續(xù)斷鑒別及川續(xù)斷皂苷VI的含量測(cè)定

艾光麗，艾青青，高 鵬

(成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院/國家藥品監(jiān)督管理局中藥材質(zhì)量監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610045)

續(xù)斷為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷DipsacusasperWall.ex Henry的干燥根，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、續(xù)折傷、止崩漏的功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，續(xù)斷主要含有三萜皂苷、環(huán)烯醚萜苷、生物堿等成分[2-4]，其中三萜皂苷類成分川續(xù)斷皂苷Ⅵ為主要活性成分，具有促進(jìn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞增殖和向成骨細(xì)胞分化以及促進(jìn)骨傷愈合、抗骨質(zhì)疏松的作用[5-7]。續(xù)斷主產(chǎn)于湖北、湖南、重慶、四川、貴州等省市[2-3]?！吨袊幍洹?020版第一部“續(xù)斷鑒別及含量測(cè)定”項(xiàng)下方法較為復(fù)雜，故本研究對(duì)其薄層鑒別及含量測(cè)定進(jìn)行了改進(jìn)，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Waters2695-2998高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Agilent 1200高效液相色譜儀(德國安捷倫科技有限公司)；Thermo UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)；CAMAG自動(dòng)點(diǎn)樣器；ME204E電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；SK250H超聲波清洗器；默克(Merck)HPTLC高效薄層層析板等。

對(duì)照品：川續(xù)斷皂苷VI(111685-201908，含量為94.3%)；續(xù)斷對(duì)照藥材(121033-201812)；均由中國食品藥品檢定研究院提供。

樣品：續(xù)斷樣品32批，其中四川23批、貴州2批、云南7批。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備 取續(xù)斷粉末0.1 g，加20 mL甲醇，超聲處理20 min，作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照藥材溶液的制備 取續(xù)斷對(duì)照藥材0.1 g，加20 mL甲醇，超聲處理20 min，作為對(duì)照藥材溶液。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備 取川續(xù)斷皂苷VI對(duì)照品，加甲醇制成每 1 mL約含 0.2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.4 點(diǎn)樣量 吸取續(xù)斷對(duì)照藥材溶液、續(xù)斷供試品溶液、川續(xù)斷皂苷VI對(duì)照品溶液各 10 μL，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上。

2.1.5 展開系統(tǒng)的篩選 (1)藥典方法：參照2020年版《中國藥典》一部“續(xù)斷”項(xiàng)下鑒別(2)的方法，發(fā)現(xiàn)此方法顯色不明顯且處理方法較繁瑣，故對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)。薄層色譜，見圖1。

吳參謀沒有跑，他讓手下弟兄迅速搶占有利地形，阻擊四周云集的鬼子，他深知自己擋不了鬼子多久，但只要多擋一分鐘，孔老一他們就多一分活著逃脫的希望。

注：1.川續(xù)斷皂苷VI；2.續(xù)斷對(duì)照藥材；3.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖1 藥典方法薄層色譜

(2)選定方法：將續(xù)斷對(duì)照藥材溶液、續(xù)斷供試品溶液、川續(xù)斷皂苷VI對(duì)照品溶液分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水(14∶7∶2)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和紫外光燈(365 nm)下檢視。發(fā)現(xiàn)此方法下供試品與對(duì)照藥材相對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)更多，顏色更清晰，分離效果更好，操作更簡便，且Rf值適中，故認(rèn)為運(yùn)用此方法分離續(xù)斷中的有效成分較為適宜。薄層色譜，見圖2、圖3。

注：1.川續(xù)斷皂苷VI；2.續(xù)斷對(duì)照藥材；3.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖2 選定方法薄層色譜日光圖

注：1.川續(xù)斷皂苷VI；2.續(xù)斷對(duì)照藥材；3.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖3 選定方法薄層色譜紫外圖

(3)其他薄層色譜展開條件篩選：方法①：將續(xù)斷對(duì)照藥材溶液、續(xù)斷供試品溶液、川續(xù)斷皂苷VI對(duì)照品溶液分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水(14∶6∶2)的下層溶液為展開劑，此方法薄層色譜中供試品與對(duì)照藥材相對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)多，顏色清晰，分離效果好，但川續(xù)斷皂苷VI的Rf值較低，故該展開系統(tǒng)不適合用于續(xù)斷定性鑒別。薄層色譜，見圖4、圖5。

注：1.川續(xù)斷皂苷VI；2.續(xù)斷對(duì)照藥材；3.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖4 方法①薄層色譜日光圖

注：1.川續(xù)斷皂苷VI；2.續(xù)斷對(duì)照藥材；3.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖5 方法①薄層色譜紫外圖

方法②：將續(xù)斷對(duì)照藥材溶液、續(xù)斷供試品溶液、川續(xù)斷皂苷VI對(duì)照品溶液分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶2)[8]的下層溶液為展開劑，此方法薄層色譜中供試品與對(duì)照藥材相對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)多，顏色清晰，分離效果好，但川續(xù)斷皂苷VI的Rf值較低，故該展開系統(tǒng)不適合用于續(xù)斷定性鑒別。薄層色譜，見圖6、圖7。

注：1.川續(xù)斷皂苷VI；2.續(xù)斷對(duì)照藥材；3.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖6 方法②薄層色譜日光圖

注：1.川續(xù)斷皂苷VI；2.續(xù)斷對(duì)照藥材；3.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖7 方法②薄層色譜紫外圖

方法③：將續(xù)斷對(duì)照藥材溶液、續(xù)斷供試品溶液、川續(xù)斷皂苷VI對(duì)照品溶液分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，正丁醇-乙酸-水(4∶1∶5)[9]的上層溶液為展開劑，此方法薄層色譜中供試品與對(duì)照藥材相對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)顏色清晰，Rf值適中，但川續(xù)斷皂苷VI的分離效果差，故該展開系統(tǒng)不適合用于續(xù)斷定性鑒別。薄層色譜，見圖8、圖9。

注：1.川續(xù)斷皂苷VI；2.續(xù)斷對(duì)照藥材；4.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖8 方法③薄層色譜日光圖

注：1.川續(xù)斷皂苷VI；2.續(xù)斷對(duì)照藥材；3.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖9 方法③薄層色譜紫外圖

方法④：將續(xù)斷對(duì)照藥材溶液、續(xù)斷供試品溶液、川續(xù)斷皂苷VI對(duì)照品溶液分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)[10]的上層溶液為展開劑，此方法薄層色譜中供試品與對(duì)照藥材相對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)顏色清晰，Rf值適中，但川續(xù)斷皂苷VI的分離效果差，故該展開系統(tǒng)不適合用于續(xù)斷定性鑒別。薄層色譜，見圖10、圖11。

注：1.川續(xù)斷皂苷VI；2.續(xù)斷對(duì)照藥材；4.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖10 方法④薄層色譜日光圖

注：1.川續(xù)斷皂苷VI；2.續(xù)斷對(duì)照藥材；3.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖11 方法④薄層色譜紫外圖

2.2 川續(xù)斷皂苷VI的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 以C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱；以乙腈∶水(30∶70)為流動(dòng)相；體積流量為1 mL/min；檢測(cè)波長212 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量 10 μL。在上述色譜條件下，川續(xù)斷皂苷VI與其他色譜峰分離較好，分離度>1.5，且空白溶劑無干擾。見圖12。

注：A.對(duì)照品；B.樣品；C.空白溶劑；1.熊果酸。圖12 川續(xù)斷皂苷VI專屬性色譜圖

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取川續(xù)斷皂苷VI對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品細(xì)粉0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)20 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線性關(guān)系與標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取川續(xù)斷皂苷VI對(duì)照品7.915 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液。精密吸取上述溶液各0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。測(cè)定結(jié)果顯示川續(xù)斷皂苷VI進(jìn)樣濃度在7.463 8～44.783 1 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；回歸方程：y=3446.113 5x-4 860.733 3；相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取川續(xù)斷皂苷VI對(duì)照品溶液10 μL(0.182 2 mg·mL-1)，注入液相色譜儀中，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得其峰面積并計(jì)算川續(xù)斷皂苷VI峰面積的RSD<3.0%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL(批號(hào)CD-3)，分別在0、6、10、12、14、16、20、24 h依次進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積并計(jì)算，川續(xù)斷皂苷VI峰面積的RSD<3.0%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品6份(批號(hào)CD-3)，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL依法測(cè)定峰面積并計(jì)算，川續(xù)斷皂苷VI含量的RSD為<3.0%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品(CD-2)9份，每份0.25 g，精密稱定，分成3組，每組3份，3組分別加入川續(xù)斷皂苷VI對(duì)照品溶液(濃度為4.640 7 mg/mL)0.5 mL，1 mL，1.5 mL。按擬定的方法制成供試品溶液，計(jì)算9份供試品的加樣回收率。結(jié)果顯示，川續(xù)斷皂苷VI的加樣回收率為101.37%～102.68%，RSD為0.45%，<3.0%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。見表1。

表1 川續(xù)斷皂苷VI加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 樣品含量測(cè)定 取收集的32批續(xù)斷樣品，按選定方法測(cè)定川續(xù)斷皂苷VI的含量。見表2。

表2 32批續(xù)斷樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

續(xù)斷有效成分主要是皂苷或苷類成分，易溶于甲醇，故選擇甲醇作為提取溶劑。三氯甲烷、二氯甲烷對(duì)皂苷類成分分離效果較好，故選擇毒性相對(duì)較小的二氯甲烷作為展開劑的主要試劑。

取川續(xù)斷皂苷VI對(duì)照品溶液，在波長 200～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，并記錄光譜圖。結(jié)果顯示其在近紫外端下具有較強(qiáng)吸收，參照2020年版《中國藥典》一部[1]“續(xù)斷含量”項(xiàng)下，故本研究選用 212 nm 作為檢測(cè)波長。

依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)方法[1，11-13]，本實(shí)驗(yàn)比較了乙腈-水(30∶70)、甲醇-0.1%鹽酸溶液(68∶32)、乙腈-0.05%甲酸溶液(30∶70)、乙腈-0.1%磷酸溶液(30∶70)四種流動(dòng)相，結(jié)果以乙腈-水(30∶70)為流動(dòng)相，基線平穩(wěn)，色譜峰峰形對(duì)稱，操作簡便。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取溶劑(50%甲醇、70%甲醇、甲醇、乙醇)、超聲時(shí)間(20、30、40 min)、回流(30、40、60 min)等進(jìn)行研究，在考察了分離度、色譜峰形以及過濾速度后，最終確定了甲醇超聲20 min作為供試品溶液的制備方法。

本實(shí)驗(yàn)所建立的續(xù)斷薄層鑒別方法及川續(xù)斷皂苷VI的含量測(cè)定方法，方法簡便，專屬性強(qiáng)，耐用性好，能夠?yàn)槔m(xù)斷的質(zhì)量控制和進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。