DNA折紙在納米生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

王建華，張 萍，夏青林，魏余輝，陳文勇，王 靜，李鵬程，李 賓，周星飛

1寧波大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江 寧波 315211；2中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所物理生物研究室，上海 201800；3中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4中國科學(xué)院上海高等研究院，基礎(chǔ)交叉中心，上海 201210

大多數(shù)生物都是以DNA作為遺傳物質(zhì)，然而DNA作為一種納米材料卻是近幾十年來的新嘗試。1982年，Seeman教授提出將DNA分子視作一個基本單元，利用堿基互補配對原理將其組裝成一些簡單的具有特定幾何形狀的納米結(jié)構(gòu)［1-3］。2006年，Rothemund發(fā)展了一種新穎的DNA 自組裝方法，即DNA 折紙技術(shù)（DNA origami）［4］。該技術(shù)是指長的單鏈DNA支架（通常是噬菌體M13），與數(shù)百條與之互補的短鏈DNA（通常20～60 bp）相互配對，通過編程設(shè)計折疊成具有一定形狀、不同維度的納米物體，如長方形、三角形、笑臉等［5-7］。同年，有學(xué)者利用這一技術(shù)“折”出了中國地圖，這也是利用DNA折紙構(gòu)建的第一個不對稱的納米圖形［8］。早期的DNA折紙合成的結(jié)構(gòu)比較簡單，但經(jīng)過科學(xué)家們的不懈努力，DNA折紙術(shù)在短短的十幾年中得到了飛速發(fā)展，目前已經(jīng)組裝出許多二維、三維甚至帶有曲面的復(fù)雜結(jié)構(gòu)［9-12］。由于DNA折紙其內(nèi)部具有很多單鏈DNA的交叉結(jié)構(gòu)，其彈性模量約為單根DNA的數(shù)倍［13］，從而大大增加了DNA折紙內(nèi)部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和韌性，為其在各個領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。

鑒于DNA折紙具有精確的可尋址性以及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等優(yōu)勢，使其在諸多領(lǐng)域有較大的應(yīng)用前景，如生物材料制備、藥物靶向遞送以及疫苗研究等［14］。例如，利用預(yù)先設(shè)計的3D打印技術(shù)，在外界溫度調(diào)控下實現(xiàn)DNA 納米結(jié)構(gòu)自發(fā)折疊，構(gòu)建了復(fù)雜的三維立體結(jié)構(gòu)。該技術(shù)有望應(yīng)用于智能醫(yī)療植入［15］。在納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，DNA納米技術(shù)展現(xiàn)了巨大的潛能，DNA折紙術(shù)作為一種獨特的DNA自組裝技術(shù)，近年來獲得了廣泛關(guān)注，由于折紙具有結(jié)構(gòu)精確可控、易于化學(xué)修飾和生物可降解等特點，其在生物分子檢測、靶向給藥和生物材料合成等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本文對DNA折紙在以上3個方面的應(yīng)用做了簡單的綜述。

1 DNA 折紙用于生物傳感

科學(xué)家一直在研究如何精準(zhǔn)地控制DNA的納米結(jié)構(gòu)用于生物分子的檢測。2009年，Andersen設(shè)計了一種可以打開釋放藥劑分子的正方形盒子，同時在蓋子上安裝了一個“鎖”，起到傳感器的作用，這個結(jié)構(gòu)可以探測癌細(xì)胞等生物大分子，并確保藥物分子能夠精準(zhǔn)釋放［16］。近日，基于DNA折紙結(jié)構(gòu)發(fā)展了一系列納米結(jié)構(gòu)作為原子力顯微鏡的力學(xué)成像探針，在單分子水平實現(xiàn)了對DNA分子的特異性標(biāo)記和單核苷酸變異性的直讀檢測［17］。相較于基于熒光成像的直讀方法，這種新技術(shù)將檢測分辨率提升了一個數(shù)量級，可達(dá)到遠(yuǎn)超光學(xué)衍射極限的10 nm分辨。這種基于DNA納米折紙結(jié)構(gòu)的探針為原子力顯微鏡圖像獲取提供了精確的標(biāo)尺，為遺傳分析提供了新的工具。這種單分子水平的檢測分析通量高，可靠性好，有望用于與疾病相關(guān)基因的鑒定。

DNA折紙本身還可以用來檢測紫外線的強度。紫外線長期以來被認(rèn)為會損害核酸，最近學(xué)者開發(fā)了一個DNA折紙輻射計［18］。不同于線性DNA鏈在紫外線照射下往往會降解成小段，DNA折紙的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和鏈間連接性顯著改變了紫外線誘導(dǎo)的DNA損傷的途徑。對于DNA折紙無論其形狀和大小，都可以觀察到其膨脹并最終分解的一般途徑。因此通過監(jiān)測DNA折紙納米結(jié)構(gòu)的形態(tài)演變來測量紫外線照射強度，這種依賴于結(jié)構(gòu)的變形可以轉(zhuǎn)化為基于DNA折紙的輻射計，用于測量環(huán)境中的紫外線劑量。

值得指出的是DNA折紙最近被用來精準(zhǔn)測量抗原和抗體的相互作用。譬如瑞典卡洛林斯卡研究所的科學(xué)家利用DNA折紙測量了密集的抗原之間最精確的距離，以獲得與免疫系統(tǒng)中抗體的最強結(jié)合［19-20］。目前，許多新的疫苗使用了一種叫做“粒子展示”的概念，這意味著抗原以粒子的形式被引入體內(nèi)，并以粒子的形式呈現(xiàn)給免疫系統(tǒng)，這些粒子表面有許多密集的抗原。在某些情況下，抗原的顆粒作為疫苗比單純提供游離抗原更有效?？贵w有一個Y形結(jié)構(gòu)，Y形結(jié)構(gòu)類似一個人的“手臂”，每個“手臂”都能與抗原結(jié)合。這樣，每個抗體分子通?？梢越Y(jié)合兩個抗原分子。研究發(fā)現(xiàn)抗原彼此之間的緊密程度和距離不會顯著影響抗體同時結(jié)合兩個分子的能力［21］。為了進(jìn)一步研究抗原和抗體的結(jié)合效果，Zhang等［22］利用三角形的DNA折紙骨架研究了室溫下捕獲免疫球蛋白Gs（IgGs）的瞬時構(gòu)象。研究人員首先建立了IgG親和力在單分子水平上幾十納米范圍橫向距離和力的依賴性，并利用高速AFM成像系統(tǒng)測量了IgG親和力大小，研究發(fā)現(xiàn)IgG可以響應(yīng)從短到長的表觀距離，呈現(xiàn)從高密度到遠(yuǎn)距離伸展的靈活構(gòu)象。這為包括診斷檢測和癌癥免疫療法在內(nèi)的應(yīng)用提供了思路，同時也增加了在單分子水平上對抗原抗體間相互作用機理的理解。

然而要精確確定抗原顆粒大小、抗原之間的間距以及每個顆?？乖臄?shù)量以最佳地刺激B細(xì)胞（通過其B細(xì)胞受體與目標(biāo)抗原結(jié)合）依然是一個巨大的挑戰(zhàn)。研究人員曾嘗試用各種合成顆粒，如聚合物、脂質(zhì)體或自組裝蛋白質(zhì)來制造亞基疫苗，但用這些材料無法像DNA折紙那樣精確地控制病毒蛋白質(zhì)的位置。最近麻省理工學(xué)院的研究人員基于DNA折紙設(shè)計出了一種類似HIV的顆粒［23］，由于抗原可以按照預(yù)先的設(shè)計附著在DNA折紙的任何位置，它們以精確的方式排列，以激發(fā)強烈的免疫反應(yīng)。Bathe和Irvine開始使用這些DNA支架來模擬病毒和疫苗的顆粒結(jié)構(gòu)，研究人員設(shè)計了與典型病毒相似大小和形狀的二十面體顆粒。他們將一種與Gp120蛋白相關(guān)的工程HIV抗原以不同的距離和密度附著在支架上。他們發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生最強B細(xì)胞反應(yīng)的疫苗不一定是那些將抗原盡可能緊密地包裹在支架表面的疫苗。目前研究人員正在努力嘗試用這種方法來開發(fā)SARS-CoV-2的潛在疫苗，并且他們預(yù)計該疫苗可以用于多種病毒性疾病。

2 DNA折紙用于藥物運輸

DNA折紙作為運輸載體在體外的設(shè)計已經(jīng)有了很多的研究工作，DNA折紙用于體內(nèi)的藥物運輸最近也有了很多的研究。研究人員利用DNA折紙向體內(nèi)運輸紅霉素［24］。他們首次研究了不同形狀的DNA折紙（如三角形和四邊形等）在腫瘤移植小鼠體內(nèi)的生物分布以及腫瘤積累，實驗發(fā)現(xiàn)具有不同形狀的DNA折紙會朝向腫瘤細(xì)胞運動并且很快在腫瘤區(qū)域累積。三角的DNA折紙在腫瘤細(xì)胞處累計最多，相比于沒有裝載藥物的折紙，載藥的折紙表現(xiàn)出明顯的治療效果，并顯著降低了癌癥細(xì)胞的耐藥性。說明DNA折紙是一種有效的生物相容性好的藥物載體。

除了將納米顆粒和高分子與DNA折紙連接外，有學(xué)者又發(fā)現(xiàn)了DNA硅化折紙術(shù)［25］。在實現(xiàn)DNA表面包覆二氧化硅的同時依然保持著DNA的組裝結(jié)構(gòu)，并有效提高組裝體的穩(wěn)定性。他們首先基于分子動力學(xué)模擬設(shè)計了兩種硅和磷酸前軀體,使得硅能夠成功地沉積到DNA骨架的表面中；然后基于各種DNA折紙模板，合成了不同尺寸的納米結(jié)構(gòu)，促使DNA-SiO2的雜化結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性成倍提高，從而使得DNA-SiO2復(fù)合結(jié)構(gòu)能夠更好地作為藥物分子的三維載體。

為了能夠更多地裝載藥物分子，科學(xué)家們進(jìn)一步將多面體DNA折紙框架為模塊［26-28］，將待裝配的納米粒子作為藥物分子裝入DNA折紙框架中，通過對DNA折紙框架的裝配來實現(xiàn)對內(nèi)部所包含納米粒子的間接組裝。研究人員選用四面體、八面體和立方體等三種具有不同頂點數(shù)目的DNA框架，通過頂點與頂點之間組裝得到一系列對稱性不同的晶體結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)利用八面體DNA折紙結(jié)構(gòu)可以獲得高度有序的三維晶體，研究組進(jìn)一步將金納米顆粒、量子點以及生物酶裝載在DNA折紙框架中，隨DNA折紙框架結(jié)構(gòu)的裝配實現(xiàn)了不同對稱性結(jié)構(gòu)的自組裝。這種基于DNA折紙術(shù)的框架結(jié)構(gòu)將有助于發(fā)展納米機器人在藥物輸送等方面的應(yīng)用。

當(dāng)納米粒子或高分子與DNA折紙固化后還需要把裝載的分子進(jìn)行釋放，以實現(xiàn)藥物緩釋的功能。最近，研究人員設(shè)計了具有立方中空結(jié)構(gòu)且含有出口的“納米盒”［29］，并演示了這些納米盒是如何以可控的方式攜帶和釋放DNA涂層納米顆粒。與固態(tài)納米結(jié)構(gòu)相比，中空納米結(jié)構(gòu)具有不同的光學(xué)和化學(xué)性質(zhì)，而且這種中空結(jié)構(gòu)中引入的表面開口（氣孔）隨機分布在表面上，通?？刂七@些孔洞的大小、形狀和位置就可以控制納米粒子的進(jìn)出。在實際應(yīng)用中，例如加載和釋放納米顆粒和化學(xué)小分子，就需要對表面開口進(jìn)行高度控制。這種立方中空結(jié)構(gòu)可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、傳感和催化等領(lǐng)域。

為了使DNA折紙和特定分子的結(jié)合更加具有特異性，有人將單股DNA折疊起來，形成簡單的微觀工具，如轉(zhuǎn)子和鉸鏈［30］。他們甚至用DNA構(gòu)建了一個“特洛伊木馬”，用于向癌細(xì)胞輸送藥物。研究小組使用DNA折紙制作了桿、轉(zhuǎn)子和鉸鏈。然后，他們用堅硬的DNA杠桿將納米級部件連接到由浸漬有磁性材料的聚苯乙烯制成的微型珠子上。通過調(diào)整磁場他們發(fā)現(xiàn)可以命令粒子來回擺動，組件在不到1 s的時間內(nèi)執(zhí)行了指示的動作。

將DNA折紙作為載體進(jìn)行納米藥物輸運的限制因素之一是當(dāng)DNA納米結(jié)構(gòu)被置于體內(nèi)時，很容易被酶消化或隨pH值變化而降解。因此科學(xué)家們嘗試合成了具有特定分子序列組成和長度的類肽生物來保護(hù)DNA［31-32］。研究人員合成了兩種用于保護(hù)DNA折紙的類肽結(jié)構(gòu)：刷子型和嵌段型。這兩種結(jié)構(gòu)都有一個DNA結(jié)合域(與負(fù)電荷的DNA結(jié)合的正電荷部分)和一個水溶性域(確保DNA 穩(wěn)定所需的水分子包圍的部分)。研究人員設(shè)計了八面體形狀的DNA折紙，該折紙具有較高的機械穩(wěn)定性，并具有較大的開放空間，可用于運載納米級貨物，多肽包裹折紙并將其置于不同的生理條件后，折紙依然能夠保持完整的結(jié)構(gòu)，而且可以為生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用添加不同的化學(xué)功能。

3 DNA折紙在生物材料及其它方面的應(yīng)用。

隨著DNA折紙技術(shù)的發(fā)展，單鏈DNA分子可以被折疊成各種不同的納米結(jié)構(gòu)。除了在靶向輸運藥物的應(yīng)用外，DNA折紙還發(fā)展成為一種潛在的生物材料。

最近有學(xué)者將血紅素修飾的富G核酸序列短鏈定點互補到三角形DNA納米結(jié)構(gòu)上，修飾血紅素的富G序列作為DNA酶，催化過氧化氫氧化苯胺分子形成苯胺自由基。自由基進(jìn)一步耦合成苯胺二聚體，連續(xù)的氧化偶聯(lián)反應(yīng)促使了聚苯胺的形成。這種合成的生物高分子聚合物有望在電子、傳感器和能源存儲等領(lǐng)域應(yīng)用［33］。另外，Zhao等［34］利用DNA折紙技術(shù)獲得長方形納米結(jié)構(gòu)，預(yù)先設(shè)計該納米結(jié)構(gòu)表面所有位點和序列以及適配體的種類、位點分布和密度，進(jìn)一步將凝血酶核酸適配體雜交組裝到納米結(jié)構(gòu)表面形成陣列。這種納米抗凝劑能夠有效識別結(jié)合凝血酶，穩(wěn)定抑制凝血酶的活性而產(chǎn)生抗凝血的效果。同時，可通過適配體互補配對鏈的加入，抑制適配體與凝血酶的結(jié)合從而能夠快速解毒并恢復(fù)凝血酶功能。研究團(tuán)隊在凝血酶/纖維蛋白原混合溶液、小鼠血漿、人血漿和小鼠活體中進(jìn)行測試，這種DNA折紙抗凝劑均顯示出其良好的抗凝性能。

有研究用DNA序列誘導(dǎo)了水凝膠的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，展示了一個生產(chǎn)沒有繁瑣電線、電池或其他約束的“軟”機器人和“智能”醫(yī)療器械的新策略［35］。他們使用了名叫“發(fā)夾”的特定DNA序列，讓1 cm尺寸的水凝膠樣品膨脹到100 cm。該反應(yīng)能被另一種名為“終結(jié)發(fā)夾”的DNA序列終止。為了控制目標(biāo)水凝膠在不同部位發(fā)生形狀變化，他們采用了一種類似于制作微型復(fù)雜芯片的攝影構(gòu)圖技術(shù)為了讓DNA對特定的操作有響應(yīng)，水凝膠的不同區(qū)域植入了不同的生物化學(xué)模式。為了確認(rèn)DNA 控制水凝膠相應(yīng)部位激活的能力，研究人員讓DNA 序列控制水凝膠“開花”。每朵“花”有兩組“花瓣”，每組被設(shè)計成只對一種DNA序列有反應(yīng)。用兩種DNA序列處理時，所有花都做出合攏“花瓣”反應(yīng)，單獨用一種DNA序列處理，則對應(yīng)的一組“花瓣”展開。該技術(shù)采用軟性材料組裝運動部件，將來可廣泛地應(yīng)用于智能材料和復(fù)雜程序執(zhí)行器等領(lǐng)域［35］。

DNA折紙最大的優(yōu)勢就是精準(zhǔn)尋址，DNA折紙結(jié)構(gòu)的精確位置上載帶熒光基團(tuán)，然后將DNA折紙結(jié)構(gòu)放置在玻璃片上。通過這種納米技術(shù)，研究人員就可以驗證高于衍射極限的分辨率［36］。在癌組織中，BRCA1和HER2之類的生物標(biāo)志物可以預(yù)示疾病的發(fā)病或發(fā)展，并且可能有助于診斷、預(yù)后和治療，基于DNA的成像探針標(biāo)記這些蛋白：抗體末端帶有一段DNA鏈（對接鏈），可以與攜帶熒光探針的DNA鏈（類似于熒光染色中的二抗）相互補。每個感興趣的生物標(biāo)志物都有自己的對接鏈，可以添加、成像或刪除DNA熒光探針。然后疊加不同生物標(biāo)志物的圖像以獲得組織的復(fù)合圖像。利用這種方式，可以同時研究多個生物標(biāo)志物，同時不損傷組織樣本。DNA納米結(jié)構(gòu)也可用于構(gòu)建用于治療或診斷的傳感器、藥物和疫苗。他們的研究目標(biāo)是制造藥物納米片：在細(xì)胞內(nèi)根據(jù)需要，使用DNA產(chǎn)生藥物的DNA折紙納米膠囊。

DNA折紙內(nèi)在納米尺度尋址能力還允許基于蛋白質(zhì)結(jié)合的隱寫術(shù)，Zhang等［37］研究了DNA折紙密碼學(xué)（DOC），利用M13病毒支架折疊成納米級自組裝的類似于子囊的模式進(jìn)行安全通信，可構(gòu)建一個超過700位的密鑰，可確保傳輸信息的完整。雖然與電子計算機相比，解密時間較長，但DOC加密技術(shù)為廣泛使用的AES系統(tǒng)提供了全面、強保護(hù)的生物分子解決方案。有學(xué)者設(shè)計了含有硫醇基團(tuán)的DNA鏈與DNA折紙模板上的延伸進(jìn)行雜交。其中硫醇基團(tuán)對金屬具有很強的親和力。組裝在DNA折紙上硫醇化的DNA鏈可以結(jié)合金屬離子，并在隨后的氧化還原反應(yīng)中形成金屬氧化物納米簇。因此金屬氧化物納米簇可以位于DNA折紙結(jié)構(gòu)的特定區(qū)域，從而在DNA折紙上實現(xiàn)金屬氧化物納米簇的定點制造，可以將這種方法推廣到任意幾何形狀和各種無機材料的圖案化，這將有助于生成復(fù)雜且精確排列的組件，以用于定制功能納米體系結(jié)構(gòu)［38］。

4 小結(jié)和展望

DNA納米技術(shù)因其具有可編程尋址性，一定的分子攜帶量和良好的生物兼容性成為多學(xué)科交叉研究的熱點。DNA折紙技術(shù)的快速發(fā)展在生物、化學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力，如可制備基于DNA折紙的各種生物材料，研究載帶有特異性藥物的納米結(jié)構(gòu)載體；將DNA納米機器按照研究人員的指令精確可控地完成各種任務(wù)；利用腫瘤標(biāo)志物、基因等各種疾病的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行早期檢查；用DNA折紙模擬病毒進(jìn)行疫苗研發(fā)，這些都是DNA折紙術(shù)獨特的優(yōu)勢。

雖然DNA納米技術(shù)發(fā)展很快，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如DNA合成的高成本，低產(chǎn)出率，目前無法做到大規(guī)模的量產(chǎn)［39］。另外一個問題是可以被附著到DNA上的材料種類比較少，研究人員還需要擴大折紙設(shè)計可以使用的材料范圍，或者更新設(shè)計程序。目前折紙最大的限制還是對自組裝過程的控制不足。隨著DNA折紙結(jié)構(gòu)越來越大，錯誤折疊的幾率會大大增加。同時需要改進(jìn)和完善折紙設(shè)計和制備的技術(shù)，以組裝更復(fù)雜的折紙納米結(jié)構(gòu)?？上驳氖亲罱侇棃F(tuán)隊描述了一種能實現(xiàn)DNA折紙結(jié)構(gòu)設(shè)計自動化的方法［40］，一種名為PERDIX（Programmed Eulerian Routing for DNA Design using X-overs）的程序能夠承擔(dān)包括三角形網(wǎng)、正方形和蜂窩狀幾何圖形等15個不規(guī)則設(shè)計對象不同形狀參數(shù)的自動序列設(shè)計。極大地加速和簡化了制作所需的形式，做到畫得出來，就做得出來。這種方法為非專家提供了容易合成復(fù)雜納米結(jié)構(gòu)的方法，有助于推動該領(lǐng)域的發(fā)展。