銅綠假單胞菌對乳制品中沙門氏菌檢測的干擾作用評價

◎ 燕如娟，劉芳玉

（飛鶴（甘南）乳品有限公司，黑龍江 齊齊哈爾 162100）

沙門氏菌屬腸桿菌科，革蘭氏陰性腸道桿菌，無芽孢，無莢膜，周身鞭毛，在自然界中分布廣泛，是一種最為常見的食源性致病菌。在世界各國的細(xì)菌性食物中毒中，有沙門氏菌引起的食源性食物中毒往往高居首位[1-2]，在我國有高達(dá)80%的食物中毒是由沙門氏菌所引起[3]，國內(nèi)外的很多食品安全相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中都有明確規(guī)定各類食品中均不得檢出沙門氏菌。因此，沙門氏菌的正確檢出對于保障居民飲食衛(wèi)生安全具有極其重要的現(xiàn)實意義。

現(xiàn)行的沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)檢測方法為傳統(tǒng)培養(yǎng)法，主要包括前增菌、選擇性增菌、選擇性平板分離、生化實驗和血清學(xué)分離鑒定5大步驟[4]。然而食品中往往存在大量雜菌影響沙門氏菌在選擇性平板的分離與鑒定。近年來對于沙門氏菌分離與鑒定過程中干擾菌的研究多聚焦于弗氏檸檬酸桿菌和奇異變形桿菌[5]，然而本實驗室在進(jìn)行沙門氏菌檢出能力測試時發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞桿菌對沙門氏菌的檢驗效果同樣可以產(chǎn)生極大干擾。在本實驗中，將銅綠假單胞菌作為干擾菌株，分別評價不同的前增菌時間下各品牌增菌液對沙門氏菌檢出效果的影響，為提高食品中沙門氏菌檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14028）、銅綠假單胞菌（ATCC 9027），均購自美國菌種保藏中心。

1.2 設(shè)備與材料

36.0 ℃恒溫培養(yǎng)箱，購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；42.0 ℃恒溫培養(yǎng)箱，購自德國Memmert；2～8 ℃冰箱，購自青島海爾集團(tuán)；臺式振蕩器，購自哈爾濱市東聯(lián)電子設(shè)備有限公司；電子天平（感量0.1 g），購自梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；無菌試管，購自黑龍江立高儀器設(shè)備有限公司；一次性移液管，1 mL（具0.01刻度），10 mL（具0.1刻度），購自NEST；無菌培養(yǎng)皿，購自廣東華粵集團(tuán)；一次性定量接種環(huán)，購自廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司；微量移液器，購自北京大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司；生物安全柜，購自哈爾濱市東聯(lián)電子設(shè)備有限公司；全自動微生物生化鑒定藥敏分析儀，購自美國BD公司。

1.3 培養(yǎng)基及試劑

緩沖蛋白胨水（BPW），分別購自品牌A、品牌B、某品牌C，四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、腦心浸液肉湯（BHI）培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯（NA）瓊脂、亞硫酸鉍（BS）瓊脂和沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基，所用培養(yǎng)基和試劑均按操作說明書進(jìn)行，使用前均通過GB 4789.28—2013規(guī)定的質(zhì)控測試。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌液制備

將凍存的鼠傷寒沙門氏菌和銅綠假單胞菌分別接種于10 mL BHI培養(yǎng)基中，36.0 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，用無菌生理鹽水將復(fù)蘇后的菌液梯度稀釋至10-7，分別吸取1 mL菌懸液涂布于NA平板和沙門氏菌顯色平板，36.0 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)。

1.4.2 樣本制備

各稱取25 g奶粉溶于225 mL不同品牌的BPW增菌液中，按表1所示分別向每份奶粉樣品中人工污染相應(yīng)劑量的沙門氏菌和銅綠假單胞菌，充分混勻。

表1 人工污染奶粉樣本沙門氏菌及銅綠假單胞菌接種量表

1.4.3 前增菌及選擇性增菌

將人工污染后的樣本置于36 ℃靜置培養(yǎng)10 h和18 h，分別吸取1 mL增菌液接種于10 mL TTB內(nèi)，于42.0 ℃培養(yǎng)24 h。同時，另取1 mL增菌液轉(zhuǎn)種于10 mL SC內(nèi)，36.0 ℃靜置培養(yǎng)24 h，進(jìn)行選擇性增菌。

1.4.4 選擇性平板分離

將使用不同品牌增菌液前增菌10 h和18 h的沙門氏菌污染樣本對應(yīng)的TTB、SC二次增菌液分別用直徑3 mm的接種環(huán)劃線接種于沙門氏菌顯色平板36.0 ℃培養(yǎng)24 h和BS平板，36 ℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行沙門氏菌的選擇性分離，同時觀察菌落形態(tài)。

1.4.5 生化鑒定

參照GB 4789.4-2016沙門氏菌檢測的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)挑取沙門氏菌顯色平板及BS平板上的典型特征菌落進(jìn)行生化鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門氏菌及銅綠假單胞菌在不同平板上生長特性比較

分別將復(fù)蘇后沙門氏菌及銅綠假單胞菌稀釋并涂布于NA平板和沙門氏菌顯色平板，進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)，結(jié)果如表2所示。結(jié)果證實銅綠假單胞菌在沙門氏菌顯色平板的回收效率顯著降低。

表2 沙門氏菌及銅綠假單胞菌在不同平板上生長特性比較表（單位：CFU）

2.2 不同品牌BPW增菌后，分離平板菌落形態(tài)及顏色對比

應(yīng)用不同品牌增菌液進(jìn)行前增菌并進(jìn)行選擇性增菌后，分離平板菌落形態(tài)無顯著差異，分離平板菌落形態(tài)及顏色有差異。應(yīng)用不同品牌的BPW，分別進(jìn)行10 h和18 h增菌，分離平板上的菌落也有所差異，見表3。

表3 樣本中沙門氏菌顯色平板菌落形態(tài)及顏色表

2.3 生化鑒定結(jié)果

將使用不同品牌增菌液前增菌10 h和18 h的沙門氏菌污染樣本對應(yīng)的TTB、SC二次增菌液分別劃線接種于沙門氏菌顯色平板及BS平板，待長出單菌落后挑取特征性菌落劃線接種于NA平板，36 ℃培養(yǎng)24 h后上機(jī)鑒定，鑒定結(jié)果見表4。

表4 樣本中沙門氏菌及銅綠假單胞菌生化鑒定結(jié)果表

2.4 沙門氏菌和銅綠假單胞菌在沙門氏菌選擇性平板上菌落形態(tài)比較

沙門氏菌和銅綠假單胞菌在沙門氏菌顯色選擇性平板上有些菌落雖具有相似的顯色情況，但銅綠假單胞菌菌落紫色較淡，菌落邊緣為淡色，多成無定形長。在BS平板上菌落形態(tài)具有明顯差異，詳見表5。

表5 沙門氏菌和銅綠假單胞菌在沙門氏菌選擇性平板上菌落形態(tài)比較表

3 結(jié)論與討論

本實驗參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）對人工污染不同濃度沙門氏菌及銅綠假單胞菌的無菌奶粉樣本進(jìn)行檢驗，使用NA平板和沙門氏菌顯色平板進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)，結(jié)果證實銅綠假單胞菌在沙門氏菌顯色平板的回收效率顯著降低。通過應(yīng)用不同品牌BPW對樣本進(jìn)行前增菌，探究了銅綠假單胞菌作為干擾菌株對沙門氏菌檢出效果的影響。結(jié)果表明應(yīng)用不同品牌的增菌液進(jìn)行前增菌，菌落形態(tài)無明顯差異，增菌效果略有不同，但均能夠檢出沙門氏菌陽性樣本。此外應(yīng)用品牌A增菌液進(jìn)行前增菌后，沙門氏菌顯色平板有顯著的藍(lán)綠色銅綠假單胞菌典型菌落長出，應(yīng)用品牌A增菌液與品牌C增菌液前增菌時間從10 h延長至18 h，分離后沙門氏菌平板上藍(lán)綠色菌落增多，兩者出現(xiàn)典型菌落的比例明顯降低，BPW為非選擇性培養(yǎng)基，當(dāng)干擾菌的含量明顯高于目標(biāo)菌時，這種放大效應(yīng)就會更明顯。研究表明前增菌時間過長會使沙門氏菌的分離效果下降，對沙門氏菌的檢出效果有一定的影響。相比于使用品牌A和品牌C增菌液進(jìn)行前增菌，使用品牌B增菌液進(jìn)行前增菌，最終沙門氏菌的檢出率更高。因此為保證沙門氏菌檢測的準(zhǔn)確性和提高檢出效率，在檢驗過程中，應(yīng)根據(jù)對樣品污染程度的估計，結(jié)合檢驗標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，合理選擇前增菌時間。