設定是在造血干細胞和骨髓基質細胞之間劃定了界限，旨在縮小因不同分離和培養(yǎng)條件而導致的研究差異性。但是，隨著MSCs臨床應用研究的不斷增長，迫切需要開發(fā)能夠更好地表征分離所得BMSCs增殖分化潛能甚至是預判臨床治療效用的標志物。BMSCs鑒定新標準的方向主要在于對表面抗原的細化分層分級，以及融入其他功能性判定指標，比如旁分泌能力、低免疫原性、“干性”相關基因表達等[14- 15]，而這一過程面臨的主要挑戰(zhàn)仍然是BMSCs的細胞異質性問題。

當前，已有不少文獻對BMSCs主要表面抗原或者功能相關分子的表達進行了更為細致的報道，有研究小組對不同捐獻者骨髓分離出的BMSCs進行了對比研究，按照體外擴增速率將BMSCs分為高增殖組和低增殖組，2組患者都符合ISCT標準，但是高增殖組BMSCs具有集落形成率高、體內異位成骨能力強等特點，存在細胞表面標志物STRO-1、PDGFR‐α(CD140a)高表達和細胞內基因TWIST-1、DERMO-1高表達[16]。Jin等模擬天然骨細胞外基質構建了纖維內礦化膠原蛋白支架并將其植入大鼠下頜骨缺損處，募集到更多的表達CD146+STRO-1+的BMSCs，骨再生能力得到顯著增強[17]。這些研究為更好地開展BMSCs實驗和建立功能性鑒定標準提供了參考。

3 骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)

BMSCs在生物體骨髓中的含量非常少，直接分離所得的初代細胞數(shù)量遠遠無法滿足科學研究以及臨床試驗需求，必須經(jīng)過體外擴增以獲取更多的高純度、強活性克隆集落。BMSCs分離的難點在于保證細胞純度，而培養(yǎng)的難點卻在于保持細胞活性，不同種屬來源的BMSCs在體外培養(yǎng)擴增方法基本相似，但是細微的營養(yǎng)條件、培養(yǎng)環(huán)境等差異都將會對細胞性能產(chǎn)生影響，因此在研究中必須綜合考量并合理優(yōu)化。

3.1 培養(yǎng)條件:目前使用的基礎培養(yǎng)基多是αMEM或者DMEM培養(yǎng)基，二者在基本成分方面對BMSCs細胞特性影響不大，主要影響因素在于血清、葡萄糖、生長因子、氧氣等。①血清。胎牛血清(FBS)已被證實可以用來為BMSCs體外生長提供營養(yǎng)，使用濃度在為5%～20%，以10%為居多；但是，有研究者認為FBS會給BMSCs培養(yǎng)帶來異種蛋白或微生物的輸入風險，建議使用同源性血清提取物作為營養(yǎng)來源，也有商用無血清培養(yǎng)基在人源BMSCs體外培養(yǎng)中顯示出良好性能[18]。②生長因子。盡管FBS已被接受用于臨床試驗級別的人源BMSCs體外培養(yǎng)，但是很多研究者將目光轉向生長因子添加物，以替代FBS進行培養(yǎng)條件優(yōu)化，包括人血清、血漿、血小板衍生生長因子、TGF-β1、IGF等[19-21]，其在保持人源BMSCs細胞特異性方面顯示出較好效果。③葡萄糖。葡萄糖是培養(yǎng)基中最常見的添加劑，由于健康生物體血清內的葡萄糖生理水平維持在1 mg/mL，所以也建議BMSCs培養(yǎng)時使用低糖培養(yǎng)基(1 mg/mL)[22]；葡萄糖濃度變化會影響B(tài)MSCs的細胞性能，高糖培養(yǎng)基(4.5 mg/mL)會減弱BMSCs的增殖能力并誘發(fā)過早衰老。④谷氨酰胺。谷氨酰胺是一種蛋白和氨基糖合成所必需的氨基酸，其與葡萄糖一樣在BMSCs培養(yǎng)中必不可少，尤其是在低糖低氧培養(yǎng)而又所需能量比較高時，可以作為BMSCs生長的補充能量來源[23]。⑤氧氣濃度。BMSCs所處的骨髓內微環(huán)境屬于低氧環(huán)境，根據(jù)離血管網(wǎng)的距離而在1%～8%之間變化[24]，因此體外培養(yǎng)的給氧濃度也應以低氧為宜，一般多選擇2%～5%[9,25]，低氧環(huán)境會降低BMSCs體外生長時細胞內氧化應激物濃度、減少DNA損傷、延緩細胞衰老并維持細胞分化能力[26]。

3.2 接種、傳代及凍存:細胞接種密度是BMSCs體外擴增時的重要問題。在骨髓細胞懸液的初代培養(yǎng)中，差速貼壁法分離時一般多以1×106～2×106個/cm2進行接種[2- 3]，密度梯度離心法分離時以約1×104個/cm2密度接種為宜[27]。而在傳代過程中，BMSCs接種密度多在2 000～5 000個/cm2。有研究顯示，低密度接種可能會因減少接觸抑制而有利于細胞的增殖，而且低密度接種不易影響細胞表面抗原表型和細胞分化能力[28-30]。與接種密度同樣重要的還有傳代次數(shù)，隨著體外擴增的進行，BMSCs會出現(xiàn)復制性衰老，表現(xiàn)為染色體端粒逐漸縮短、 “干性”減弱、突變風險增加[31- 32]。由于培養(yǎng)體系和判斷標準的不同，BMSCs體外培養(yǎng)的代數(shù)尚未有定論，一般認為1 520代已經(jīng)屬于近衰老狀態(tài)[1,33]。凍存是細胞儲存的重要手段，其在BMSCs體外保存和運輸中同樣適用，但是對于凍存是否影響細胞的活性尚有爭議。SOUKAINA等比較了不同凍存條件(凍存程序、時間、次數(shù)，凍存液成分、凍存細胞濃度等)對BMSCs性能(標志物表達、分化潛能、生長能力、遷移特性、基因表達等)的影響，對于BMSCs保存與運輸以及相應標準的制定具有一定參考價值[34]。

BMSCs研究一直是細胞治療和再生醫(yī)學領域的熱點之一，但是隨著研究的深入，在細胞的分離、鑒定、培養(yǎng)以及儲存等方面遇到很多問題，這些問題的核心在于尚未建立統(tǒng)一的研究標準，這也是導致BMSCs研究結果復雜各異的重要原因之一，也是BMSCs應用于再生醫(yī)學領域的重要障礙。本文總結了BMSCs實驗研究中的一些基礎問題，旨在為該領域研究者提供宏觀上的認識和具體操作細節(jié)上的參考。盡管關于BMSCs實驗技術方法的研究還不夠徹底，但是研究者正在不斷努力改進相關方法技術，可以預見會有更好的方法獲得均一、高活性的BMSCs，其所具有的自我復制、多向分化、免疫抵抗、分泌效應等生物學特性會在臨床疾病的治療發(fā)揮更大作用。