海南桑樹青枯病病原菌鑒定及其分子鑒定

婁德釗 武華周 盧芙萍 耿濤 涂娜娜 王樹昌

摘 ?要：桑樹青枯病是由青枯雷爾氏菌引起的細菌性病害，熱帶、亞熱帶地區(qū)發(fā)病嚴重，嚴重影響蠶桑產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。雷爾氏菌不同種間致病力和宿主各不相同，其防治策略也相應(yīng)不同，準確地分離鑒定病原菌是青枯病有效防控的先決條件。本研究采集、分離了海南省瓊中縣桑青枯病發(fā)病桑園（‘桂桑優(yōu)62’）桑樹根部、莖部病原菌，并通過致病性、生理小種、生化變種測定，結(jié)合16S rDNA、特異性引物、復(fù)合PCR檢測體系、序列變種等分子鑒定方法初步確定了病原菌的種類和分類地位。結(jié)果表明，引發(fā)海南省瓊中縣桑青枯病的病原菌屬于青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）、生理小種5（race 5）、生化變種Ⅴ（biovar Ⅴ），病原菌遺傳進化分析結(jié)果顯示病原菌屬演化型Ⅰ（phylotype Ⅰ）即亞洲分支菌株，序列變種12（sequevar 12）。這些結(jié)果將為海南桑青枯病的有效防控奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：桑樹青枯病;病原鑒定;雷爾氏菌;分子鑒定;系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號：S888.71 ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： Bacterial wilt of mulberry is a bacterial disease caused by Ralstonia solanacearum. It is serious in tropical and subtropical areas， which restricts the development of sericulture industry. The pathogenicity and host of R. solanacearum are different from each other， and the control strategy is also different. Accurate isolation and identification of the pathogen is the prerequisite for the effective control of bacterial wilt. In this study， we collected and isolated the pathogenic bacteria of mulberry （‘Guisangyou 62’） in Qiongzhong County， Hainan Province. The strains were selected and tested for pathogenicity， race and biovar， combined with 16S rDNA molecular identification， specific primers， multiplex PCR detection system and sequence variation， and with phylogenetic analysis. All the three strains were R. solanacearum. According to the traditional classification the pathogen belongs to physiological race 5 and biovar V. The genetic evolution of the pathogen was further analyzed by molecular biology methods. The pathogen belonged to phylotype I （the Asiaticum division）， sequevar 12. The results would lay a foundation for the effective control of mulberry bacterial wilt in Hainan.

Keywords： Morus alba L. bacterial wilt; pathogen identification; Ralstonia solanacearum; molecular identification; phylogeny

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.027

桑樹（Morus alba L.）是一種重要的經(jīng)濟作物，桑葉、桑葚、桑根、桑枝均可入藥，桑葉不僅是家蠶飼料，而且可以制成桑茶、桑葉菜、桑葉粉及桑葉飲料等，被列入“既是食品又是藥品的物品”名單。桑樹種植面積廣，朝鮮、日本、蒙古、中亞各國、歐洲、東南亞等地以及非洲均有栽培。桑樹栽培起源于中國，長期以來種植于我國長江、黃河中下游地區(qū);隨著“東桑西移”“北桑南移”，我國桑蠶重心逐漸向亞熱帶和熱帶地區(qū)發(fā)生轉(zhuǎn)移[1]。海南島地處108°37′～ 118°03′ E，18°10′～20°10′ N，氣候?qū)贌釒Ъ撅L季候，年平均氣溫22 ℃～26 ℃，年均降水量2000～2400 mm，桑樹全年生長，與其他地區(qū)相比，海南的蠶桑產(chǎn)業(yè)擁有得天獨厚的地理優(yōu)勢[1]，近年來種植面積不斷擴大[2]。

青枯雷爾氏菌（Ralstonia.solanacearum）寄主范圍廣泛，能夠引起植物的青枯癥狀，主要表現(xiàn)為，初期上部葉片迅速卷曲、萎蔫，而后整株植株葉片卷曲、萎蔫，萎蔫葉片仍為青色，最終導(dǎo)致整株植株枯死，在多種作物上造成巨大的經(jīng)濟損失[3]。青枯菌的鑒定主要依據(jù)菌落形態(tài)鑒定（TTC平板劃線），然后根據(jù)青枯菌生理生化性質(zhì)劃分為生理小種（race）與生化變種（biovar）;Fegan等[4]提出了演化型分類框架，將青枯菌劃分為種（species）、演化型（phylotype）、序列變種（sequevar）、克?。╟lone）4個不同水平的分類單元，種（species）根據(jù)特異性引物759/760 PCR擴增結(jié)果確定[5];演化型（phylotype）以ITS區(qū)設(shè)計的演化型復(fù)合PCR檢測體系確定[6];根據(jù)青枯菌種部分內(nèi)源葡聚糖酶基因（endoglucanase， egl）同源性序列確定序列變種（sequevar）[6];用基因組指紋方法（AFLP、re-PCR）確定克?。╟lone）[4]。

國內(nèi)外對桑樹青枯病的研究主要在病原菌生理小種、生化變種鑒定、病原菌檢測等方面，分子水平鑒定及種內(nèi)劃分報道較少，而有關(guān)海南省熱區(qū)桑樹青枯病病原菌未見報道。準確區(qū)分病原菌地理起源、種內(nèi)分類，有利于病害的精準防控，因此本研究通過致病性、生理小種、生化變種測定，結(jié)合16S rDNA、特異性引物、復(fù)合PCR檢測體系、序列變種等分子鑒定方法，對海南省桑青枯病病原進行分離鑒定，并確定病原菌種內(nèi)分類及演化型，為桑青枯病的有效防控提供前提條件。

1 ?材料與方法

1.1 ?病害調(diào)查、樣品采集和病原菌分離

2019年4月在海南省瓊中縣營根鎮(zhèn)（19o02′ N， 109o76′ E）調(diào)查并采集典型桑青枯病發(fā)病植株（‘桂桑優(yōu)62’），觀察發(fā)病癥狀、壞死植株根莖部木質(zhì)部形態(tài)等，記錄發(fā)病情況，計算發(fā)病率，并將病樣帶回實驗室分離鑒定病原菌。

參照Buddenhagen等[7]、方中達[8]的方法，將采集的根部組織沖洗干凈，剝?nèi)ケ砥?，用無菌水沖洗后，75%酒精消毒1 min，最后用無菌水沖洗3次，放入無菌管中，加入1 mL無菌水浸泡10 min。用TTC培養(yǎng)基[每升TTC培養(yǎng)基包含酸水解酪蛋白1.0 g、蛋白胨10.0 g、葡萄糖5.0 g、瓊脂17.0 g，pH=7.0，121 ℃滅菌20 min，待冷卻至55 ℃后，添加1% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑溶液（TTC）5 mL]、M-SMSA培養(yǎng)基（每升S-SMSA培養(yǎng)基含酸水解酪蛋白1.0 g、甘油5.0 mL、蛋白胨10.0 g、瓊脂17.0 g，pH=7.0，121 ℃滅菌20 min，待冷卻至55 ℃后，加入1%結(jié)晶紫5 mL、1%多粘菌素β硫酸鹽10 mL、1%桿菌肽2.5 mL、1%氯霉素0.5 mL、1%青霉素0.5 mL、1%放線菌酮10 mL和1%TTC 5 mL），對致病菌進行分離、純化。純化獲得的菌株分別加入終濃度為20%的甘油中于–80 ℃保存。另取一部分純化菌株，加入無菌水于常溫保存。實驗共分離到6個菌株，選取3株代表性菌株（MRS1、MRS2、MRS3）進行后續(xù)實驗。

1.2 ?桑青枯菌致病性測定

將常溫保存的純化菌株在TTC培養(yǎng)基上劃線活化，室溫下培養(yǎng)48 h后，挑取單一菌落，放入LB液體培養(yǎng)基，置于28 ℃、150 r/min搖床中;24 h后采用稀釋平板法，與紫外分光光度計法，根據(jù)OD600吸光光度值繪制標準曲線，將菌懸液濃度稀釋至1×108 CFU/mL。對照菌株為R. solanacearum 448，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所提供。

接種選用1年生5～7葉桑種子苗（‘桂桑優(yōu)62’）。桑種子苗是將桑樹種子用清水洗凈，放入75%酒精中消毒2 min后，用無菌水清洗3次，用30 ℃無菌水清洗3次，用無菌土進行培育所得。選取長勢均勻、健康桑種子苗，減掉根部4～5根側(cè)根，以每次5 mL濃度為1×108 CFU/mL的菌懸液澆灌至根部，連續(xù)澆灌3 d，每天1次。以接種空白的LB營養(yǎng)液為對照，每個處理接種15株桑苗。接種后觀察記錄發(fā)病情況，收集發(fā)病植株根部組織，按1.1方法再次對致病菌分離純化并保存。

1.3 ?生理小種的測定

參照Buddenhagen等[7， 9-10]的研究方法。采用注射接種法，將濃度為1×108 CFU/mL的代表菌株菌液分別接種桑（‘桂桑優(yōu)62’）、茄子（紫紅長茄）、番茄（珍珠番茄）、辣椒（‘豐椒18’）、煙草（本生煙）、姜（海南本地肉姜）、香蕉（巴西蕉），測定桑青枯菌對這些植物的致病性。桑、茄子、番茄、辣椒分別接種30株，煙草、番茄、香蕉、姜分別接種15株，每株接種30 μL。

1.4 ?生化變種的鑒定

參照方中達[8]、Hayward[11]的方法，配制3種雙糖（乳糖、麥芽糖、纖維二糖）、3種己醇（甘露醇、山梨醇、甜醇）的10%母液，經(jīng)滅菌后添加至基礎(chǔ)培養(yǎng)基至終濃度1%，調(diào)節(jié)pH至7.0后添加溴百里酚藍指示劑。菌株活化后接種于此培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)10 d，記錄觀察結(jié)果，確定生化變種分類。

1.5 ?病原菌的分子鑒定及分子特征性分析

1.5.1 ?青枯菌基因組DNA的提取 ?用細菌基因組DNA提取試劑盒提取青枯菌基因組DNA，試劑盒由QIAGN公司提供的QIAamp DNA Mini Kit。提取的DNA OD260/280比值在1.82.0之間，提取后的DNA放于–20 ℃冰箱中保存。

1.5.2 ?青枯菌16S rDNA、特異性引物PCR、演化型鑒定 ?通過細菌通用引物和青枯雷爾氏菌特異性引物（表1），應(yīng)用TIANGEN的Taq DNA polymerase試劑盒進行PCR擴增，反應(yīng)體系50 μL，反應(yīng)程序參照表1，其中模板DNA 6 pmol，引物各12 pmol。PCR儀型號Bio-RAD T100。擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳后，通過Biorad凝膠成像儀觀察結(jié)果。擴增后16S rDNA呈單一條帶的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。同時參照Fegan和Prior方法采用復(fù)合引物PCR擴增，方法參照表1文獻，反應(yīng)體系為50 μL。取7 μL反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度1%，根據(jù)條帶確定青枯菌演化型。

1.5.3 ?青枯菌序列變種鑒定 ?應(yīng)用Endo-F、Endo-R擴增代表性菌株egl基因，擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳后，呈單一條帶的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。根據(jù)Xu等[15]報道的序列變種菌株與測試菌株進行序列變種分析。數(shù)據(jù)分析應(yīng)用軟件MEGA7.0，采用鄰接法（neighbor-joining）Bootstrap 1000次進行聚類分析，構(gòu)建進化樹，確定測試菌株序列變種的分類。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?病原菌的分離和培養(yǎng)

田間觀察表明：植株上部葉片首先發(fā)病，快速失水萎蔫，繼而全株葉片萎蔫，植株枯死，呈青枯狀（圖1A）。病株根部橫截面觀察表明：維管束組織變褐、壞死，顯微鏡觀察到有大量細菌呈霧狀噴出，呈現(xiàn)典型的感染青枯病植株后的“溢菌”現(xiàn)象（圖1B）。從發(fā)病植株和根際土壤中分類獲得6個獨立細菌株系，其中3個株系在TTC平板上的菌落形態(tài)不規(guī)則，中間隆起;顏色呈粉紅或淡紅色，邊緣白色;菌落表面光滑、濕潤具有流動性，具備青枯雷爾氏菌的典型特征（圖1C）。在N-SMSA培養(yǎng)基上進一步觀察發(fā)現(xiàn)，這3個株系菌落形態(tài)同樣不規(guī)則，顏色呈紫紅色，表面光滑濕潤且具有流動性。革蘭氏染色表明該菌為革蘭氏陰性菌;電子顯微鏡觀察表明該菌呈桿狀、著生鞭毛，菌體大小為（0.46～0.87）μm × （1.02～2.13）μm（圖1D），據(jù)此初步判定，這3個株系為青枯雷爾氏菌。

2.2 ?致病性測定

將分離到的3個獨立菌株（MRS1、MRS2、MRS3）分別回接生長至5～7葉的桑種子苗。結(jié)果表明，接種7 d后植株開始出現(xiàn)萎蔫癥狀（圖2A）;10 d后部分葉片完全壞死并逐漸脫落;14 d后病株枯萎死亡。統(tǒng)計結(jié)果表明：MRS1的發(fā)病死亡率為85%，MRS2的發(fā)病死亡率為80%，MRS3的發(fā)病死亡率為93%，相應(yīng)的空白對照發(fā)病死亡率為0。進一步觀察表型發(fā)現(xiàn)，接種植株與田間桑樹發(fā)病癥狀表現(xiàn)一致，同時均能夠在接種植株中分離到接種菌株。由此認為，分離獲得的病原細菌是桑青枯病的致病菌，且具有較強致病力。

2.3 ?生理小種鑒定

將分離到的3個代表性菌株（MRS1、MRS2、MRS3）室內(nèi)注射接種7種寄主植物，結(jié)果表明，3株菌株能夠侵染桑樹且具有強致病力，3株菌株侵染番茄、茄子，但其致病力較弱，且并不致死;除MRS2菌株外均可侵染辣椒，但致病力較弱;3

株菌株均不侵染煙草、姜、香蕉。對照菌株Rs448分離自番茄，可侵染番茄、茄子、辣椒，對桑樹、煙草、姜、香蕉無致病力（表2）。根據(jù)茄科雷爾氏菌生理小種分類標準[7， 9-10]，從桑樹分離到的3株測試菌株屬于生理小種5（race 5），對照菌株Rs448屬于生理小種1（race 1）。

2.4 ?生化變種鑒定

3種雙糖、3種己醇利用實驗結(jié)果表明：3個菌株可以有效利用麥芽糖、纖維二糖、乳糖和甘露醇，但不可以有效利用山梨醇和甜醇;且青枯菌利用糖、醇效率不同，其中乳糖在接種7 d后才發(fā)生顏色變化（表3），根據(jù)Hayward提出的生化變種劃分方法[16]，初步鑒定本研究分離到的桑青枯病菌屬于生化變種Ⅴ。

2.5 ?病原菌的分子生物學鑒定

以細菌通用引物擴增3個代表性菌株及對照菌株，均能擴增出1500 bp左右的特異性片段（圖3A），序列拼接后全長為1430 bp，經(jīng)BLAST序列比對結(jié)果顯示，序列與標準菌株同源率為99%。應(yīng)用R. solanacearum的特異性引物對3個代表性菌株P(guān)CR擴增結(jié)果顯示，引物759/760能夠擴增出280 bp左右的單一條帶（圖3B），fliC-F/R能夠擴增出400 bp左右的單一條帶（圖3C），結(jié)果證明測試菌株屬于R. solanacearum復(fù)合種。

2.6 ?病原菌序列變種分析

根據(jù)Fegan等[4]提出的茄科雷爾氏菌演化型分類方案，采用復(fù)合PCR檢測體系，3個菌株均可同時擴增得到144 bp和280 bp 2條特異片段（圖4B），其中280 bp片段為茄科雷爾氏菌特異性擴增條帶，144 bp片段為演化型Ⅰ（亞洲型）的特異性擴增條帶。

用引物對Endo-F、Endo-R擴增病原菌內(nèi)切葡聚糖酶基因（egl），菌株MRS1、MRS2、MRS3均能擴增出840 bp左右的條帶（圖4A），測序后與從GenBank中下載的青枯菌菌株的egl基因序列進行聚類分析。結(jié)果顯示（圖5）菌株MRS1（MW294008）、MRS2（MW294009）、MRS3（MW294010）屬于亞洲型（phylotypeⅠ），序列變種12（sequevar 12）。

3 ?討論

青枯病的發(fā)生嚴重制約熱帶地區(qū)蠶桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，桑園發(fā)病率最高可達80%[17]，導(dǎo)致經(jīng)濟損失嚴重。本研究從海南省瓊中縣發(fā)生青枯病的桑樹植株莖和根中分離致病菌，經(jīng)鑒定確定為變形菌門（Proteobacteria）、伯克氏菌科（Burk?holderiales）、雷爾氏菌屬（Ralstonia）。

根據(jù)青枯菌對不同寄主侵染能力的差異，提出了青枯菌生理小種（race）的劃分[7， 9-10]，小種1能夠侵染煙草、茄科等多種作物;小種2對香蕉、海里康等植物具有較強的侵染力;小種3主要侵染馬鈴薯及其他茄科植物;亞洲姜上分離到的青枯菌被劃分為小種4;1983年何禮遠等[17]發(fā)現(xiàn)了對桑樹具有強致病力的青枯菌菌株，并將其劃分為小種5。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)侵染桑樹的生理小種屬于1和5，He[10]發(fā)現(xiàn)對桑樹具有強致病力菌株，并將其劃分為生理小種5，曹夢琪等[18-19]通過qPCR、PMA-qPCR等技術(shù)建立了青枯菌生理小種5的快速檢測及活體檢測方法。而賴文姜等[20]在廣東分離到的菌株對茄科作物致病力強，但不侵染辣椒，屬于生理小種1，這與呂志強等[21]在浙江分離到的菌株研究結(jié)果一致。本研究通過注射接種法從海南省瓊中縣分離到的3株青枯雷爾氏菌菌株均屬于生理小種5。

Hayword[16]根據(jù)青枯菌對3種雙糖和3種己醇的氧化能力，將青枯菌分為5個生化變種（biovar）。本研究通過3種雙糖（麥芽糖、纖維二糖、乳糖）和3種己醇（甘露醇、山梨醇和甜醇）氧化產(chǎn)酸能力的不同，證明引起海南省桑樹青枯菌的菌株為茄科雷爾氏菌生化變種Ⅴ。曾憲銘等[22]認為桑樹生化變種屬于Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ，而呂志強等[21]在不同桑樹組織分離到的青枯菌大多屬于生化變種Ⅴ，部分屬于生化變種Ⅲ，并且發(fā)現(xiàn)相同組織分離到菌株生化變種可能不一致;華靜月等[23]同樣發(fā)現(xiàn)桑青枯菌生化變種大部分屬于V，只有M6菌株屬于生化變種Ⅲ;但苗雪等[24]在廣東省不同縣市分離到的3株菌株均屬于生化變種Ⅲ。表明在某些情況下桑青枯菌生化性狀可能極易變異，導(dǎo)致同一樣地、同一植株、同一組織內(nèi)青枯菌生化變種可能不同。

傳統(tǒng)的分類框架不能體現(xiàn)青枯菌地理起源與遺傳進化[25]。Fegan等[4]提出了演化型分類框架，確定了種、演化型、序列變種及克隆4個分類單元。青枯菌的egl基因主要編碼內(nèi)切葡聚糖酶[26]，同時內(nèi)切葡聚糖酶作為一種胞外多糖，能夠在植物細胞內(nèi)分解纖維素，對于病原菌致病性有著重要作用。苗雪等[24]在廣東感病桑園分離到的3株菌株屬于演化型Ⅰ，這與本研究結(jié)果一致。Xu等[15]認為國內(nèi)桑青枯菌屬于序列變種12、48;但序列變種48菌株同時也能夠引起馬鈴薯、番茄和姜[27]等植物的青枯病。本研究通過egl部分基因序列與多系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，3個菌株均與R292、M4聚類于同一分支，同時與egl基因序列同源性達到99%，推斷海南省瓊中縣桑青枯菌屬于序列變種12;同時與苗雪等[24]分離到的菌株G12-9聚類于同一分支，屬于同一序列變種;但海南省桑青枯病菌是否存在序列變種48，仍需進一步驗證。

本研究系統(tǒng)地鑒定了桑樹青枯病病原菌，鑒定結(jié)果為生理小種5（rice 5）、生化變種Ⅴ（biovarⅤ）、演化型Ⅰ（phylotypeⅠ）、序列變種12（sequevar 12）。

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責任編輯：謝龍蓮