基于高通量測(cè)序的白木香結(jié)香部位真菌多樣性研究

宋杰 張寧南 張鐘慧 周再知 梁俊峰 陸俊錕

摘 ?要：本研究以廣東茂名和東莞區(qū)域的經(jīng)濟(jì)植物白木香（Aquilaria sinensis）為對(duì)象，基于高通量測(cè)序方法，分析2個(gè)不同區(qū)域生境中4個(gè)品種白木香結(jié)香部位真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性及分布規(guī)律，結(jié)合不同品種的結(jié)香特性，進(jìn)一步挖掘與白木香結(jié)香顯著相關(guān)的真菌類(lèi)群，促進(jìn)結(jié)香技術(shù)的提升。結(jié)果表明：相同生境條件下，同種白木香不同高度結(jié)香位點(diǎn)真菌組成結(jié)構(gòu)非常相似，但不同真菌的豐度存在差異;不同區(qū)域生境下，相同品種結(jié)香部位真菌群落組成結(jié)構(gòu)存在顯著差異，生境差異可能是導(dǎo)致結(jié)香部位真菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要因素之一;同一區(qū)域生境下，不同品種白木香結(jié)香部位的真菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，品種差異可能是導(dǎo)致白木香結(jié)香部位真菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要因素之一，同時(shí)特有真菌類(lèi)群的存在也可能是影響白木香結(jié)香特性的關(guān)鍵。Fusarium spp. 和Hypomontagnella spp. 等真菌在易結(jié)香品種分布廣泛且豐度極高，可能與易結(jié)香品種的結(jié)香特性相關(guān)，具有重要的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：白木香;結(jié)香技術(shù);真菌多樣性;高通量測(cè)序

中圖分類(lèi)號(hào)：S567.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Aquilaria sinensis （Lour.） Spreng， an economic plant in Guangdong， was selected as the object of this study. Using the high-throughput sequencing method， we analyzed the community structure and distribution of fungi in agar-wood wound locations of four agarwood varieties in Maoming and Dongguan， China. Combining the agarwood forma-tion characteristics of different varieties， fungal groups were further investigated which were significantly related to the agarwood formation. Under the same habitat condition， fungi community structure at different height sampling sites in the same varieties were remarkably similar， despite the different fungi abundance. The fungal community composition were significantly different in the same varieties under different habitats， and the difference of habitat may be one of the main factors leading to the difference of fungal community structure. There were significant differences in the fungal community structure among different varieties under the same habitat condition. Different agarwood varieties may be one of the main factors leading to the difference of fungal community structure. The unique fungi with high abundance maybe result in special feature of agarwood formation. Fusarium spp. and Hypomontagnella spp.， which are widely distributed with high abundance in the easy agarwood formation varieties， are the best illustrations for this conclusion.

Keywords： Aquilaria sinensis; agarwood formation technology; fungi divesity; high-throughput sequencing

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.039

沉香是由瑞香科沉香屬（Aquilaria spp.）或擬沉香屬（Gyrinops spp.）植物木質(zhì)部組織及其分泌物共同組成的混合物質(zhì)，在亞洲、中東和歐洲被廣泛用于醫(yī)藥，同時(shí)也是一種傳承歷史悠久的名貴香料[1-3]。沉香內(nèi)含的倍半萜烯和苯乙基色酮派生物具有顯著的生物學(xué)藥理性質(zhì)，包括抗菌、抗氧化和抗腫瘤活性，在治療胃潰瘍和哮喘方面具有潛在的價(jià)值[4-8]。

在我國(guó)，沉香主要來(lái)源于白木香[Aquilaria sinensis （Lour.） Spreng]，是一種重要的傳統(tǒng)中藥材，可用于治療嘔吐、哮喘和失眠[9-10]。自然條件下，白木香樹(shù)在受到微生物刺激、昆蟲(chóng)以及其他傷害后可產(chǎn)生分泌物，沉積形成沉香，過(guò)程復(fù)雜且需要長(zhǎng)期的演變和積累[11]。然而，由于沉香的神秘香味和高昂價(jià)格，致使世界范圍內(nèi)的沉香過(guò)度采伐和消耗，沉香日漸成為一種緊缺資源。目前所有的沉香屬物種都被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES， http：//www.cites.org），其進(jìn)出口需要相關(guān)許可證（IUCN 2002）。在2004年，白木香又被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物，并被列入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟受威脅植物紅色名錄》[12]。

為了保護(hù)野生沉香資源，同時(shí)增加沉香產(chǎn)量，我國(guó)廣東、海南和廣西等地開(kāi)始了廣泛的白木香培育及促進(jìn)白木香結(jié)香技術(shù)研發(fā)工作。真菌侵染長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是一種有效促進(jìn)白木香結(jié)香方法，許多從白木香結(jié)香部位分離的真菌已被報(bào)道可以顯著加速沉香油性成分形成和積累，包括Fusarium sp.、Chaetomium sp.、Trichoderma sp.、Menanotus sp.、Aspergillus sp.、Penicillium sp.、Lasiodiplodia sp.和Rigidoporus sp.等[11， 13-17]。張苗苗[18]對(duì)白木香內(nèi)生菌的分布規(guī)律進(jìn)行了初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白木香內(nèi)生真菌在結(jié)香過(guò)程中可能具有復(fù)雜的規(guī)律性，不是簡(jiǎn)單線(xiàn)性關(guān)系，結(jié)香部位菌群豐富，結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜。Liu 等[2]的研究結(jié)果也顯示，白木香不同高度結(jié)香部位的真菌類(lèi)群有明顯差異，結(jié)香品質(zhì)也不相同。真菌分布規(guī)律及刺激白木香結(jié)香的機(jī)制研究仍有待深入。

目前，在長(zhǎng)期的人工培育和結(jié)香實(shí)踐過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，我國(guó)白木香不同個(gè)體的結(jié)香特性并不相同，通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)多個(gè)易結(jié)香品種，在地方上被稱(chēng)為“奇楠沉香”[19-23]。普通白木香品種沉香的形成和累積都較為緩慢，通常樹(shù)齡超過(guò)10 a的白木香經(jīng)過(guò)物理、化學(xué)、生物等的刺激才會(huì)結(jié)香;而少部分經(jīng)過(guò)篩選白木香品種結(jié)香卻較為容易，3～5 a樹(shù)齡的白木香即可開(kāi)始產(chǎn)香，并且結(jié)香品質(zhì)較高，油脂豐富、色澤較深，即所謂的“奇楠沉香”。然而，迄今仍然沒(méi)有系統(tǒng)性的研究，探討不同地區(qū)、不同品種白木香結(jié)香部位的真菌種群分布規(guī)律。因此，研究并闡明這種真菌種群分布規(guī)律對(duì)于探究真菌促結(jié)香技術(shù)的研發(fā)具有重要價(jià)值。

鑒于此，本研究選擇4個(gè)不同品種白木香的物理傷害結(jié)香樣本，通過(guò)高通量測(cè)序的方法，結(jié)合已有研究數(shù)據(jù)進(jìn)行真菌物種多樣性分析，旨在：（1）探究不同地區(qū)環(huán)境中白木香結(jié)香部位真菌類(lèi)群多樣性之間的關(guān)系;（2）探究不同品種白木香結(jié)香部位真菌類(lèi)群分布規(guī)律，闡明真菌分布差異與結(jié)香特異的關(guān)聯(lián)性，挖掘更有價(jià)值的促結(jié)香真菌。本研究將為探究白木香結(jié)香技術(shù)提供重要的參考和數(shù)據(jù)支撐。

1 ?材料與方法

1.1 ?樣本采集

2019年10月中旬，在廣東省茂名市電白區(qū)大水坡村進(jìn)行不同品種白木香樣本采集。取樣方式參照Liu等[2]Type II（Type I：距離地面2～2.5 m的損傷主干橫截面結(jié)香部位;Type II：距離地面1.5～1.8 m處損傷側(cè)枝結(jié)香部位;Type III：距離地面1～1.2 m的損傷主干橫截面結(jié)香部位;Type IV：距離地面0.8～1.2 m處損傷主干縱切面結(jié)香部位;Type V：距離地面0.2～0.4 m，靠近根部的損傷主干結(jié)香部位），每個(gè)品種確保隨機(jī)3～4份重復(fù)，依次做好標(biāo)記。易結(jié)香奇楠品種3種，包括‘西瓜葉’（XHY）、‘金勺子’（JSZ）和‘虎斑棋’（HBQ）。普通沉香品種1種，與Liu 等[2]所述東莞地區(qū)白木香相同，皆為廣東省內(nèi)常見(jiàn)的普通不易結(jié)香的對(duì)照品種，分別標(biāo)記為C1和C2。采集區(qū)域及沉香品種詳情見(jiàn)表1。每份樣本確保取樣量大于2 g，取樣后首先使用無(wú)菌蒸餾水進(jìn)行表面清洗，然后使用無(wú)菌濾紙吸干，處理后的樣本快速放入無(wú)菌凍存管，并立即進(jìn)行液氮速凍。所有樣品處理方法一致，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，轉(zhuǎn)移到?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ?樣品真菌DNA提取及文庫(kù)構(gòu)建

準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g凍存樣品供真菌多樣性分析，所有樣本送往上海美吉生物工程有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。利用DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.? soil DNA kit，Omega Bio-tek， Norcross， GA， U.S.）進(jìn)行微生物總DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA質(zhì)量;使用NanoDrop2000測(cè)定DNA濃度和純度。本文使用ITS（Internal Transcribed Spacer）基因序列作為分子標(biāo)記，使用引物ITS1F（5-CTTGGTCATTT-AGAGGAAGTAA-3）和ITS2R（5-GCTGCGTTC- TTCATCGATGC-3）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每份樣本分別重復(fù)擴(kuò)增3次。將同一份樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收，利用AxyPrep DNA Gel Extraction kit（美國(guó)Axygen Biosciences）進(jìn)行回收產(chǎn)物純化。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用QuantusTM Fluorometer（美國(guó)Promega）對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)、定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit試劑盒構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，然后在Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)上機(jī)進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

1.3.1 ?原始數(shù)據(jù)整理、過(guò)濾及質(zhì)量評(píng)估 ?從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的SRA庫(kù)中，下載廣東省東莞市普通白木香結(jié)香處微生物高通量測(cè)序數(shù)據(jù)（BioProject number： PRJNA509099），結(jié)合本研究測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較研究。本研究采用最新的性能更優(yōu)的QIIME2[24]（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）分析平臺(tái)對(duì)原始數(shù)據(jù)（Raw data）進(jìn)行分析，分析方法參照qiime2（https：// docs.qiime2.org）的使用說(shuō)明。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入QIIME2平臺(tái)后，調(diào)用q2-cutadapt插件先對(duì)reads引物序列進(jìn)行剪切，然后根據(jù)序列質(zhì)量分布圖，調(diào)用q2-data2插件對(duì)擴(kuò)增子數(shù)據(jù)去噪，過(guò)濾質(zhì)量較差的序列和嵌合序列，從而確定擴(kuò)增子序列變異（Amplicon sequence variants， ASVs），然后去冗余，得到有效Fearture，包括特征表（Feature-table）及代表序列（Feature-data）。使用q2-feature-table插件過(guò)濾特征，過(guò)濾僅在一個(gè)樣本中出現(xiàn)的特征，避免偶然因素誤差，降低結(jié)果的假陰性率。使用相同的方法處理代表序列。

1.3.2 ?原始數(shù)據(jù)整理、過(guò)濾及質(zhì)量評(píng)估 ?基于代表性Feature序列和真菌UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//unite.ut.ee/）進(jìn)行序列比對(duì)，即對(duì)不同分組樣本中檢測(cè)到的全部ITS有效序列，自分類(lèi)學(xué)上的界（Kingdom）、門(mén)（Phylum）、綱（Class）、目（Order）、科（Family）、屬（Genus）、種（Species）多個(gè)層級(jí)進(jìn)行物種鑒定和注釋。查看代表序列和注釋結(jié)果文件，并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast校對(duì)，去除雜質(zhì)的序列，使用q2-taxa插件再次過(guò)濾特征表和代表序列，僅保留注釋到門(mén)的物種序列。依據(jù)過(guò)濾后的特征表，生成最終的樣本物種注釋結(jié)果，并對(duì)檢測(cè)到的真菌物種進(jìn)行菌群群落組成分析，計(jì)算每個(gè)分類(lèi)層級(jí)上每個(gè)物種的豐度占全部物種豐度的比值（即相對(duì)豐度）。使用R（v.3.6.0）軟件中g(shù)gplot2程序包繪制不同樣品在各個(gè)分類(lèi)層級(jí)上的真菌堆疊柱狀圖，反映物種的組成情況。

1.4 ?統(tǒng)計(jì)分析

依據(jù)測(cè)序特征表結(jié)果，計(jì)算ASVs水平α多樣性，得到Richness指數(shù)，使用ggplot2軟件繪制Richness指數(shù)稀釋曲線(xiàn)，確定物種覆蓋度是否已經(jīng)飽和。同時(shí)，依據(jù)屬水平的物種注釋結(jié)果，使用q2-diversity插件及R軟件中vegan程序包進(jìn)行Alpha多樣性計(jì)算，包括Richness指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)，比較不同組間樣本的多樣性水平。Richness指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)反映物種豐富度，指數(shù)越大表示樣本群落豐富度越高;Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映物種的豐富度和均勻度，即多樣性，指數(shù)值越大，表示菌群多樣性越高。

本研究計(jì)算樣本距離的算法采用Bray- Curtis distance、Unweighted/Weighted UniFrac distance。本研究采用主坐標(biāo)分析（PCoA）進(jìn)行β多樣性分析，PCoA圖可直觀(guān)展示組間的菌群組成差異，若兩組間樣本距離較近，提示2組樣本菌群結(jié)構(gòu)相似性高，菌群組成差異性小，反之則表示2組間樣本間菌群群落差異性大。進(jìn)一步，本研究利用R軟件包對(duì)不同分組中豐度大于1%的物種繪制了豐度熱圖，并利用STAMP v2.1.3軟件進(jìn)行屬水平真菌豐度差異顯著性分析Welch’s t-test檢驗(yàn)，識(shí)別不同分組中豐度差異顯著的真菌類(lèi)群[25]。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?真菌多樣性測(cè)序結(jié)果

本研究包含白木香普通品種及易結(jié)香品種4個(gè)，總樣本20份，其中廣東省茂名市樣本15份，東莞市樣本5份。根據(jù)品種、采集地點(diǎn)和結(jié)香特性分別將樣本分為5組（表1）。高通量測(cè)序獲得序列（reads）歷經(jīng)數(shù)據(jù)優(yōu)化、拼接、過(guò)濾和質(zhì)控后獲得優(yōu)質(zhì)ITS序列1349058條，片段長(zhǎng)度150～308 bp，包含463個(gè)ASVs。由圖1可知，所有樣本的Richness稀釋曲線(xiàn)趨于平緩，ASVs覆蓋度已經(jīng)達(dá)到飽和，說(shuō)明所測(cè)數(shù)據(jù)能夠準(zhǔn)確反映樣本真菌群落結(jié)構(gòu)組成。

2.2 ?物種分類(lèi)注釋

利用UNITE分類(lèi)器，以及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Feature數(shù)據(jù)的注釋?zhuān)?63個(gè)ASVs可鑒定到真菌界4門(mén)、18綱、61目、29科、189屬、231種真菌。各分類(lèi)水平的微生物類(lèi)群統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2，絕大部分菌群都分類(lèi)到了屬，也有部分菌群分類(lèi)到了種，但仍然有很多Feature無(wú)法分類(lèi)到種。依據(jù)分類(lèi)數(shù)據(jù)，本研究在目水平和屬水平繪制了真菌堆疊柱狀圖，反映各組物種的組成情況，見(jiàn)圖2。

2.3 ?群落組成分析

在目分類(lèi)水平上，共鑒定61目真菌，其中，未知分類(lèi)菌目有6個(gè)，占到13%，5組樣本中真菌分布結(jié)構(gòu)存在差異。如圖2A所示，XGY組檢測(cè)出分類(lèi)菌目27個(gè)，Hypocreales是明顯優(yōu)勢(shì)種群，占比達(dá)78.4%，其次為Chaetothyriales（6.7%）、Pleosporales（6.0%）、Erythrobasidiales（3.6%）和Agaricostilbales（3.3%），五類(lèi)菌占比都超過(guò)1%，所占比例之和達(dá)到98%。JSZ組樣本檢測(cè)出分類(lèi)菌目25個(gè)，Xylariales是明顯優(yōu)勢(shì)種群，占比52.4%，占比超過(guò)1%的目還包括Pleosporales（18.9%）、Agaricostilbales（5.5%）、Togniniales （3.7%）、Hypocreales（3.7%）、Glomerellales（3.2%）、Holtermanniales（2.7%）、Erythrobasidiales（2.7%）、Trichosporonales（2.5%）和Tremellales（1.8%）。HBQ組樣本檢測(cè)出分類(lèi)菌目35個(gè)，Hypocreales是明顯優(yōu)勢(shì)種群，占比達(dá)54.2%，占比超過(guò)1%的目還包括Pleosporales（28.9%）、Erythrobasidiales（9.9%）、Trichosporonales（1.6%）、Chaetothyriales（1.3%）和Agaricostilbales（1.1%）。C2組樣本檢測(cè)出分類(lèi)菌目29個(gè)，占比超過(guò)1%的目有9個(gè)，其中Sordariales是明顯優(yōu)勢(shì)種群，占比63.2%，其次為Pleosporales（9.3%）、Eurotiales（8.7%）、Hypocreales（6.1%）、Holtermanniales（2.7%）、Chaetothyriales（2.1%）、Togniniales（1.9%）、Trichosporonales（1.2%）和Glomerellales（1.1%）。C1組樣本檢測(cè)出分類(lèi)菌目42個(gè)，占比超過(guò)1%的目有13個(gè)，其中norank Sordariomycetes為優(yōu)勢(shì)菌，占比達(dá)25.2%，其次為Botryosphaeriales（13.8%）、Chaetosphaeriales（11.4%）、Conioscyphales（7.4%）、Sordariales（7.3%）、Eurotiales（6.9%）、unidentified Sordariomycetes（6.9%）、Helotiales（5.7%）、Wallemiales（3.5%）、Pleosporales（3.0%）、Thelebolales（2.4%）、Chaetothyriales（1.7%）、Hypocreales（1.3%）。

在屬水平上檢測(cè)分類(lèi)出189類(lèi)真菌屬。如圖2B所示，XGY組中共有81類(lèi)真菌屬，其中Fusarium屬真菌豐富最高（77.6%），其次為Veronaea（5.7%）、Bannoa（3.6%）、Kurtzmanomyces（3.3%）、Acrocalymma（2.7%）、Roussoella（1.6%）、Corynespora（1.1%）、Cyphellophora（0.6%）和unidentified Hypocreales（0.6%）。JSZ組中共有71類(lèi)真菌屬，其中Hypomontagnella屬真菌豐富最高（52.4%），其次為Acrocalymma（8.0%）、Kurtzmanomyces（5.5%）、Roussoella（5.1%）、Phaeoacremonium（3.7%）、Colletotrichum（3.2%）、Holtermanniella（2.7%）、Bannoa（2.7%）、Fusarium（2.6%）、unidentified Pleosporales（1.8%）和Cutaneotrichosporon（1.5%）。HBQ組中共有97類(lèi)真菌屬，其中unidentified Hypocreales豐富最高，占比30.7%，其次為Acrocalymma（21.6%）、Fusarium（20.1%）、Bannoa（9.9%）、Kiflimonium（3.3%）、Roussoella（2.5%）、Bipolaris（1.7%）、Kockovaella（1.2%）、Pseudorobillarda（1.2%）和Kurtzmanomyces（1.2%）。C2組中共有78類(lèi)真菌屬，Neurospora屬真菌豐富最高，占比達(dá)61.2%，其次為Penicillium（7.8%）、Bipolaris（7.6%）、unidentified Hypocreales（3.8%）、Holtermanniella（2.7%）、Phaeoacremonium（1.9%）、Fusarium（1.6%）、Cyphellophora（1.6%）、Phialemonium（1.5%）、和Cutaneotrichosporon（1.2%）。C1組中共有73類(lèi)真菌屬，Pseudodactylaria豐度最高，達(dá)25.2%，其次為Alanphillipsia（13.8%）、unidentified Chaetosphaeriaceae（11.3%）、unidentified Sordariales（6.9%）、Aspergillus（6.9%）、unidentified Sordariomycetes（6.6%）、unidentified Conioscy-phaceae（4.5%）、Wallemia（3.5%）、Claussenomyces（2.9%）和unidentified Helotiales（2.9%）。

2.4 ?真菌群落多樣性指數(shù)分析

基于Feature豐度和vegan軟件包計(jì)算的多樣性指數(shù)值，使用T檢驗(yàn)分析并比較各分組樣本的多樣性指數(shù)。如圖3所示，C1組Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)高于其他組，表明東莞地區(qū)普通白木香結(jié)香部位真菌類(lèi)群比茂名地區(qū)豐富度高，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）或顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)還顯示茂名地區(qū)4組白木香中，易結(jié)香品種HBQ結(jié)香部位真菌類(lèi)群豐富度最高，且HBQ與JSZ分組中真菌類(lèi)群豐富度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其他分組間不存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯示XGY最低，表明易結(jié)香品種XGY結(jié)香部位真菌多樣性最低，但各類(lèi)群間多樣性并不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖4為基于 Bray-Curtis距離的PCoA分析結(jié)果，其中PCoA1和PCoA2的主成分解釋度分別為22.52%和18.35%。不同區(qū)域、不同品種5個(gè)分組的真菌群落形成了各自獨(dú)立的區(qū)域，每個(gè)分組散點(diǎn)分布區(qū)域是完全分離的，說(shuō)明5個(gè)分組間菌群結(jié)構(gòu)存在可區(qū)分的差異。東莞地區(qū)C1組與茂名地區(qū)4個(gè)分組之間距離都較遠(yuǎn)，表明2個(gè)地區(qū)白木香結(jié)香部位菌群結(jié)構(gòu)組成上相似性較低，差異較大。易結(jié)香品種XGY和HBQ之間距離最近，表明2組菌群結(jié)構(gòu)相似性較高，菌群組成差異較小;XGY、HBQ都與JSZ之間距離較遠(yuǎn)，表明JSZ品種的結(jié)香部位菌群結(jié)構(gòu)與其他兩個(gè)易結(jié)香品種差異較大;易結(jié)香品種與普通品種C1、C2組之間距離都相對(duì)較遠(yuǎn)，表明普通沉香品種與易結(jié)香品種之間結(jié)香部位菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異。

2.5 ?物種差異分析

在屬水平，利用大于1%豐度真菌繪制分層聚類(lèi)熱圖，如圖5所示，東莞地區(qū)普通沉香與茂名地區(qū)的4種白木香結(jié)香部位真菌組成存在顯著的差異，表明不同地區(qū)之間氣候環(huán)境的差異對(duì)結(jié)香部位菌群的影響非常顯著。C1組沉香5個(gè)不同的樣本源于東莞地區(qū)的普通白木香品種結(jié)香部位，每個(gè)樣本距離地面的高度不同、取樣部位不同，雖然各屬真菌在C1組5個(gè)樣本中的真菌物種豐度存在差異，但結(jié)香部位的菌群物種組成較為相似，特別是都含有18個(gè)較高豐度的屬或未知屬真菌，包括：Claussenomyces、Conlarium、Tricho?derma、Pseudeurotium、Pseudodactylaria、Batche?lor?omyces、Conioscypha、Hermatomyces、Wallemia、Pseudolophiostoma、unidentified_ Conios?cyphaceae、unidentified_Nectriaceae、unidentified_Sordari?omy?ce-tes、unidentified_Dothideomycetes、unide?nti-fied_Sordariales、unidentified_Teratosphaeriaceae、unidentified_Chaetosphaeriaceae、unidentified_Hel??o-tia?les。此18個(gè)屬及未知屬真菌在茂名地區(qū)C2、HBQ、JSZ、XGY等品種結(jié)香部位中豐度都極低。

Alanphillipsia、Plectosphaerella、Exophiala、Aspergillus、Kurtzmanomyces、Phaeoacremonium、Penicillium、Holtermanniella、unidentified_ Capn?od?i-ales、unidentified_Pleosporales等10屬或未知屬在5組中都有廣泛分布，但在普通沉香C1和C2組中通常分布更多。Phialemonium、Bipolaris和Cutaneotrichosporon屬真菌在茂名地區(qū)C2、HBQ、JSZ和XGY中普遍豐度較高。Fusarium、Corynes-p?ora、Roussoella、Kockovaella、Acrocaly?mma、Hypomontagnella和Bannoa等7屬真菌僅在易結(jié)香品種中廣泛分布且具有較高的豐度，普通品種中分布較少且豐度極低。

Neurospora、Debaryomyceser、Curvularia等3屬真菌僅在C2組普通白木香中普遍存在且豐度較高，與其他組有顯著豐度差異。Cyphellophora、Veronaea、Periconia、Kiflimonium、Pseudorobil?lar?da、unidentified_Hypocreales等6屬及未知屬真菌僅在易結(jié)香品種HBQ中普遍存在，且豐度較高，具有一定的特異性。Hypomontagnella、Colle?tot?richum、Nigrograna等3屬在易結(jié)香品種JSZ中具有特異性，普遍存在且物種豐富較高。易結(jié)香品種XGY與其他4個(gè)品種相比較，沒(méi)有明顯豐度特異的菌群。

為了進(jìn)一步探究不同分組間真菌類(lèi)群豐度差異顯著性，本研究利用STAMP軟件對(duì)大于1%豐度屬進(jìn)行Welch’s t-test檢驗(yàn)。如圖6所示，差異分析結(jié)果表明，C1與C2組結(jié)香部位樣本菌群存在3種顯著差異的屬，包括Neurospora、Aspergillus和Hermatomyces。普通品種C2與易結(jié)香品種HBQ、JSZ、XGY間存在4種豐度顯著差異的屬，包括Neurospora、Fusarium、Roussoella和Hypomontagnella;品種XGY與JSZ之間存在2種顯著豐度差異的屬，包括Fusarium和 Hy-pomontagnella;品種XGY與HBQ之間僅有Fusarium存在顯著豐度差異;品種JSZ與HBQ之間僅有Hypomontagnella存在顯著豐度差異。

3 ?討論

本研究在以往研究的基礎(chǔ)上，以不同地區(qū)、不同品種白木香結(jié)香部位為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)真菌ITS1區(qū)域進(jìn)行高通量測(cè)序分析，探究結(jié)香部位真菌物種多樣性差異，為真菌高效人工促香技術(shù)、加快沉香生產(chǎn)速度提供理論依據(jù)。高通量測(cè)序得到白木香結(jié)香部位樣本中共4門(mén)、18綱、61目、29科、189屬、231種真菌。

通過(guò)對(duì)東莞和茂名地區(qū)普通品種結(jié)香樣本中真菌物種多樣性進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：（1）相同環(huán)境下，同種白木香不同高度結(jié)香位點(diǎn)真菌類(lèi)群豐度存在差異，但菌群結(jié)構(gòu)極為相似，C1組不同樣本真菌組成結(jié)構(gòu)相似，此結(jié)果與Liu等的結(jié)果一致;（2）不同區(qū)域環(huán)境中，同種白木香結(jié)香部位真菌群落之間差異非常顯著，區(qū)域生境差異可能是導(dǎo)致結(jié)香部位真菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要因素之一。C1與C2中，Neurospora、Aspergillus和Hermatomyces屬真菌的豐度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著差異，特別是Neurospora在C2組中為優(yōu)勢(shì)物種，豐度占比達(dá)到61.2%。根據(jù)基因ITS序列鑒定，Neurospora屬真菌主要為Neurospora crassa Shear & B.O. Dodge。

Neruospora crass隸屬于子囊菌門(mén)、糞殼菌綱、糞殼菌目、糞殼菌科，該菌是天然的纖維素快速降解菌，可以快速降解木質(zhì)纖維素，并具有利用木糖、纖維二糖、寡糖等組分生成乙醇及木糖醇的能力，是研究絲狀真菌纖維素酶表達(dá)分泌和木質(zhì)纖維素降解機(jī)制的模式真菌[26-27]，同時(shí)在工業(yè)生產(chǎn)上也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。該菌對(duì)纖維素的快速降解能力已經(jīng)得到了廣泛的認(rèn)可，其纖維素酶產(chǎn)率與著名的瑞氏木霉（Trichoderma）的纖維素酶產(chǎn)率相近[27-28]。這種降解能力預(yù)示了其對(duì)白木香受傷部位的刺激能力極強(qiáng)，可促進(jìn)白木香的抗逆性反應(yīng)并結(jié)香。以往并沒(méi)有該菌促進(jìn)白木香結(jié)香的研究，本研究首次揭示了茂名普通品種結(jié)香部位中該菌的顯著優(yōu)勢(shì)地位。目前，普通品種的白木香在廣東廣西等地方廣泛種植，該菌的進(jìn)一步深入研究對(duì)人工結(jié)香的研究具有重要的意義。

對(duì)茂名地區(qū)4個(gè)不同品種白木香結(jié)香部位的真菌多樣性進(jìn)行比較分析，揭示不同品種白木香結(jié)香部位真菌組成差異明顯，但Fusarium、Corynespora、Roussoella、Kockovaella、Acrocalymma、Hypomontagnella和Bannoa等7屬真菌在易結(jié)香品種中廣泛分布且具有較高的豐度，普通品種中分布較少且豐度極低（圖2，圖5）。特別是在易結(jié)香品種中，F(xiàn)usarium屬真菌在XGY中為優(yōu)勢(shì)屬，其豐度占比高達(dá)77.6%;Fusarium屬（Hypocreales目）及未鑒定的unidentified_ o_Hypocreales目真菌在HBQ中占比最高，合計(jì)占比50.8%（20.1%和30.7%）;Hypomontagnella屬真菌為JSZ結(jié)香部位中的優(yōu)勢(shì)真菌，豐度占比達(dá)52.4%。Fusarium和Hypomontagnella屬真菌的顯著優(yōu)勢(shì)可能與易結(jié)香特性顯著相關(guān)。

Fusarium隸屬于子囊菌門(mén)、糞殼菌綱、肉座菌目、叢赤殼科，該屬已被證實(shí)是一類(lèi)白木香內(nèi)生真菌，主要分布在白木香腐木部分，特別是腐皮鐮刀菌Fusarium solani （Mart.） Sacc.，已有多項(xiàng)研究證實(shí)該真菌能夠與白木香形成互惠互利關(guān)系，實(shí)現(xiàn)與白木香的協(xié)同進(jìn)化，同時(shí)該屬真菌的部分次級(jí)代謝產(chǎn)物還是沉香的特征性成分，如色酮類(lèi)化合物[29-31]。使用該屬真菌刺激，可誘導(dǎo)白木香代謝更加旺盛，加速誘導(dǎo)白木香結(jié)香，油脂積累時(shí)間短且量大。

Hypomontagnella隸屬于子囊菌門(mén)、糞殼菌綱、炭角菌目、炭團(tuán)菌科，基于形態(tài)學(xué)特征和系統(tǒng)發(fā)育分析，該屬自炭團(tuán)菌屬（Hypoxylon）分離，于2018年被建立為新屬[32]。該屬與炭團(tuán)菌屬親緣關(guān)系相近，是一種林木致病菌，可引起植物的潰瘍病，特別是Hubbes于1964年首次報(bào)道了炭團(tuán)菌毒素的存在，在潰瘍病的發(fā)展中起到關(guān)鍵作用[33]。炭團(tuán)菌毒素可以顯著抑制寄主病斑處瘤狀愈傷組織的形成，對(duì)植物受傷害后的影響非常強(qiáng)烈[34]。本研究首次在易結(jié)香品種JSZ結(jié)香部位中發(fā)現(xiàn)Hypomontagnella屬真菌，且該屬為顯著優(yōu)勢(shì)物種，豐度占比達(dá)到52.4%，據(jù)此推斷，該屬真菌在白木香受傷結(jié)香的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，Hypomontagnella屬真菌在白木香人工結(jié)香技術(shù)的開(kāi)發(fā)中具有重要的開(kāi)發(fā)潛力。

4 ?結(jié)論

真菌刺激已被證明是一種有效的方法促進(jìn)白木香結(jié)香，多種真菌已被證明可以顯著促進(jìn)沉香的形成，然而，生境差異、不同品種結(jié)香特性和真菌分布之間關(guān)系仍然是個(gè)未解的謎題。本研究結(jié)果表明：相同生境條件下，同種白木香不同高度結(jié)香位點(diǎn)真菌組成結(jié)構(gòu)非常相似，但不同真菌的豐度存在差異;不同區(qū)域生境下，相同品種結(jié)香部位真菌群落組成結(jié)構(gòu)存在顯著差異，生境差異可能是導(dǎo)致結(jié)香部位真菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要因素之一;同一區(qū)域生境下，不同品種白木香結(jié)香部位的真菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，品種差異可能是導(dǎo)致白木香結(jié)香部位真菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要因素之一，同時(shí)特有真菌類(lèi)群的分布也可能是影響白木香結(jié)香特性的關(guān)鍵。不同生境下白木香結(jié)香中發(fā)揮主要刺激作用的真菌并不相同;不同品種沉香形成過(guò)程中可能有不同的真菌在發(fā)揮主導(dǎo)作用。因此，在利用真菌刺激白木香結(jié)香的過(guò)程中，要因地制宜，根據(jù)不同的生境條件和白木香品種來(lái)選擇最適的真菌。

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責(zé)任編輯：崔麗虹