嶺南中藥三椏苦生物堿及其抗腫瘤活性研究

褚晨亮，王馨晨，鄭 靜，路 寬，黃 函，覃 亮

(1.肇慶學院 食品與制藥工程學院，廣東 肇慶 526061；2.東北林業(yè)大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.肇慶學院 教學評估與督導中心，廣東 肇慶 526061)

三椏苦Melicopeptelefolia(Champ.ex Benth) Hartley是蕓香科蜜茱萸屬植物，又稱三丫苦、三叉苦、三枝槍等，始載于《嶺南采藥錄》，具有清熱解毒、祛風除濕的功效，臨床上用于多種疾病的治療[1]。以三椏苦藥材為主藥，開發(fā)了三九胃泰、三九感冒靈等中成藥。三椏苦藥材主要含有揮發(fā)油和生物堿[2]，生物堿類化合物具有抗腫瘤活性[3-6]，文獻報道從三椏苦藥材中分離得到多種生物堿[7]，但是目前對其抗腫瘤活性及其機制的研究較少，為進一步研究三椏苦生物堿類成分，闡述其抗腫瘤活性機制，本實驗利用生物堿富集方法，從三椏苦莖的乙醇提取物中富集、初步分離得到8個生物堿，鑒定為吳茱萸春堿、茵芋堿、香草木寧堿、白鮮堿、4-dihydro-3-hydroxy-5-methoxy-2，2-dimethy pyrano(2，3-b) quinoline、4-methoxy-2(1H)-quinolinone、R-(+)-platydesmin、7-羥基白鮮堿，以人肝癌細胞HepG-2、胃癌細胞BGC為研究對象，采用CCK-8法分別進行體外抗腫瘤活性篩選，并利用分子對接技術闡述具有體外抗腫瘤活性的生物堿類成分抗腫瘤機制，這有利于闡明其有效成分，為醫(yī)藥企業(yè)對該藥材進行深入開發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

旋轉蒸發(fā)儀RE-2000(上海亞榮儀器有限公司)，NMR(Bruker 400 ASCENDTM)。乙酸乙酯、乙醇(95%)、二氯甲烷、氯仿、甲醇(均為分析醇，購自天津富宇精細化工有限公司)，硅膠(青島海洋化工廠)，ODS柱色譜填料(Merck，德國)，Sephadex LH-20 柱(Pharmacia Biotech AB，Uppsala，瑞士)，肝癌細胞HepG-2、胃癌細胞BGC(廣東省中醫(yī)科學研究院)，DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，胎牛血清(FBS，Hyclone，美國)，TransDetect Cell Counting Kit(CCK)，貨號：FC101-04，北京全式金生物科技有限公司。喜樹堿為陽性對照品(CDGO-100532，中國藥品生物制品檢定所)。

三椏苦于2019年6月采集于肇慶鼎湖山。原植物經(jīng)廣東藥科大學劉基柱教授鑒定為蕓香科蜜茱萸屬植物三椏苦，保存在肇慶學院理工樓C608室(SYK-0618)。

2 實驗方法

2.1 提取和分離

取干燥的三椏苦莖枝粗粉30 kg，用95%乙醇冷浸提取3次(120 L×3)，每次提取2 d，合并提取液，減壓濃縮，揮干剩余溶劑，得到乙醇提取物(2.6 kg)。三椏苦乙醇提取物(2.6 kg)用5%HCl水溶液捏溶，過濾，濾液用濃氨水調節(jié)pH=10，氯仿萃取6次，合并萃取液，濃縮，得粗生物堿1(79.0)g；堿水層繼續(xù)用NaOH調節(jié)pH=13，用氯仿萃取6次，合并萃取液，濃縮，得粗生物堿2(4.5 g)，根據(jù)薄層色譜結果將粗生物堿1和粗生物堿2合并，得粗生物堿(83.5 g)。

取粗生物堿(80.0 g)，3.5 g留樣，經(jīng)硅膠(100～200目)柱色譜分離，二氯甲烷：乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脫，得到18個流分(Fr.1～18)，F(xiàn)r.2(2.5 g) 經(jīng)硅膠(200～300目)柱色譜分離，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脫，得到6個流分(Fr.2.1～2.6)，F(xiàn)r.2.2(32.5 mg)經(jīng)葡聚糖凝膠色譜純化，得到化合物1(20.2 mg)；Fr.2.3(102.5 mg))經(jīng)硅膠(300～400目)柱色譜分離，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脫，得到化合2(22.5 mg)；Fr.2.5(152.3 mg)經(jīng)硅膠(300～400目)柱色譜分離，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脫，得到5個流份(Fr.2.5.1～2.5.5)，F(xiàn)r.2.5.3(19.5 mg)經(jīng) Rp-18(MeOH∶H2O 70∶30)純化，得到化合物3(14.6 mg)；Fr.2.5.5(39.5 mg))經(jīng)sephadexLH-20(CHCl3∶MeOH 30∶70))純化，得到化合物4(15.3 mg)；Fr.3(4.2 g) 經(jīng)硅膠(200～300目)柱色譜分離，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脫，得到10個流份(Fr.3.1～3.10)，F(xiàn)r.3.7(202.3 mg))經(jīng)硅膠(300～400目)柱色譜分離，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脫，得到6個流份(Fr.3.7.1～3.7.3)，F(xiàn)r.3.7.4(40.4 mg))經(jīng) Rp-18(MeOH∶H2O 60∶40)純化，得到化合物5(28.6 mg)；Fr.3.7.6(15.8 mg) 經(jīng) Rp-18(MeOH∶H2O 60∶40)純化，得到化合物6(9.6 mg)；Fr.4(3.5g)經(jīng)硅膠(200～300目)柱色譜分離，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脫，得到7個流份(Fr.4.1～4.7)，F(xiàn)r.4.5(72.5 mg)經(jīng)硅膠(300～400目)柱色譜分離，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脫，得到3個流份(Fr.4.5.1～4.5.3)，F(xiàn)r.4.5.3(18.4 mg)經(jīng) Rp-4-18(MeOH∶H2O 60∶40)純化，得到化合物7(10.5 mg)；Fr.4.7(23.8 mg) 經(jīng) Rp-18(MeOH∶H2O 60∶40)純化，得到化合物8(11.5 mg)。

2.2 體外抗腫瘤活性篩選

利用CCK-8法體外測定8個生物堿對肝癌細胞HepG-2、胃癌細胞BGC的抑制率。肝癌細胞HepG-2、胃癌細胞BGC分別用1640培養(yǎng)基(加10%胎牛血清、100μg·L-1青霉素和100μg·L-1鏈霉素)培養(yǎng)于5%CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱。在96孔板中接種100μL的細胞懸液(每孔2×103個細胞)，根據(jù)實驗需求在37度、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24 h。加入不同濃度(5、12.5、25、50、100μm/L)的化合物(1～8)處理細胞，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，每孔中加入11μL的CCK 溶液，在二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標儀測定450 nm處的OD，重復6次，記錄OD值并計算各待測化合物的抑制率，利用SPSS軟件計算IC50，設計細胞對照和培養(yǎng)基本底對照。

2.3 抗腫瘤機制研究

文獻研究表明，能夠誘導肝癌細胞、胃癌細胞凋亡的途徑包括死亡受體途徑、線粒體途徑、阻滯細胞周期途徑等[8]，本實驗通過查閱與這兩個腫瘤細胞凋亡途徑有關的蛋白靶點，明確肝癌細胞HepG-2、胃癌細胞BGC相關分子對接的靶點，即Caspase-3，VEGF-2，MMP-9，CDK四個靶點，以四個靶點分別對接8個化合物來進行抗腫瘤機制研究。

3 結果

3.1 結構鑒定

化合物1：白色針晶(CHCl3)。1H-NMR(400 MHz，CDCl3) δ：7.52(1H，d，J=2.9Hz，H-2)，7.01(1H，d，J=3 Hz，H-3)，4.40(3H，s，4-OMe)，3.93(3H，s，7-OMe)，8.12(1H，d，J=9.1 Hz，H-5)、δ7.06(1H，dd，J=9.1，2.3 Hz，H-6)、δ7.31(1H，d，J=2.3 Hz，H-8)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：164.6(C-8b)，161.0(C-7)，156.8(C-4)，147.6(C-8a)，142.5(C-2)，123.6(C-5)，116.8(C-6)，113.5(C-4a)，106.0(C-8)，105.0(C-3)，101.9(C-3a)，58.8(4-OMe)，55.3(7-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道數(shù)據(jù)一致[9]，故鑒定化合物1為吳茱萸春堿。

化合物2：淡黃色針晶(CHCl3)。1H-NMR(400 MHz，CDCl3) δ：7.53(1H，d，J=2.7 Hz，H-2)，δ7.00(1H，d，J=2.7 Hz，H-3)，4.39(3H，s，4-OMe)，4.00(3H，s，7-OMe)，4.07(3H，s，8-OMe)，7.96(1H，d，J=9.2 Hz，H-5)，7.20(1H，d，J=9.2 Hz，H-6)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)，δ：164.0(C-8b)，157.2(C-4)，152.2(C-8)，143.1(C-2)，142.0(C-7)，141.6(C-8a)，118.2(C-5)，115.0(C-4a)，112.2(C-6)，104.5(C-3)，102.0(C-3a)，61.6(8-OMe)，59.0(4-OMe)，56.9(7-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道數(shù)據(jù)一致[10]，故鑒定化合物2為茵芋堿。

化合物3：淡黃色針晶(CHCl3)。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.51(1H，d，J=2.6 Hz，H-2)，δ7.01(1H，d，J=2.6 Hz，H-3)，4.39(3H，s，4-OMe)，3.99(3H，s，6-OMe)，3.99(3H，s，7-OMe)，7.40(1H，s，H-5)、7.29(1H，s，H-8)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：163.1(C-8b)，155.6(C-4)，152.7(C-7)，147.7(C-6)，142.6(C-8a)，142.5(C-2)，113.0(C-4a)，106.6(C-8)，104.7(C-3)，102.3(C-3a)，100.3(C-5)，58.6(4-OMe)，56.0(6-OMe)，56.0(7-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道數(shù)據(jù)一致[10]，故鑒定化合物3為香草木寧堿。

化合物4：淺黃色粒狀結晶(CHCl3)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.61(1H，d，J=2.7 Hz，H-2)，δ7.05(1H，d，J=2.7 Hz，H-3)，4.43(3H，s，4-OMe)，8.25(1H，d，J=8.5 Hz，H-5)，7.45(1H，t J=7.6 Hz，H-6)，7.66(1H，t J=7.6 Hz，H-7)，8.01(1H，d，J=8.5 Hz，H-8)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3))δ：164.1(C-8b)，157.0(C-4)，145.9(C-8a)，143.8(C-2)，129.9(C-7)，128.0(C-8)，124.0(C-6)，122.5(C-5)，119.0(C-3a)，105.0(C-3)，103.5(C-4a)，59.3(4-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道數(shù)據(jù)一致[11]，故鑒定化合物4為白鮮堿。

化合物5：白色針晶(CHCl3)。1H-NMR(400 MHz，CDCl3) δ：7.68(1H，d，J=8.5 Hz，H-6)，7.40(1H，t，J=7.5 Hz，H-7)，7.62(1H，t，J=7.5 Hz，H-8)，7.98(1H，d，J=8.4 Hz，H-9)，4.05(s，3H，5-OMe)，3.90(1H，dd，J=6.5，5.0 Hz，H-3)，3.21(1H，dd，J=5.0，17.2 Hz，H-4β)，2.96(1H，dd，J=17.2，6.5 Hz，H-4α)，1.45(s，3H，2-Me)，1.47(s，3H，2-Me)13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：79.0(C-2)，68.5(C-3)，26.6(C-4)，108.5(C-4a)，160.8(C-5)，120.5(C-5a)，125.4(C-6)，123.8(C-7)，123.0(C-8)，121.0(C-9)，146.5(C-9a)，164.0(C-10a)，21.5(2-Me)，25.0(2-Me)，61.2(5-OMe)以上數(shù)據(jù)與文獻報道數(shù)據(jù)一致[12]，故鑒定化合物5為4-dihydro-3-hydroxy-5-methoxy-2，2-dimethy pyrano(2，3-b) quinoline。

化合物6：淺黃色針晶(CHCl3)。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.87(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，7.22(1H，m，H-6)，7.47(1H，m，H-7)，7.67(1H，d，J=8.5 Hz，H-8)，3.52(1H，dd，J=16.5，7.1 Hz，10α-H)，3.69(1H，dd，J=7.1，16.5 Hz，10β-H))，4.61(1H，t，J=7.1Hz，H-11)，4.16(3H，s，4-OMe)，1.28(3H，s，13-Me)，1.49(3H，s，14-Me)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：147.5(C-1)，168.7(C-2)，102.1(C-3)，159.0(C-4)，122.0(C-5)，123.5(C-6)，123.0(C-7)，127.1(C-8)，120.3(C-9)，29.3(C-10)，86.7(C-11)，71.6(C-12)，58.5(4-OMe)，24.7(13-Me)，26.2(14-Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道數(shù)據(jù)一致[13]，故鑒定化合物6為R-(+)-Platydesmin。

化合物7：淺灰色針晶(MeOH)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6) δ：11.40(1H，s，N-H)，5.99(1H，s，H-3)，7.31(1H，d，J=8.5 Hz，H-5)，7.18(1H，t，J=7.7 Hz，H-6)，7.51(1H，t，J=7.7 Hz，H-7)，7.82(1H，d，J=8.5Hz，H-8)，3.95(3H，s，4-OMe)。13C-NMR(100 MHz， DMSO-d6) δ：164.0(C-2)，163.0(C-4)，138.9(C-8a)，131.2(C-7)，122.7(C-5)，122.0(C-6)，115.8(C-4a)，115.0(C-8)，96.8(C-3)，56.5(4-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道數(shù)據(jù)一致[14]，故鑒定化合物7為4-methoxy-2(1H)-quinolinone。

化合物8：淡黃色粒晶(MeOH)。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6) δ：10.09(1H，s，7-OH)，7.89(1H，d，J=2.6 Hz，H-2)，δ7.36(1H，d，J=2.6 Hz，H-3)，4.37(3H，s，4-OMe)，8.02(1H，d，J=9.1Hz，H-5)，7.02(1H，dd，J=9.1，1.7 Hz，H-6)，7.09(1H，d，J=1.7Hz，H-8)；13C-NMR(100MHz，DMSO-d6) δ：143.0(C-2)，105.4(C-3)，101.5(C-3a)，158.5(C-4)，112.2(C-4a)，123.8(C-5)，116.6(C-6)，156.8(C-7)，109.0(C-8)，147.3(C-8a)，164.2(C-8b)，59.5(4-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道數(shù)據(jù)一致[15]，故鑒定化合物8為7-羥基白鮮堿。

3.2 抗腫瘤活性篩選

利用CCK-8法體外測試8個生物堿類成分對肝癌細胞HepG-2、胃癌細胞BGC的抑制活性，以喜樹堿作為陽性對照藥品，結果(表1)表明：R-(+)-Platydesmin、4-dihydro-3-hydroxy-5-methoxy-2，2-dimethy pyrano(2，3-b) quinoline對肝癌細胞HepG-2具有較高的抑制活性，IC50值分別為26.4 μM、23.6 μM；對胃癌細胞BGC也具有較高的抑制活性，IC50值分別為21.8 μM、24.2 μM；白鮮堿、7-羥基白鮮堿對肝癌細胞HepG-2、胃癌細胞BGC均表現(xiàn)出了抑制活性，IC50值分別為42.3 μM、40.9 μM、48.6 μM、47.5 μM，其他生物堿對這兩種腫瘤細胞的抑制率不明顯。

表1 化合物1～8對肝癌細胞HepG-2和胃癌細胞BGC的抑制活性

3.3 抗腫瘤機制研究

與細胞周期有著密切關系的調控基因能否正常有序表達，決定著細胞周期能否正常運轉，其調控與細胞周期蛋白(Cyc-lin)、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CDKI)、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDK))也關系緊密，三者通常以CDK 為核心，Cyclin 對其具有正調控作用，CDKI 對其具有負調控作用。通過分子對接技術研究發(fā)現(xiàn)R-(+)-platydesmin和4-dihydro-3-hydroxy-5-methoxy-2，2-dimethy pyrano(2，3-b) quinoline可能與細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDK)存在相互作用，見圖1、圖2，表明這兩個生物堿可能是通過抑制細胞周期調控蛋白表達、阻滯細胞周期來抑制肝癌細胞HepG-2、胃癌細胞BGC細胞的增殖。通過體外活性研究實驗，證實這兩個生物堿對肝癌細胞HepG-2、胃癌細胞BGC均具有較高的抑制活性，說明這兩個生物堿能夠抑制這兩種腫瘤細胞活性，誘導其凋亡，可能與阻滯細胞周期有關。其他6個生物堿分別與4個靶點對接，結果均未能找到相互作用的跡象，體外活性實驗也驗證了白鮮堿、7-羥基白鮮堿對兩種腫瘤細胞抑制活性較差，其他4個生物堿未表變現(xiàn)出抑制活性。

圖1 R-(+)-platydesmin與CDK可能的分子間相互作用

圖2 4-dihydro-3-hydroxy-5-methoxy-2，2- dimethy pyrano(2，3-b) quinoline與CDK可能的分子間相互作用

4 結語

天然植物中的生物堿類成分具有抑制多種腫瘤細胞增殖的活性，研究表明，其通過誘導腫瘤細胞分化與凋亡、抑制細胞端粒酶活性、抑制腫瘤細胞周期和增殖等多種途徑，達到抑制腫瘤細胞增殖[16]。本實驗從三椏苦中初步分離得到8個生物堿類成分，并利用肝癌細胞HepG-2、胃癌細胞BGC為對象進行了體外抗腫瘤活性檢測，發(fā)現(xiàn)4-dihydro-3-hydroxy-5-methoxy-2，2-dimethy pyrano(2，3-b) quinoline、R-(+)-platydesmin對這兩個腫瘤細胞具有較高的抑制活性。通過分子對接技術發(fā)現(xiàn)這兩個生物堿與腫瘤細胞中的CDK存在相互關系，證實了這兩種生物堿具有體外抑制腫瘤細胞活性，初步闡釋了其抗腫瘤活性機制。在這個實驗中還有很多含有生物堿的流分還未被分離，課題組會進一步分離生物堿類成分，估計還會有其他生物堿被分離出來，同時會進行體外抗腫瘤活性分析，可能還會發(fā)現(xiàn)對腫瘤細胞有較高活性的生物堿。這有利于闡明其有效成分，為擴大三椏苦的臨床應用基礎、為醫(yī)藥企業(yè)對該藥材進行深入開發(fā)提供必要依據(jù)。