QuEChERS-dSPE-UPLC-MS/MS法篩查動物源性食品中9種獸藥殘留

◎ 周瑞錚，林秋鳳，易華娟，張樹權(quán)，陳錦杭，蔡潤南

（東莞市食品藥品檢驗所，廣東 東莞 523808）

肉類和肉制品在人們飲食中扮演了重要的角色。預(yù)計未來10年，全球肉類產(chǎn)量和人均肉類攝入量將會持續(xù)增加，豬肉和雞肉消費(fèi)量將大幅上升，占全球肉類利用率的36%和35%，其次是牛肉（22%）和羊肉（4%）[1]。我國肉類及其制品消耗占比較大，獸藥的濫用也逐漸發(fā)展為不能忽視的食品安全問題。通過對動物源食品不合格項目分析，發(fā)現(xiàn)畜禽肉中氯霉素、恩諾沙星等獸藥違規(guī)使用問題較為突出[2]，水產(chǎn)制品中孔雀石綠濫用較多。動物源性產(chǎn)品獸藥殘留問題關(guān)乎公眾健康，如氯霉素抑制人體骨髓造血機(jī)能，產(chǎn)生粒細(xì)胞缺乏癥、再生障礙性貧血等毒副作用[3-5]，沙星類藥物會損害胃腸功能及中樞神經(jīng)，影響兒童軟骨生長發(fā)育[6-8]，β-受體激動劑影響人體血液循環(huán)，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血和心腎功能損害[9-11]，孔雀石綠及其代謝物則具有致癌、致畸等毒副作用[12-14]。如今，獸藥殘留問題已成為全球的焦點(diǎn)，大多數(shù)國家和地區(qū)加強(qiáng)了對動物源性產(chǎn)品中獸藥殘留的監(jiān)管，并制訂了相關(guān)法規(guī)制度。我國在2019年發(fā)布的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）規(guī)定喹諾酮類獸藥最高殘留限量（Maximum Residue Limit， MRL）為100 μg·kg-1，整頓辦函〔2010〕50號、整頓辦函〔2011〕1號、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號中規(guī)定不得使用克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、氯霉素、孔雀石綠。這些常見獸藥殘留項目檢驗方法有液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等[15-18]，現(xiàn)行的檢驗標(biāo)準(zhǔn)有GB/T 21312—2007、GB/T 19857—2005、GB/T22338—2008和GB/T 22286—2008，但這些標(biāo)準(zhǔn)前處理步驟相對復(fù)雜，檢驗效能較低，為降低檢驗成本，提高檢驗效率，設(shè)計一種高效、簡潔、靈敏度高、可同一時間檢驗多種類別獸藥的方法十分必要。QuEChERS方法具有操作簡便、快速高效、成本低廉等特點(diǎn)[19-22]，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，能同時檢測多種獸藥殘留，節(jié)省大量時間及實(shí)驗成本，便于在食品檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行樣品初步篩查。本文建立了動物源食品中常見的4大類（恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟甲喹、孔雀石綠、隱色孔雀石綠、克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和氯霉素）共9種獸藥殘留的QuEChERS檢測方法，滿足實(shí)際工作的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料：新鮮肉類（畜肉，禽肉，水產(chǎn)品）、加工肉制品（腌制品，醬鹵肉），來自東莞市學(xué)校食堂及肉制品生產(chǎn)廠家。

試劑：甲醇、乙腈、正己烷（色譜純，德國默克公司）；甲酸、乙酸銨（色譜純，中國天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；CNW dSPE獸藥提取包、凈化管(上海安譜實(shí)驗科技股份有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：氯霉素（中國計量科學(xué)研究院）；氯霉素-D5、恩諾沙星、氟甲喹、沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺（北京曼哈格生物科技有限公司）；環(huán)丙沙星、孔雀石綠草酸鹽、隱色孔雀石綠（德國Dr.Ehrenstorfer公司）；孔雀石綠-D5、隱色孔雀石綠-D6、克倫特羅-D9（德國Witegar公司）；沙丁胺醇-D3（加拿大CDN公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

LC30AD超高效液相色譜儀（日本島津公司）；SCIEX 5500質(zhì)譜聯(lián)用儀(配ESI離子源，美國AB公司)；CPA225D電子分析天平（感量0.000 01 g，德國賽多利斯）；BSA223S電子分析天平（感量0.001 g，德國賽多利斯）；3K 15離心機(jī)（9 500 r·min-1，德國SIGMA）；超純水機(jī)（Milli-Q Reference，德國默克）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別精密稱取適量氯霉素、孔雀石綠、隱色孔雀石綠，使用乙腈溶解并定容，恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟甲喹、克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺使用甲醇溶解并定容，制成濃度為1.0 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲于-20 ℃。臨用時，用體積分?jǐn)?shù)為50%乙腈水溶液稀釋至孔雀石綠、氯霉素、β-受體激動劑質(zhì)量濃度為10.0 ng·mL-1，喹諾酮質(zhì)量濃度為200.0 ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

分別精密稱取適量氯霉素-D5、孔雀石綠-D5、隱色孔雀石綠-D6使用乙腈溶解并定容，克倫特羅-D9、沙丁胺醇-D3使用甲醇溶解并定容，孔雀石綠-D5、隱色孔雀石綠-D6、克倫特羅-D9、沙丁胺醇-D3定容至100 μg·mL-1，氯霉素-D5定容至1.00 μg·mL-1，制成單一內(nèi)標(biāo)儲備溶液。臨用時，用50%乙腈水稀釋至氯霉素-D5、孔雀石綠-D5及隱色孔雀石綠-D6質(zhì)量濃度為100 ng·mL-1，β-受體激動劑類質(zhì)量濃度為10.0 ng·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)工作溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備

（1）提取。稱取粉碎試樣約2 g（精確到0.01 g）于50 mL聚丙烯離心管中，加入1袋獸藥提取鹽包，50 μL混合內(nèi)標(biāo)物工作溶液，加入15 mL 1%甲酸乙腈后劇烈振搖，使樣品分散，渦旋5 min，超聲10 min，8 000 r·min-1離心5 min，重復(fù)提取2次，合并兩次提取液備用。

（2）凈化。將提取液轉(zhuǎn)移至獸藥凈化管，渦旋5 min，8 500 r·min-1離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至100 mL棕色雞心瓶，40 ℃水浴減壓旋蒸至近干，加入1 mL 50%乙腈水復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)濾膜后，供液相-質(zhì)譜測定。

1.3.3 色譜及質(zhì)譜條件

（1）色譜條件。色譜柱：Boston， Green ODSAQ C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；流速：0.2 mL·min-1；進(jìn)樣體積：2.0 μL；柱溫：35 ℃；流動相A：甲醇，流動相B：0.1%甲酸-1 mmol·L-1乙酸銨，洗脫梯度見表1。

表1 液相洗脫梯度表

（2）質(zhì)譜條件。離子源：H-ESI；掃描模式：正負(fù)離子同時掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；霧化氣（GS1）：379.2 kPa（氮?dú)猓?；輔助氣（GS2）：379.2 kPa（氮?dú)猓?；氣簾氣（CUR）：206.8 kPa（氮?dú)猓粐婌F電壓（IS）：5 500 V、-4 500 V；去溶劑溫度（TEM）：350 ℃；碰撞氣（CAD）：55.16 kPa（氮?dú)猓?。離子對優(yōu)化結(jié)果見表2。

表2 定性離子、定量離子、碰撞能量、去簇電壓表

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取溶劑的優(yōu)化

本文中涉及的獸藥包含氟喹諾酮類、三苯甲烷類、β-受體激動劑類和氯霉素類，乙腈對上述幾類獸藥均有較好的提取效果，還可以有效去除蛋白，是較為理想的溶劑，但有研究表明氟喹諾酮類具有酸堿兩性性質(zhì)，在酸性或堿性條件下的提取效率更高，因此對乙腈、0.1%甲酸-乙腈，1%甲酸-乙腈進(jìn)行比較[22]。3種提取溶劑的回收率結(jié)果如圖1所示，綜合考慮認(rèn)為1%甲酸-乙腈對各組分的提取效果均較好，最終選擇1%甲酸-乙腈作為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑回收率對比圖

2.2 流動相的優(yōu)化

為了縮短檢測時間，優(yōu)化色譜峰形，本研究對常用的流動相體系進(jìn)行了比較。文獻(xiàn)報道顯示[23-25]，動物源性食品獸藥殘留常用甲醇/水、乙腈/水體系作為流動相進(jìn)行檢測。本研究對這兩個體系分別進(jìn)行試驗，比較在乙腈/水體系和甲醇/水體系對9種獸藥、5種內(nèi)標(biāo)物化合物的分離效果、峰型的影響。乙腈-水體系大部分物質(zhì)出峰時間集中在4～7 min，個別在9 min左右；甲醇-水體系則更加分散，3～9 min均有物質(zhì)出峰，分離效果更好。但在不添加緩沖鹽和調(diào)節(jié)pH的甲醇-水和乙腈-水體系下，部分組分的峰形較差，出現(xiàn)拖尾等情況。經(jīng)試驗，添加0.1%甲酸和1 mmol·L-1乙酸銨有利于提高分離度，對檢測組分的峰形有明顯改善。因此，選用甲醇、0.1%甲酸-1 mmol·L-1乙酸銨作為流動相。

2.3 線性關(guān)系、回收率、精密度

如表3所示，各組分在0.1～100 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.998。以定性離子的3倍信噪比(S/N=3)對應(yīng)的檢測限為檢出限（Limit of Detection，LOD），測定各組分的檢出限。本研究以檢出限的1、5、10倍作為加標(biāo)水平，對空白豬肉基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)，每個水平分別進(jìn)行6次平行試驗，如表3所示，各組分的檢出限在0.1～2.0 ng·mL-1，滿足國家標(biāo)準(zhǔn)的檢測需求。各組分的平均加標(biāo)回收率為69.2%～115.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～12.7%，該方法回收率、精密度均符合《實(shí)驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢驗》（GB/T 27404—2008）附錄F的檢測方法確認(rèn)的技術(shù)要求[16]。

表3 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、回收率表

2.4 實(shí)際樣品測定結(jié)果

運(yùn)用本研究建立的方法與標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行結(jié)果比對

（GB/T 21312—2007、GB/T 22286—2008、GB/T 19857—2005、GB/T 22338—2008），結(jié)果表明，大部分組分的QuEChERS方法與標(biāo)準(zhǔn)測定方法結(jié)果偏差在20%～30%，而萊克多巴胺的檢測結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)方法則相對較低，推測是因為樣品處理時沒有進(jìn)行酶解，而萊克多巴胺與蛋白結(jié)合較為牢固。如果檢驗過程中對樣品進(jìn)行酶解，則需要較長的時間，效率低下不利于大批量篩查工作?，F(xiàn)今檢測儀器的靈敏度較高，即便只能提取部分萊克多巴胺，依然能滿足日常篩查的需求，因此，本方法適合動物源性食品中獸藥殘留的初步篩查。

3 結(jié)論

本研究建立了QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法篩查動物源性食品中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟甲喹、孔雀石綠、隱色孔雀石綠、克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、氯霉素共計9種獸藥殘留情況的分析方法，以1%甲酸乙腈作為溶劑，渦旋、超聲進(jìn)行提取，QuEChERS凈化后旋蒸濃縮，50%乙腈-水復(fù)溶。各組分在0.1～100 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R均大于0.998，平均加標(biāo)回收率在69.2%～115.4%，相對平均偏差為0.9%～12.7%，重復(fù)性好。該方法可以實(shí)現(xiàn)高通量處理，大大提高工作效率，為食品安全日常監(jiān)管提供了有效保障。