肉桂抗病毒有效部位總糖測(cè)定及單糖組成分析

李 瀅，王 麗，郭明里*，李 寧，*，王懷友，張建文，楊兆祥

(1.昆藥集團(tuán)股份有限公司，云南 昆明 650100；2.香港科技大學(xué)深圳研究院 中藥研發(fā)中心，廣東 深圳 518057)

中藥肉桂是樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干燥樹皮，能補(bǔ)火助陽，引火歸元，散寒止痛，溫通經(jīng)脈[1]。肉桂是我國大宗常用中藥材，同時(shí)也是世界聞名的著名香料植物，廣泛應(yīng)用于食品飲料、日用化妝品、香料工業(yè)[2]。因此從肉桂中尋求具有醫(yī)藥保健作用的活性分子及分子群不僅是中醫(yī)藥領(lǐng)域的熱點(diǎn)，同時(shí)也是一個(gè)世界性的研究課題。

在中醫(yī)藥傳統(tǒng)用法中，肉桂單方用于抗病毒治療的報(bào)道不多見。但近年來國外學(xué)者報(bào)道肉桂的水溶性提取物具有顯著的抗病毒活性[3-4]。該研究引起了我們的關(guān)注，我們通過以抗病毒活性為指導(dǎo)的追蹤分離，獲得了肉桂水溶性抗病毒有效部位KPC-rg1[5]。經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證，其抗病毒活性穩(wěn)定且較國外學(xué)者獲得的有效部位活性更高。KPC-rg1不但可用于各類皰疹病毒感染外用治療性藥物的開發(fā)，還有望用于包膜類病毒滅活疫苗的制備[5-6]。

KPC-rg1的化學(xué)結(jié)構(gòu)目前尚不清晰。我們認(rèn)為KPC-rg1是一類水溶性的酚性色素，由多酚及糖類物質(zhì)經(jīng)氧化聚合反應(yīng)而形成，是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的異質(zhì)的酚性化合物的總稱。KPC-rg1兼有鞣質(zhì)和糖類的部分理化性質(zhì)[5]。目前尚無法從中分得單體化合物并鑒定結(jié)構(gòu)。為逐步揭示其化學(xué)本質(zhì)，并尋求其質(zhì)量控制手段，我們進(jìn)行了多方面的研究。采用中紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)研究其指紋圖譜，基于整體性和模糊性表征其宏觀化學(xué)信息[7]。采用磷鉬鎢酸-干酪素法測(cè)定其中鞣質(zhì)和酚性成分的含量[8]。本文從糖化學(xué)的角度，采用硫酸-苯酚比色法建立KPC-rg1總糖的含量測(cè)定方法。進(jìn)而采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化法對(duì)KPC-rg1進(jìn)行單糖組成分析，明確其單糖種類和組成比例，并獲得特征圖譜。本研究為KPC-rg1的進(jìn)一步研究、開發(fā)和綜合利用提供技術(shù)手段并奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，以期形成具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的中藥、天然創(chuàng)新藥物，為中藥復(fù)雜體系有效部位新藥開發(fā)提供參考。

1 儀器、材料與試劑

1.1 儀器

安捷倫1260高效液相色譜儀(包括在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD檢測(cè)器)(美國Agilent公司)；UV-2450紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；5510E-DTH超聲儀(美國必能信公司)；Milli-Q超純水機(jī)(Millipore公司)；CP225D電子分析天平(賽多利斯公司)。

1.2 材料與試劑

肉桂抗病毒有效部位(KPC-rg1)(批號(hào)：20150626，20151201，20160425)由昆藥集團(tuán)股份有限公司提供，制備工藝同文獻(xiàn)[5-7]。阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸對(duì)照品購自Alfa Aesar公司。鼠李糖對(duì)照品購自TCI公司。艾杜糖醛酸對(duì)照品購自Carbosynth公司。巖藻糖、半乳糖醛酸對(duì)照品及1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)購自Sigma-Aldrich公司。乙腈為色譜純，購自德國默克股份兩合公司。水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 苯酚-硫酸分光光度法測(cè)定總糖含量

2.1.1 溶液制備 苯酚溶液：精密稱取苯酚適量，加水配成濃度為5%的溶液，即得，置于冰箱中備用(現(xiàn)用現(xiàn)配)。葡萄糖對(duì)照品溶液：精密稱取葡萄糖對(duì)照品適量，加水配成每1 mL含0.10 mg的溶液，即得。供試品溶液：精密稱取KPC-rg1適量，加水配成每1 mL含0.28 mg的溶液，即得。

2.1.2 檢測(cè)波長選擇 精密吸取供試品和葡萄糖對(duì)照品溶液各1 mL，分別置于20 mL具塞刻度試管中，分別精密加入1 mL水，1 mL 5%苯酚溶液，室溫下快速精密加入5 mL濃硫酸，冷卻10 min，混勻后放置20 min。另取1 mL水同上操作制得空白溶液。紫外-可見分光光度計(jì)于波長400～600 nm范圍進(jìn)行掃描。供試品溶液和對(duì)照品溶液均在490 nm波長處有最大吸收，且無其它干擾峰影響分析，故選擇490 nm作為檢測(cè)波長。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1 mL、1.2 mL、1.4 mL，分別置于20 mL具塞刻度試管中，精密加水至2.0 mL，精密加入1 mL 5%苯酚溶液，室溫下快速精密加入5 mL濃硫酸，冷卻10 min，混勻后放置20 min。另取相應(yīng)體積的水同上操作制得相應(yīng)的空白溶液。紫外-可見分光光度計(jì)于490 nm波長處下測(cè)定吸光度，每份測(cè)兩次，計(jì)算平均值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)X，吸光度為縱坐標(biāo)Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=53.059X-0.021 2，r=0.999 8。結(jié)果表明在0.005 0～0.017 5 mg·mL-1范圍內(nèi)，濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液1 mL置于20 mL具塞刻度試管中，按“2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制”項(xiàng)下的方法，自“精密加水至2.0 mL”起，依法操作并測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)6次，RSD為0.15%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液1 mL置于20 mL具塞刻度試管中，按“2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制”項(xiàng)下的方法，自“精密加水至2.0 mL”起，依法操作并測(cè)定吸光度，RSD為0.98%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液1 mL置于20 mL具塞刻度試管中，按“2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制”項(xiàng)下的方法，自“精密加水至2.0 mL”起，依法操作，于0、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min測(cè)定吸光度，吸光度RSD為1.53%，結(jié)果表明溶液于60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知含量的同一批號(hào)樣品9份，每份14 mg，分別置于100 mL容量瓶中。分3組，每組3份，各分別加入50%、100%和150%的葡萄糖對(duì)照品，加水定容至刻度，搖勻，制得9份加樣回收供試品溶液。分別精密吸取加樣回收供試品溶液1 mL置于20 mL具塞刻度試管中，按“2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制”項(xiàng)下的方法，自“精密加水至2.0 mL”起，依法測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，平均回收率為99.25%，RSD為1.45%。結(jié)果表明本方法加樣回收率良好。

2.1.8 樣品含量測(cè)定 取3批樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液1 mL置于20 mL具塞刻度試管中，按“2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制”項(xiàng)下的方法，自“精密加水至2.0 mL”起，依法測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各批次樣品中的總糖含量，批號(hào)20150626、20151201、20160425樣品的總糖含量分別為36.12%、39.23%和41.66%，平均值為39.00%。

2.2 PMP柱前衍生化法分析單糖組成

2.2.1 溶液制備 單糖對(duì)照品溶液：分別精密稱取各單糖對(duì)照品適量，加水配成每1 mL含1.0 mg的溶液，使用時(shí)按需要以水稀釋或混合配成單標(biāo)或混合對(duì)照品溶液。

KPC-rg1樣品酸水解及PMP衍生化：精密稱取KPC-rg1適量，加水配成每1 mL含2.0 mg的溶液。精密量取該溶液300μL至5 mL具塞試管中，加入4 mol·L-1三氟乙酸300μL，充N2，封管，110 ℃水解4 h。水解液置70 μC水浴鍋中蒸干，蒸干過程中加入甲醇適量以除去水解液中的三氟乙酸。蒸干后的樣品加水50μL溶解，加入0.6 mol·L-1NaOH溶液50μL和0.5 mol·L-1PMP甲醇溶液100μL，渦旋混勻。置70 ℃烘箱反應(yīng)60 min，取出室溫放置10 min，加入0.3 mol·L-1HCl 100μL中和，加入三氯甲烷500 μL萃取3次，小心棄去氯仿層，上清液加水定容至1 mL。

單糖對(duì)照品的PMP衍生化：精密量取標(biāo)準(zhǔn)單糖對(duì)照品溶液50μL，不進(jìn)行酸水解，PMP衍生化方法與樣品一致，自“加入0.6 mol·L-1NaOH溶液50μL和0.5 mol·L-1PMP甲醇溶液100μL”開始如法操作。

2.2.2 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5μm)；以0.1 mol·L-1乙酸銨(pH=5.5)緩沖液-乙腈(85∶15)為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫；流速1 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長250 nm；進(jìn)樣量20μL。該色譜條件下，單糖混合對(duì)照品和樣品PMP衍生物的HPLC見圖1。

注：1：PMP；2：甘露糖；3：鼠李糖；4：葡萄糖醛酸；5：艾杜糖醛酸；6：半乳糖醛酸；7：葡萄糖；8：半乳糖；9：阿拉伯糖；10：巖藻糖。圖1 樣品PMP衍生物(A)和單糖混合對(duì)照品(B)的HPLC圖

2.2.3 線性關(guān)系考察 對(duì)照?qǐng)D1單糖混合對(duì)照品和樣品PMP衍生物色譜圖中主要色譜峰的保留時(shí)間，確定KPC-rg1中的單糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖5種單糖組成。故針對(duì)該5種單糖進(jìn)行方法學(xué)考察。

分別取甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下的規(guī)定衍生化，以水逐級(jí)稀釋成一系列不同濃度的工作液，按“2.2.2”項(xiàng)下的規(guī)定進(jìn)樣分析，以濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y繪制工作曲線，計(jì)算回歸方程。結(jié)果見表1，各單糖在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 5種單糖的線性關(guān)系

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取KPC-rg1樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下的規(guī)定衍生化，按“2.2.2”項(xiàng)下的規(guī)定連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的峰面積RSD為0.21%～0.55%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)KPC-rg1樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下的規(guī)定平行制備6份衍生化樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下的規(guī)定進(jìn)樣分析，記錄峰面積。甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的峰面積RSD為0.87～1.93%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取KPC-rg1樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下的規(guī)定衍生化，分別于0、2、4、6、8、12 h按“2.2.2”項(xiàng)下的規(guī)定進(jìn)樣分析，記錄峰面積。甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的峰面積RSD為0.90%～1.89%，表明樣品于12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知含量的同一批號(hào)樣品6份，每份25 mg，分別置于25 mL容量瓶中，各分別加入100%的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖對(duì)照品，加水定容至刻度，搖勻，制得6份加樣回收供試品溶液。分別按“2.2.1”項(xiàng)下的規(guī)定衍生化，按“2.2.2”項(xiàng)下的規(guī)定進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率，甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的平均回收率為96.04%～101.35%，RSD為1.42%～1.97%，表明方法加樣回收率良好。

2.2.8 樣品單糖組成分析 取KPC-rg1樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下的規(guī)定衍生化，按“2.2.2”項(xiàng)下的規(guī)定進(jìn)樣分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組成單糖含量。根據(jù)公式n=m/M(n為單糖摩爾數(shù)，m為單糖質(zhì)量，M為單糖摩爾質(zhì)量)，計(jì)算各組成單糖的摩爾比例，甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖比例為0.14∶0.28∶0.38∶1∶0.92。

3 討論

KPC-rg1優(yōu)秀的抗病毒活性和廣闊的應(yīng)用前景推動(dòng)我們對(duì)其進(jìn)行持續(xù)的研究開發(fā)。物質(zhì)基礎(chǔ)不明確是制約其成藥性的關(guān)鍵問題。本課題組前期曾采用多種分離手段(包括硅膠、十八烷基鍵合硅膠、Sephadex LH-20等)嘗試對(duì)KPC-rg1進(jìn)行分離，但均未能獲得單體化合物。隨著研究的逐漸深入，我們認(rèn)為KPC-rg1是一類水溶性、分子量不均一、復(fù)雜的天然多聚物，具有酚類和糖類的結(jié)構(gòu)片段，經(jīng)氧化、聚合、耦合等作用形成。類似的化合物在自然界廣泛存在，較為著名的如茶褐素。茶褐素是普洱茶等黑茶中含有的水溶性高聚色素，顏色為棕褐色或棕紅色，在普洱干茶中的含量可達(dá)12%，是構(gòu)成黑茶品質(zhì)特征的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[9-10]。但由于結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，有關(guān)其分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定的研究至今仍處于探索中。該類復(fù)雜天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為其質(zhì)量控制提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。為此我們嘗試針對(duì)其物理化學(xué)特征，從多個(gè)角度對(duì)其進(jìn)行多維的表征。本研究針對(duì)其糖類結(jié)構(gòu)片段進(jìn)行了探索性研究。

苯酚-硫酸比色法是總糖含量測(cè)定的經(jīng)典方法，該方法具有顯色穩(wěn)定、靈敏度較高、受其他碳水化合物和蛋白質(zhì)干擾較小等優(yōu)勢(shì)，在中藥、天然藥物領(lǐng)域應(yīng)用范圍較為廣泛[11-13]。本研究在方法建立過程中，針對(duì)KPC-rg1的特點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了細(xì)致的調(diào)整與優(yōu)化，包括：苯酚濃度、苯酚用量、濃硫酸用量、濃硫酸加入方式、顯色溫度和時(shí)間等，從而確定了最適合的實(shí)驗(yàn)條件。本研究以葡糖糖為對(duì)照品對(duì)樣品總糖含量進(jìn)行測(cè)定。以葡糖糖計(jì)，3批KPC-rg1總糖含量的平均值為39.00%。作為測(cè)量值，因未考慮各個(gè)單糖的校正因子，該含量并非樣品中糖類物質(zhì)的真實(shí)含量，但可作為含量指標(biāo)初步評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量和一致性。

單糖組成分析是糖類結(jié)構(gòu)表征和解析的重要手段。因糖大多沒有發(fā)色團(tuán)，單糖結(jié)構(gòu)相近且極性較強(qiáng)，難以滿足高靈敏度分析手段的檢測(cè)要求。PMP衍生化方法可使糖類在245 nm處產(chǎn)生強(qiáng)烈的紫外吸收，條件較溫和，無需酸催化劑，且產(chǎn)物無唾液酸異構(gòu)，是較理想的衍生化方法[14，15]。本研究采用HPLC對(duì)PMP衍生產(chǎn)物進(jìn)行分析檢測(cè)，明確單糖種類和組成比例，并獲得特征圖譜。該方法在苯酚-硫酸比色法測(cè)定總糖含量的基礎(chǔ)上，為KPC-rg1的質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制提供了更為精準(zhǔn)的技術(shù)手段，并從糖化學(xué)的角度對(duì)KPC-rg1的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了探索。

4 結(jié)論

本研究建立了肉桂抗病毒有效部位KPC-rg1總糖測(cè)定及單糖組成分析方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法簡便、快速、準(zhǔn)確、可靠，可用于KPC-rg1的質(zhì)量控制，為其進(jìn)一步研究、開發(fā)和綜合利用提供技術(shù)手段并奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為中藥復(fù)雜體系有效部位新藥開發(fā)提供了參考。