獐牙菜苦苷可減輕糖尿病大鼠的周圍神經(jīng)痛：基于抑制NOXS/ROS/NLRP3通路實驗

王 保，姚嘉茵，堯新華，勞俊銘，劉 棟，陳陳燕，魯 義

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510130；2中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510655

糖尿病周圍神經(jīng)痛（DPN）是1型和2型糖尿病的常見并發(fā)癥，有報道稱其發(fā)病率為13%～26%［1-2］。大部分DPN患者長期忍受慢性疼痛，甚至導(dǎo)致下肢截肢或者神經(jīng)性疼痛致殘［3-4］。目前臨床上尚無針對DPN的特效治療方法。獐牙菜苦苷是多種傳統(tǒng)中藥的活性成分，有國外研究表明獐牙菜苦苷及其衍生物具有抗糖尿病和抗高脂血癥的作用，且可以減緩病理性神經(jīng)疼痛［5］。然而，獐牙菜苦苷具體的鎮(zhèn)痛通路尚不明確。有研究表明獐牙菜苦苷可調(diào)節(jié)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白-3（NLRP3）的信號通路，而NLRP3的激活主要受還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOXs）和活性氧自由基（ROS）的調(diào)控［6］。這可能是其在治療DPN中起作用的分子靶點。本課題組前期研究結(jié)果證實，DPN患者存在炎性因子的表達(dá)失衡［7-8］。本研究擬從獐牙菜苦苷通過調(diào)節(jié)NOXS/ROS/NLRP3信號通路，恢復(fù)平衡炎性因子為切入點，揭示獐牙菜苦苷對DPN的治療作用，使其成為未來可供臨床應(yīng)用的藥物防治手段。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級Sprague-Dawley大鼠由廣州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。按照樣本含量計算公式計算得出，共需32只大鼠，雌雄各半。選擇大鼠體質(zhì)量為180～220 g。大鼠稱重后按照體質(zhì)量編寫序號1～32號，按照隨機(jī)數(shù)字表法分在4個飼養(yǎng)籠，8只/籠，分別標(biāo)記為：空白對照組、DPN模型組、獐牙菜苦苷治療組、NOXS抑制劑治療組。設(shè)定環(huán)境參數(shù)為濕度45%～55%，溫度20～26 ℃，光照12 h∶12 h，提供自由攝食和飲水。實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2020-0227。

1.2 動物模型的建立

所有大鼠在實驗中心飼養(yǎng)1 周后開始動物模型的建立。本研究采用了目前DPN動物模型中最常用的鏈脲佐菌素（STZ）法構(gòu)建大鼠模型［9］。方法如下：所有大鼠在禁食不禁水12 h后，一次性腹腔注射STZ溶液55 mg/kg（Sigma，溶于檸檬酸冷緩沖液）。操作后48 h后測定大鼠尾靜脈血糖數(shù)值,若空腹血糖>16.7 mmol/L則驗證成功。若造模不成功，則采用72 h后補(bǔ)充注射STZ溶液20 mg/kg，48 h后再次檢測血糖。全部造模成功需要的時間約1周?？瞻讓φ战M大鼠則腹腔注射相同體積的生理鹽水作安慰劑對照。

1.3 各組的干預(yù)措施

空白對照組：在造模成功后第1、7、14天分別按大鼠每公斤體質(zhì)量給予腹腔注射10 mL的生理鹽水作安慰劑對照。DPN模型組：在造模成功后第1、7、14天分別按大鼠每公斤體質(zhì)量給予腹腔注射10 mL的生理鹽水作安慰劑對照。獐牙菜苦苷治療組：造模成功后第1、7、14天分別按大鼠體質(zhì)量給予腹腔注射治療組藥物（5 mg/kg獐牙菜苦苷，陜西永源生物）。NOXS抑制劑治療組：造模成功后第1、7、14天分別按大鼠體質(zhì)量給予腹腔注射抑制劑藥物（10 mL/kg NOXS抑制劑，配置濃度為0.1 mg/mL：二苯基氯化碘鹽，DPI，MCE，Corp.USA）。給藥完畢30 min后進(jìn)行動物實驗。

實驗過程持續(xù)14 d，大鼠在麻醉下處死，迅速解剖并取出腰膨大，留取2～3 g腰膨大組織，置于-70 ℃冰箱，用于基因及蛋白水平的檢測。

1.4 觸覺過敏試驗

在造模成功后第1、7、14天觀察大鼠應(yīng)對觸覺異位性疼痛的行為。方法如下：在實驗前至少適應(yīng)這個環(huán)境20 min。將大鼠放在一個有金屬外殼的塑料籠子里，并讓他們自由移動。下方放置Von Frey細(xì)針，從0.0045到447 mg逐漸增加對大鼠腳底的刺激，使用DelloffMR［9］所改良的上下調(diào)整法，刺激大鼠足跖正下方，觀察其縮腳反應(yīng)，并詳細(xì)記錄最小能誘發(fā)其縮腿的閾值。

1.5 ELISA檢測與Western blot檢測

實驗大鼠處死后分離腰膨大組織，根據(jù)試劑盒說明書操作，采用ELISA方法定量檢測各組大鼠脊髓組織的TNF-α、IL-6、TGF-β、NOXS、ROS以及NLRP3的表達(dá)水平。采用Western blot方法檢測檢測各組大鼠脊髓組織的NOXS、ROS以及NLRP3的蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素的方差分析以及LSD法進(jìn)行組間比較，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建模結(jié)果

本研究采用STZ建模方法誘導(dǎo)DPN的首次成功率約為87.5%，二次誘導(dǎo)成功率100%。組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.32，表1）。

表1 不同組別建模過程中STZ注射次數(shù)

2.2 觸覺過敏試驗

在造模成功后第1、7、14天觀察大鼠應(yīng)對觸覺異位性疼痛的行為，結(jié)果顯示，與空白對照組比較，DPN模型組大鼠在造模后第1 天、第7 天的壓力閾值下降（P<0.001），持續(xù)至第14天（P<0.001）不能自愈。與DPN模型組比較，獐牙菜苦苷以及NOXS抑制劑干預(yù)后，能有效提高壓力閾值（第7、14天，P<0.001）。與NOXS抑制劑比較，獐牙菜苦苷治療組大鼠的壓力閾值較高（第7天，P=0.015；第14天，P=0.009，圖1）。

圖1 各組大鼠觸覺過敏試驗的比較Fig.1 Comparison of tactile hypersensitivity of the rats in each group.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs DPN group;&P<0.05 vs swer group.

2.3 各組大鼠NOXS/ROS/NLRP3通路及炎性因子的表達(dá)比較

DPN 模型組均上調(diào)NOXS（P<0.001）、ROS（P<0.001）以及NLRP3（P=0.002）表達(dá)。與DPN模型組比較，獐牙菜苦苷治療組有效下調(diào)NOXS（P<0.001）、ROS（P<0.001）以及NLRP3（P=0.002）表達(dá)；NOXS 抑制劑治療組有效下調(diào)NOXS（P=0.002）、ROS（P<0.001）以及NLRP3（P=0.003）表達(dá)。進(jìn)一步檢測炎性因子的表達(dá)水平顯示，與空白組比較，DPN模型組促炎因子TNF-α（P<0.001）以及IL-6（P=0.009）表達(dá)升高，抑炎因子TGF-β（P<0.001）表達(dá)下降。與DPN模型組比較，獐牙菜苦苷治療組促炎因子TNF-α（P=0.03）和IL-6（P=0.002）表達(dá)下降，抑炎因子TGF-β（P=0.04）表達(dá)升高；且NOXS抑制劑治療組促炎因子TNF-α（P=0.001）和IL-6（P=0.04）表達(dá)下降，抑炎因子TGF-β（P=0.006）表達(dá)升高。兩個治療組間各因子表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖2）。

圖2 各組NOXS/ROS/NLRP3通路及炎性因子的表達(dá)比較Fig.2 Expressions of NOXs,ROS,NLRP3 and inflammatory factors in each group.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs DPN group;&P<0.05 vs swer group.

2.4 各組大鼠脊髓組織的NOXS/ROS/NLRP3通路的表達(dá)比較

與空白對照組比較，DPN模型組大鼠NOXS、ROS以及NLRP3的蛋白表達(dá)水平升高（P<0.001）。與DPN模型組比較，獐牙菜苦苷組有效抑制NOXS（P<0.001）、ROS（P=0.006）以及NLRP3（P<0.001）的表達(dá)；NOXS抑制劑組有效抑制NOXS（P<0.001）、ROS（P=0.005）以及NLRP3（P<0.001）的表達(dá)。獐牙菜苦苷治療組與NOXS抑制劑治療組組間各因子的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖3）。

圖3 各組大鼠脊髓腰膨大組織的NOXS/ROS/NLRP3通路表達(dá)比較Fig.3 Expressions of NOXs,ROS,and NLRP3 in the spinal cord of rats in each group.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs DPN group;&P<0.05 vs swer group.

3 討論

本研究結(jié)果證實，獐牙菜苦苷能有效提高DPN大鼠觸覺過敏壓力閾值，減少觸覺過敏，有效保護(hù)神經(jīng)。DPN模型組促炎因子表達(dá)升高，抑炎因子表達(dá)下降。獐牙菜苦苷治療組和NOXS抑制劑治療組促炎因子表達(dá)低于DPN 模型組，抑炎因子表達(dá)則高于DPN 模型組。本研究結(jié)果提示，獐牙菜苦苷和NOXS抑制劑均有效下調(diào)促炎因子，上調(diào)抑炎因子，維持炎性因子平衡。

獐牙菜苦苷是多種龍膽科草藥的主要活性成分之一［10-11］。有研究證實，獐牙菜苦苷與槲皮素合用對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠高血糖、高脂血癥和氧化應(yīng)激具有顯著的治療作用［12］。有研究認(rèn)為，獐牙菜苦苷通過激活A(yù)MPK，從而恢復(fù)肝細(xì)胞的胰島素敏感性，可改善2型糖尿病患者的胰島素抵抗效應(yīng)［13］。有文獻(xiàn)通過對獐牙菜苦苷及其衍生物的體外、體內(nèi)研究，揭示了獐牙菜苦苷及其衍生物具有抗糖尿病和抗高脂血癥的作用［14］。目前，國內(nèi)學(xué)者對獐牙菜苦苷的藥用研究主要集中在抗炎、護(hù)肝、祛風(fēng)止痛等方面［15-17］。而本研究結(jié)果證實，獐牙菜苦苷能有效提高DPN大鼠觸覺過敏壓力閾值，提示獐牙菜苦苷可以減少觸覺過敏，有效保護(hù)神經(jīng)。該結(jié)果與國外其他學(xué)者結(jié)果類似［18］。本研究結(jié)果表明獐牙菜苦苷存在鎮(zhèn)痛作用靶點，有望今后成為治療DPN的藥物。

DPN是由高血糖引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)引起的神經(jīng)組織損傷，這一損傷會過度產(chǎn)ROS以及NLRP3炎癥小體，觸發(fā)糖尿病炎癥反應(yīng)［19-20］。有研究證實，雷公藤多甙通過降低NOXs/ROS/NLRP3信號通路中促炎因子的表達(dá)，對潰瘍性結(jié)腸炎具有抗炎作用［21］。有研究評價了羅根寧對高糖（25 mm）誘導(dǎo)的大鼠雪旺細(xì)胞系RSC96損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)羅根寧的抗氧化作用通過抑制ROS的產(chǎn)生和抑制NLRP3炎癥小體的激活來防止RSC96雪旺細(xì)胞的凋亡［22］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)由ROS刺激生成的NLRP3，介導(dǎo)下游的促炎反應(yīng)，從而加重慢性炎癥反應(yīng)對神經(jīng)的損傷作用［23］。也有研究表明，外周神經(jīng)受炎性因子的浸潤，慢性炎癥反應(yīng)的存在極大影響正常神經(jīng)功能的發(fā)揮［24-26］。在炎癥狀態(tài)下，促炎因子比如IL-6，IL-1以及TNF-α的級聯(lián)釋放，激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，膠質(zhì)細(xì)胞本身表達(dá)這些促炎因子的受體，并且參與炎癥的免疫反應(yīng)。其次，促炎因子相互存在協(xié)同作用，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥的瀑布樣反應(yīng)。最后，釋放性P物質(zhì)以及興奮性氨基酸持續(xù)釋放，使背角神經(jīng)元去極化，導(dǎo)致痛覺敏感以及持續(xù)性疼痛［27-30］。因此，本研究擬從與炎癥反應(yīng)息息相關(guān)的NOXS/ROS/NLRP3信號通路進(jìn)一步明確獐芽菜苦苷影響炎癥反應(yīng)的具體分子機(jī)制。本課題組前期研究結(jié)果證實，DPN大鼠存在炎性因子表達(dá)失衡，表現(xiàn)為促炎因子TNF-α，IL-6和IL-8表達(dá)水平升高，抑炎因子IL-10和TGF-?表達(dá)下降，而獐芽菜苦苷通過抑制促炎因子，促進(jìn)抑炎因子的表達(dá)，糾正炎性因子失衡，治療DPN大鼠［7-8］。本研究結(jié)果顯示，獐牙菜苦苷有效抑制NOXS、ROS以及NLRP3的表達(dá)，同時顯著降低DPN大鼠促炎因子TNF-α、IL-6水平，提高抑炎因子TGF-β水平。本研究進(jìn)一步通過獐芽菜苦苷與NOXs抑制劑治療DPN大鼠的效果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者之間治療效果相仿。本研究證實獐牙菜苦苷通過降低DPN大鼠脊髓組織的NOXS、ROS以及NLRP3的表達(dá)水平，來抑制NOXS/ROS/NLRP3炎性級聯(lián)反應(yīng)的信號通路，維持炎性因子平衡，提高痛閾，營養(yǎng)神經(jīng)，達(dá)到治療DPN的目的。

本研究存在一定的局限性，研究獐牙菜苦苷對于NOXS/ROS/NLRP3信號通路的影響僅在動物實驗水平得到驗證，尚需對離體細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步實驗。值得一提的是，盡管結(jié)果表明在對于NOXS/ROS/NLRP3信號通路的影響上獐牙菜苦苷與NOXS抑制劑治療的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是觸覺過敏試驗結(jié)果顯示獐牙菜苦苷似乎在提高DPN痛覺壓力閾值方面優(yōu)于NOXS抑制劑。我們需進(jìn)一步探索在等效藥效的基礎(chǔ)上比較二者的真正優(yōu)劣，并研究相關(guān)機(jī)制，為DPN患者提供積極有效的防治以及低毒無害的藥物新靶點。