高效液相色譜法測(cè)定雙葛止瀉口服液中葛根素的含量

朱華偉，周冰，李煥娟,李傳棟，張聰，周德剛

摘要：本試驗(yàn)旨在建立雙葛止瀉口服液中葛根素的含量測(cè)定方法。試驗(yàn)用色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（150×4.6mm，5μm），以甲醇-0.4%磷酸溶液（24∶76）為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm;流速為1.0mL/min;柱溫為30℃。結(jié)果表明，葛根素進(jìn)樣量在0.1616～1.6159μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9999），回收率的平均值為100.5%，RSD為0.8%。因此，該方法準(zhǔn)確度高、專屬性好，可用于雙葛止瀉口服液中葛根素的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：雙葛止瀉口服液 ;葛根素;高效液相色譜法

雙葛止瀉口服液是由金銀花、葛根、黃芩、黃連等中藥組成，采用提取、純化技術(shù)，加入適宜的輔料，滅菌而制成的口服液制劑。本方來(lái)源于《傷寒論》中的經(jīng)典方劑“葛根芩連湯”，通過(guò)組方加減，工藝優(yōu)化而制成的新型中獸藥制劑，為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)的國(guó)家三類新獸藥（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告 第186號(hào)）。本方具有清熱燥濕，解毒止瀉的功效，用于仔豬濕熱泄瀉。方中金銀花清熱解毒、疏散風(fēng)熱，葛根解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽(yáng)止瀉、通經(jīng)活絡(luò)，二者共為君藥。研究表明，本品具有一定的抗炎止瀉作用，其止瀉機(jī)制與抑制胃腸運(yùn)動(dòng)具有相關(guān)性[1]，且本品對(duì)麻雞大腸桿菌病具有良好的治療效果[2]。方中金銀花的化學(xué)成分主要為黃酮類、環(huán)烯醚萜類、三萜及三萜皂苷類和有機(jī)酸類等[3]，葛根的化學(xué)成分主要為葛根素、大豆苷元和大豆苷等異黃酮類化合物，香豆素類及三萜及三萜皂苷類成分，此外還有豐富的礦物質(zhì)和氨基酸[4]。公司已建立該產(chǎn)品中指標(biāo)成分綠原酸的含量測(cè)定方法[5]，為了更好地控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，本文采用高效液相色譜法，建立了本品中葛根素的含量測(cè)定方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)研究，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 Waters e2695型高效液相色譜儀（配2489型紫外檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司）;AB135-S型電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）。

1.1.2 試藥與試劑 葛根素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110752-201514，含量：95.5%）;雙葛止瀉口服液（洛陽(yáng)惠中獸藥有限公司，批號(hào)：20170201，20170202，20170203，規(guī)格：0.45g生藥/mL）;乙腈（HPLC級(jí)，Thermo Fisher Scientific公司）;磷酸（HPLC級(jí)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）;水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150×4.6mm，5μm）。流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸溶液（24∶76），流速：1.0mL/min;柱溫：30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm;進(jìn)樣量：10μL。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取葛根素對(duì)照品適量，精密稱定，加30%乙醇制成每1mL含80μg的溶液，即得。

1.2.3 供試品溶液的制備 精密量取本品2mL，置100mL量瓶中，加10%乙醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方制備缺葛根的陰性對(duì)照樣品，按“.2.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液，即得。

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1專屬性。分別取“1.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、“1.2.3”項(xiàng)下供試品溶液及“1.2.4”項(xiàng)下陰性對(duì)照溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，按上述“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件，依法測(cè)定并記錄色譜圖。

1.2.5.2線性關(guān)系。取“1.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別精密吸取2、5、10、15和20μL注入高效液相色譜儀，按上述“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件依法測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，葛根素的進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.2.5.3精密度。取“1.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，精密吸取10μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件依法測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6針，測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD。

1.2.5.4重復(fù)性。取雙葛止瀉口服液樣品（批號(hào)：20170201），平行6份，分別按照“1.2.3”項(xiàng)下的操作方法制備供試品溶液，并按上述“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件依法測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算葛根素含量及RSD。

1.2.5.5溶液穩(wěn)定性。取雙葛止瀉口服液（批號(hào)：20170201），按照"1.2.3"項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于第0、2、4、8和12h進(jìn)樣，依法測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算峰面積的RSD。

1.2.5.6加樣回收率。精密稱取葛根素對(duì)照品35.22mg，置25mL量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取已知含量的樣品（批號(hào)：20170201，含量：4.0mg/mL）6份，每份1mL，置100mL量瓶中，各精密加入上述對(duì)照品儲(chǔ)備液3mL，按照“1.2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量，計(jì)算回收率、平均回收率及RSD。

1.2.6 耐用性 為了考察色譜條件發(fā)生小的變化時(shí)，葛根素含量測(cè)定結(jié)果受影響的程度，分別對(duì)流動(dòng)相比例、柱溫、流速及色譜柱型號(hào)等因素進(jìn)行小的調(diào)整，記錄葛根素含量的變化情況。按“1.2.2”和“1.2.3”項(xiàng)下方法分別制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，采用單因素考察法，每次調(diào)整其中一個(gè)因素，依法測(cè)定含量。記錄每個(gè)因素下的峰面積，并計(jì)算葛根素含量及RSD。

1.2.7 樣品測(cè)定 取雙葛止瀉口服液樣品（批號(hào)為：20170201，20170202，20170203），按“1.2.3”項(xiàng)下的操作方法制備供試品溶液，按上述“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件依法測(cè)定，計(jì)算樣品中葛根素的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性考察 按"1.2.5.1"項(xiàng)下進(jìn)樣分析，結(jié)果供試品色譜在與對(duì)照品色譜中葛根素主峰相同的位置，有保留時(shí)間一致的色譜峰。陰性對(duì)照色譜在與葛根素主峰相應(yīng)的位置處無(wú)干擾。結(jié)果表明，本方法專屬性良好。見(jiàn)圖1。

2.1.2 線性關(guān)系考察 按“1.2.5.2”項(xiàng)下進(jìn)樣分析，記錄峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，回歸方程為：Y=4765824.5939X-170324.1707（r=0.9999），表明葛根素進(jìn)樣量在0.1616～1.6159μg范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣量線性關(guān)系良好，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 按“1.2.5.3”項(xiàng)下進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄峰面積并計(jì)算峰面積的RSD，結(jié)果見(jiàn)表2，葛根素峰面積的RSD為0.1%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按“1.2.5.4”項(xiàng)下進(jìn)行操作，平行制備6份供試品溶液，依法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3，6份樣品含量測(cè)定結(jié)果的RSD為1.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“1.2.5.5”項(xiàng)下進(jìn)行操作，分別在第0、2、4、8和12h進(jìn)樣分析，計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果見(jiàn)表4，葛根素峰面積的RSD為0.8%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn) 按“1.2.5.6”項(xiàng)下進(jìn)行操作，結(jié)果6份樣品的回收率在99.73%～101.92%之間，平均回收率為100.5%，RSD為0.8%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。結(jié)果見(jiàn)表5。

2.2 耐用性

按照“1.2.6”項(xiàng)下的方法進(jìn)行操作。結(jié)果表明，通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相比例、柱溫、流速以及更換不同型號(hào)的色譜柱，各條件下葛根素含量測(cè)定結(jié)果均沒(méi)有顯著差異，RSD均符合要求。表明該色譜條件的耐用性良好。結(jié)果見(jiàn)表6。

2.3 樣品測(cè)定

按照“1.2”項(xiàng)下的操作方法，分別制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，依法測(cè)定雙葛止瀉口服液三批樣品中葛根素的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用紫外-可見(jiàn)分光度法進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果葛根素在250nm處有最大吸收。參考《中國(guó)獸藥典》2015年版一部[6]葛根藥材含量測(cè)定項(xiàng)及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[7，8]，葛根素的檢測(cè)波長(zhǎng)多采用250nm。綜合分析，確定葛根素的檢測(cè)波長(zhǎng)選擇250nm。

3.2 色譜條件的考察

曾參考《中國(guó)獸藥典》2015年版一部葛根藥材含量測(cè)定項(xiàng)，以甲醇-水（25：75）為流動(dòng)相，結(jié)果該條件下葛根素主峰附近有多個(gè)雜峰，且與葛根素主峰分離度不好。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[9，10]，通過(guò)在水相中加入磷酸，并對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行優(yōu)化，所得色譜峰峰形較好，陰性對(duì)照無(wú)干擾。通過(guò)不同流動(dòng)相比例、柱溫、流速、色譜柱的耐用性實(shí)驗(yàn)，葛根素含量均沒(méi)有顯著變化，表明本方法的耐用性較好。

本文建立了一種高效液相色譜法測(cè)定雙葛止瀉口服液中葛根素含量的方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果該方法準(zhǔn)確度高、專屬性好，可用于該產(chǎn)品中葛根素的質(zhì)量控制。

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