基于UHPLC-Orbitrap-MS/MS法分析青蒿鱉甲湯化學成分

韓鑫龍，成 欣，孫穎超，李雨桐，楊加順，張靜瑩，唐 玲*

(1.大連大學生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622；2.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣東 廣州 510515；3.大連三儀動物藥品有限公司，遼寧 大連 116036；4.南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510630；5.廣東醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 東莞 523808；6.廣東省中藥制劑重點實驗室/廣東省中藥制劑技術工程實驗室，廣東 廣州 510515)

青蒿鱉甲湯，最早出現(xiàn)于清代葉天士《臨證指南醫(yī)案·卷五·溫熱·熱陷血分王案》，后在溫病學家吳鞠通著的《溫病條辨·卷三·下焦篇·風溫》條文十二中又有記載。其藥方為青蒿、鱉甲、細生地、知母與丹皮，此方相比葉天士的來看，去淡竹葉，規(guī)范了用量，使方證配伍更為嚴謹切合，并冠以方名做出方論，青蒿鱉甲湯就是由此而來[1]。

青蒿鱉甲湯廣泛應用于臨床各科發(fā)熱癥候的病癥治療，除此之外對惡性腫瘤、泌尿系統(tǒng)疾病、更年期綜合征等也有較好的療效[2]。有關這一方劑的化學成分分析較為鮮見。因此，探明其化學成分對其藥效物質(zhì)基礎、質(zhì)量控制方向上有重要意義[3]。

近年來，超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術憑借其高分辨、高精度等優(yōu)點在天然產(chǎn)物的鑒定中得到了廣泛的應用。本研究利用超高分辨三合一質(zhì)譜儀對青蒿鱉甲湯的主要化學成分進行快速、全面的結(jié)構(gòu)鑒定，以期為該方藥效物質(zhì)基礎及質(zhì)量控制提供理論支持。

1 材料

1.1 儀器 液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司)，包括高效液相色譜儀、自動進樣器、柱溫箱、二元泵、質(zhì)譜；CPA225D電子分析天平(德國賽多利斯公司)；JP-080ST超聲波清洗器(深圳市潔盟清洗設備有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 青蒿、鱉甲、生地、知母、丹皮飲片購于康美藥業(yè)有限公司。甲醇(色譜純，德國Merck公司)、屈臣氏蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)，其余試劑均為分析純。脯氨酸(批號140677-201507)、梓醇(批號110808-201210)、芍藥苷(批號110736-200934)、青蒿素(批號1201016-201004)、夏佛塔苷(批號111912-201703)、東莨菪內(nèi)酯(批號110768-200504)、藁本內(nèi)酯(批號111737-201001)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院，純度≥98%。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液 稱取青蒿18 g、鱉甲45 g、細生地36 g、知母18 g、丹皮27 g，共144 g。鱉甲加450 mL水煎煮1 h，過濾后加入450 mL水煎煮45 min，同時將其他藥材浸泡45 min。將兩次鱉甲煎煮液和其他藥材混合，微沸煮1 h，得到總體積約1 000 mL，濃縮約至275 mL，凍干保存。取凍干粉0.050 4 g，溶于10 mL甲醇中，超聲溶解5 min后過0.22 μm微孔濾膜，即得，質(zhì)量濃度約為5 mg/mL。

2.1.2 對照品溶液 精密稱取對照品粉末于10 mL量瓶中，甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，制得對照品儲備液，取50 μL，甲醇稀釋至1 mL，即得。

2.2 色譜條件 Hypersil gold C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)；流動相0.2%乙酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～6 min，20%～75%B；6～12 min，75%～95%B；12～17 min，95%B)；體積流量0.3 mL/min；進樣室溫度4 ℃；柱溫45 ℃；進樣量2 μL。

2.3 質(zhì)譜條件 ESI源，正負離子檢測模式；離子源溫度350 ℃，毛細管溫度275 ℃；鞘氣體積流量40 L/min，輔助氣體積流量8 L/min，掃尾氣體積流量1 L/min；噴霧電壓3 500 V；掃描范圍m/z75～1 100。

2.4 數(shù)據(jù)分析 利用Compound Discoverer3.0軟件進行分析，獲得誤差范圍≤5.0×10-6分子式和二級質(zhì)譜碎裂信息，采用網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫Chemspider、Scifinder等進行峰匹配檢索。

3 結(jié)果

3.1 UHPLC-Orbitrap-MS/MS 青蒿鱉甲湯樣品總離子流圖中各色譜峰得到了較好的分離，檢測時間17 min。

3.2 化學成分鑒定 依據(jù)保留時間、高分辨分子量、二級質(zhì)譜特征碎片，結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索、文獻、對照品對化學成分進行指認，共鑒定出71個化合物，包括有機酚酸類11個、黃酮類10個、萜類10個、香豆素類9個、氨基酸類7個、苷類6個、糖類4個、生物堿類3個、皂苷類3個、環(huán)烯醚萜、酯類各2個、苯酞、木脂素、苯丙素、其他類各1個，見表1，總離子流圖見圖1。以下以峰2、19、24、41、49、59為例，說明分析過程。

表1 青蒿鱉甲湯化學成分分析結(jié)果

續(xù)表1

圖1 青蒿鱉甲湯負離子模式(A)、正離子模式(B)總離子流圖

峰2分子離子峰為m/z114.06[M-H]-，其裂解碎片m/z70.06[M-H-HCOOH]-，確定分子式為C5H9NO2。查找數(shù)據(jù)庫以及文獻與L-脯氨酸相符，經(jīng)過對照確定峰2為L-脯氨酸[4-5]。

峰19分子離子峰為m/z362.12[M-H]-，二級質(zhì)譜產(chǎn)生199.06[M-H-C6H10O5]-、169.04[M-H-C6H10O5-CH2OH]-、151.03[M-H-C6H10O5-CH2OH-H2O]-特征峰，確定分子式為C15H22O10。查找數(shù)據(jù)庫和文獻，發(fā)現(xiàn)它與梓醇的碎片基本一致，經(jīng)過對照品比對，推斷峰19為梓醇[6-7]，可能的裂解途徑，見圖2。

圖2 梓醇裂解途徑

峰24的分子離子峰為m/z433.11[M+H]+，二級質(zhì)譜中產(chǎn)生342.10[M+H-C3H6O3]+、283.05[M+H-C3H6O3-C2H4O2]+、313.07[M+H-C4H8O4]+特征峰，確定分子式為C21H20O10。查找數(shù)據(jù)庫和文獻，發(fā)現(xiàn)它與牡荊素的碎片信息基本一致，推斷峰24為牡荊素[8-9]，可能的裂解途徑，見圖3。

圖3 牡荊素裂解途徑

峰41的分子離子峰為m/z167.06[M+H]+，二級質(zhì)譜產(chǎn)生149.05[M+H-H2O]+、125.05[M+H-CH2CO]+和121.06[M+H-H2O-CO2]+特征峰，確定其分子式為C9H10O3。查找數(shù)據(jù)庫以及文獻，發(fā)現(xiàn)它丹皮酚的碎片基本一致，推斷峰41為丹皮酚[10-11]，可能的裂解途徑，見圖4。

圖4 丹皮酚裂解途徑

峰49的離子峰為m/z584.13[M+H]+，二級質(zhì)譜中有規(guī)律的脫去90、120的產(chǎn)物離子峰，沒出現(xiàn)脫糖基的特征離子峰493.09[M+H-90]+、463.08[M+H-120]+、331.04[M+H-90-Glu]+，推測為六碳六氧糖的碳苷類化合物，確定其分子式為C25H28O16。查找數(shù)據(jù)庫和文獻，發(fā)現(xiàn)它與新芒果苷的碎片基本一致，推斷峰49為新芒果苷[12-13]。

峰59的分子離子峰為m/z479.16[M-H]-，碎片離子m/z121.02為苯甲酸分子，確定其分子式為C23H28O11。查找數(shù)據(jù)庫和文獻，發(fā)現(xiàn)它與芍藥苷的碎片基本一致，推斷峰59為芍藥苷[14-15]，可能的裂解途徑，見圖5。

圖5 芍藥苷裂解途徑

4 討論

本實驗分別采用C18色譜柱和親水型色譜柱進行預實驗分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C18色譜柱的分離效果較好，考慮是由于組方成分復雜造成的親水型色譜柱分離效果不明顯，故選擇本文中的Hypersil gold C18型色譜柱進行實驗。在梯度優(yōu)化過程中，發(fā)現(xiàn)使用比較緩慢的梯度時，前10 min出峰較少，分離效果不佳，故把梯度條件加快，最終選定了本次文章中所用的實驗條件。

本實驗采用UHPLC-Orbitrap-MS/MS技術在正負離子模式下對青蒿鱉甲湯樣品的化學成分進行分析[3,16-17]，共鑒定了70種化學成分。實驗中發(fā)現(xiàn)青蒿鱉甲湯中主要含有機酚酸、黃酮、萜類、香豆素類等化學成分，猜測這些成分可能是其發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎。如源自青蒿中的成分青蒿素、青蒿酸、東莨菪內(nèi)酯具有抗腫瘤、抗炎止痛等作用[18-20]，源自生地中的成分梓醇，具有有抗癌、抗肝炎病毒等作用[21]，源自知母中的菝葜皂苷元具有清熱解毒止渴除煩等作用[22]，丹皮中主要成分丹皮酚具有抗炎、解熱鎮(zhèn)痛和抑制變態(tài)反應的作用[23]，鱉甲中含有的多種氨基酸如谷氨酸、脯氨酸等具有調(diào)節(jié)生理機能、催化代謝等[24]作用。

綜上所述，本實驗通過UHPLC-Orbitrap-MS/MS技術較全面地分析并鑒別了青蒿鱉甲湯中存在的化學成分及其復方產(chǎn)物[25-26]，填補并豐富了該復方的化學成分信息，為進一步解釋青蒿鱉甲湯藥效作用提供有力的科學依據(jù)，并為下一步尋找其關鍵活性成分物質(zhì)奠定了研究基礎。同時也可以作為潛在的中藥材新資源開發(fā)提供參考依據(jù)，為其他類似化合物質(zhì)譜解析提供參考。