外泌體在非酒精性脂肪性肝病發(fā)生發(fā)展中的作用

徐 昆， 石清蘭， 胡振斌， 張 旭， 李 瑛

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院， 南寧 530222； 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝病一區(qū)， 南寧 530023

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)在西方國家普通人群的發(fā)病率為20%～30%，在亞洲地區(qū)約為27.37%，而我國成人NAFLD的發(fā)病率在13%～43%[1-2]，并且呈逐年上升趨勢。NAFLD的發(fā)病機(jī)制現(xiàn)尚未完全闡明，但與環(huán)境、代謝及遺傳易感性等因素密切相關(guān)，囊括從單純性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)到肝硬化以及肝癌的一系列疾病[3]。外泌體是由多種細(xì)胞分泌的直徑在40～100 nm的盤狀膜性囊泡，攜帶蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸(miRNA、lncRNA和DNA)等活性成分，能介導(dǎo)細(xì)胞間的通訊，在多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用[4]。本文就外泌體對脂質(zhì)代謝，胰島素抵抗(IR)、慢性炎癥及肝纖維化的影響，探討外泌體與NAFLD之間的關(guān)系，為NAFLD的發(fā)病提供一些新的見解。

1 外泌體簡介

外泌體是胞內(nèi)多囊泡體與細(xì)胞膜融合后，釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的雙層脂質(zhì)囊泡，可通過多種應(yīng)激條件誘導(dǎo)生成[5]。不同組織細(xì)胞來源的外泌體攜帶的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸不同，其所發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)也不盡相同。外泌體廣泛存在并分布于各種體液中，以多種方式參與細(xì)胞間的通訊，包括直接的膜融合、受體介導(dǎo)的融合以及內(nèi)吞作用，將生物活性物質(zhì)輸送至靶細(xì)胞并激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，從而構(gòu)成了細(xì)胞-細(xì)胞間的信息傳遞系統(tǒng)，在細(xì)胞通訊、免疫應(yīng)答、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化等多種生理病理過程中承擔(dān)重要作用[4]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，糖脂代謝紊亂引起的肝脂肪蓄積是首要原因，而由此引發(fā)的肝臟慢性炎癥及進(jìn)行性肝纖維化則是其發(fā)展的重要因素。外泌體在NAFLD的發(fā)病、診斷和治療中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

2 外泌體與脂質(zhì)代謝

NAFLD以肝細(xì)胞的脂肪蓄積和脂肪變性為主要病理特征，脂質(zhì)代謝紊亂被認(rèn)為是NAFLD發(fā)生的首要原因。肝臟參與脂質(zhì)代謝的許多重要環(huán)節(jié)，當(dāng)體內(nèi)的脂肪酸(FA)超過肝臟的處理能力后，過多的脂質(zhì)將以甘油三脂(TG)的形式在肝細(xì)胞內(nèi)沉積，引起肝臟脂肪變性[6]。諸多研究證實(shí)，外泌體對脂質(zhì)代謝具有顯著影響，其中包含的生物活性分子在調(diào)節(jié)脂質(zhì)的合成及分化中起著重要作用。因此深入了解外泌體對脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用機(jī)制，對認(rèn)識本病具有重要意義。

2.1 外泌體促進(jìn)脂肪形成 哺乳動物不育系20樣激酶1(MST1)是脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)劑，已被鑒定為miR-199a-5p的靶基因。有研究[7]顯示，在高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪變性小鼠模型中，脂肪組織內(nèi)高度表達(dá)的miR-199a-5p可經(jīng)外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，并通過抑制MST1的表達(dá)來影響SREBP-1c/AMPK信號級聯(lián)，上調(diào)肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(CPT1)和脂肪酸合酶(FASN)的表達(dá)，隨后刺激FA合成并抑制脂解途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)蓄積。而在肝臟中特異性表達(dá)的miR-122，則可通過與FASN和乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的3′非翻譯區(qū)(3′URT)高度結(jié)合，影響血漿中TG、游離脂肪酸(FFA)及膽固醇的含量，從而增加脂肪的生物合成[8]。抵抗素是由脂肪細(xì)胞分泌的一種特異性細(xì)胞因子，以脂肪細(xì)胞外泌體的形式運(yùn)送至肝細(xì)胞，通過抑制AMPKα信號傳導(dǎo)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并促進(jìn)肝臟中TG的合成而加劇肝脂肪變性[9]。在低氧條件下，源自脂肪細(xì)胞的外泌體還會通過增加FASN、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)及ACC等脂肪合成酶的水平來促進(jìn)脂質(zhì)合成[8]。此外另有研究[10]表明，在腸黏膜嚴(yán)重?fù)p傷的小鼠中，高遷移率族蛋白1可由Toll樣受體4(TLR4)信號激活，通過腸外泌體從受損的腸上皮細(xì)胞釋放，以外泌體介導(dǎo)的非經(jīng)典藥物分泌途徑分泌，通過作用于肝臟，導(dǎo)致肝臟脂肪變性。

2.2 外泌體影響脂肪分化和棕色化 外泌體是脂肪分化的重要調(diào)控因子，在誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞(ADSCs)分化為成熟脂肪細(xì)胞中起重要作用。Wnt-1誘導(dǎo)分泌蛋白2是由脂肪組織分泌的一種新型脂肪因子，在前脂肪細(xì)胞中高度表達(dá)，具有抑制脂肪生成的作用，而miR-450a-5p是脂肪細(xì)胞來源外泌體(Ad-Exo)中最豐富的miRNA之一。Zhang等[11]研究表明，當(dāng)Ad-Exo被ADSCs內(nèi)化后，其中富含的miR-450a-5p可通過與Wnt-1誘導(dǎo)分泌蛋白2的3′URT靶向結(jié)合來抑制其表達(dá)，從而促進(jìn)脂肪分化。亦有研究[12]表明，無論是體外還是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，用脂肪組織的外泌體樣囊泡處理ADSCs時均可導(dǎo)致脂肪滴的出現(xiàn)，并且脂肪形成基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ2(PPARγ2)、aP2及脂聯(lián)素的水平也會相應(yīng)升高。外泌體同樣可以通過調(diào)控白色脂肪棕色化來影響脂肪代謝。鐘瓊慧等[13]研究表明，ADSCs以外泌體的形式分泌miR-27并作用于脂肪組織，通過下調(diào)解耦聯(lián)蛋白1、PPARγ、含PR結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白16及PPARγ共激活因子1α等棕色化相關(guān)蛋白抑制白色脂肪棕色化，從而增加脂質(zhì)蓄積。此外不同組織細(xì)胞來源的外泌體中所富含的一些其他miRNAs(如miR-143、miR-192、miR-27a-3p、miR-27b-3p和miR-125b-5p等)在調(diào)控白色脂肪棕色化過程中同樣也發(fā)揮了重要作用[8]。由上可知，外泌體內(nèi)含有的多種功能性物質(zhì)可通過不同途徑影響脂肪代謝，對肝臟脂肪蓄積和脂肪變性起直接或間接的作用。

3 外泌體與IR

NAFLD的發(fā)生發(fā)展是多因素共同作用的結(jié)果，脂質(zhì)異常蓄積導(dǎo)致的肝臟脂肪變性常常是疾病的啟動因素，而IR則是NAFLD發(fā)展的核心環(huán)節(jié)[6]。脂肪組織作為一種高度動態(tài)的代謝器官，可通過分泌含有多種生物活性物質(zhì)的外泌體來調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和全身性胰島素敏感性，此外脂毒性物質(zhì)介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化也是誘發(fā)IR的重要原因。

3.1 外泌體蛋白與IR Sonic Hedgehog(Shh)是一種外泌體蛋白，在脂肪細(xì)胞外泌體中高度表達(dá)，是控制巨噬細(xì)胞極化的關(guān)鍵因子。Song等[14]研究表明，攜帶Shh的脂肪細(xì)胞外泌體通過Ptch和PI3K途徑刺激巨噬細(xì)胞M1極化，當(dāng)M1巨噬細(xì)胞浸潤到脂肪組織中后，可通過釋放外泌體來降低脂肪細(xì)胞中胰島素受體底物1和激素敏感性脂肪酶的表達(dá)，從而誘導(dǎo)IR。Deng等[15]進(jìn)一步證明，M1巨噬細(xì)胞釋放的外泌體是促炎細(xì)胞因子的重要來源，其中的TNF和IL-6可以阻斷脂肪細(xì)胞中的胰島素作用，而IR的產(chǎn)生很可能是通過TLR4/TRIF途徑來完成的。Yuasa等[16]研究表明，與外泌體相關(guān)的鈣蛋白酶2可直接作用于胰島素受體并切割其β亞基，隨后γ-分泌酶對β亞基進(jìn)行下一步的膜內(nèi)切割。兩種酶對胰島素受體的順序切割在直接抑制胰島素受體底物1的Akt磷酸化的同時也減少了酪氨酸的磷酸化，從而抑制胰島素信號傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致IR的發(fā)生。另有研究[17]表明，高脂飲食小鼠腸道上皮細(xì)胞外泌體的脂質(zhì)可發(fā)生明顯改變，從主要的磷脂酰乙醇胺變?yōu)榱字Ｄ憠A，當(dāng)外泌體通過腸肝軸轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟后，外泌體磷脂酰膽堿結(jié)合并激活在肝細(xì)胞中表達(dá)的芳香烴受體(AhR，一種調(diào)節(jié)胰島素反應(yīng)的蛋白質(zhì))，導(dǎo)致激活胰島素信號通路必不可少的基因(如IRS-2)及其下游基因PI3K/蛋白激酶B(Akt)被抑制，從而引發(fā)IR。

3.2 外泌體miRNAs與IR 外泌體中含有豐富的miRNA，可通過多種方式介導(dǎo)IR，在葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。例如miRNA-93可通過抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的表達(dá)而導(dǎo)致IR[18]；miRNA-145可通過P65轉(zhuǎn)錄因子途徑導(dǎo)致肝細(xì)胞IR[19]；miRNA-27a可通過抑制IRS1、Akt及糖原合成酶激酶3β的磷酸化來阻斷胰島素信號通路，通過靶向PPARγ的表達(dá)來介導(dǎo)IR等[20]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(sirtuin1，SIRT1)是眾所周知的胰島素敏感基因，在IR中起重要調(diào)節(jié)作用。Su等[21]研究表明，老年小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)來源的外泌體中含有豐富的miR-29b-3p，當(dāng)外泌體被脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞和肝細(xì)胞攝取后，其中的miR-29b-3p可與SIRT1 mRNA的3′URT直接結(jié)合并抑制其表達(dá)，通過miR-29b-3p/SIRT1依賴性方式介導(dǎo)IR。而另一項(xiàng)研究[22]也表明，在脂肪特異性SIRT1缺陷小鼠中，由自噬誘導(dǎo)釋放的外泌體可通過TLR4/NF-κB途徑損害胰島素敏感性。線粒體功能障礙對IR的形成有著重要影響，NADH脫氫酶泛醌1α亞復(fù)合物4是線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ(CⅣ)的一個組成部分，與線粒體功能密切相關(guān)。Tian等[23]研究表明，miR-210在高糖誘導(dǎo)的脂肪組織巨噬細(xì)胞衍生的外泌體中高表達(dá)，可通過抑制NADH脫氫酶泛醌1α亞復(fù)合物4基因的表達(dá)來影響CⅣ的活性，而CⅣ活性的受損可直接導(dǎo)致線粒體功能障礙，并通過β氧化途徑減少脂肪酸分解并抑制ATP產(chǎn)生，從而導(dǎo)致β細(xì)胞功能障礙和誘發(fā)IR。此外miRNA-155、miRNA-144、miRNA-29b、miRNA-29a、miRNA-222、miRNA-141-3p等miRNAs在全身性IR及糖脂代謝中也起著重要作用。由此可知，外泌體攜帶的蛋白質(zhì)及miRNAs在葡萄糖穩(wěn)態(tài)和IR的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用，弄清這些生物活性物質(zhì)起作用的靶點(diǎn)及通路，不僅有助于認(rèn)識疾病的發(fā)生發(fā)展，對今后NAFLD的診斷、藥物開發(fā)和治療同樣具有啟發(fā)。

4 外泌體與肝臟炎癥

肝臟脂肪變性常常伴隨著肝細(xì)胞的壞死和脂毒性物質(zhì)的產(chǎn)生，由此引發(fā)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)則是NAFL向NASH進(jìn)展的關(guān)鍵。巨噬細(xì)胞是脂肪駐留的免疫細(xì)胞中最豐富的類型，其數(shù)量和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞具有高度的可塑性，從抗炎性M2型向促炎性M1型的轉(zhuǎn)換過程中，會產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，從而加劇炎癥反應(yīng)[24]。而外泌體作為細(xì)胞間信息交流的載體，在脂毒性物質(zhì)和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥中扮演了重要角色。

既往研究表明，膽固醇是NASH發(fā)病機(jī)理中的關(guān)鍵脂毒性分子，可影響溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等多種細(xì)胞器的功能。Zhao等[25]研究證明，過多的膽固醇會誘導(dǎo)溶酶體功能障礙并抑制多囊體的降解，使肝細(xì)胞釋放的外泌體增加，其中包含的肝臟特異性miR-122-5p可直接作用于巨噬細(xì)胞，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M1極化，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子分泌增加。因此，改善溶酶體功能或抑制miR-122-5p可能是NASH的潛在治療策略。此外Liu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)的大鼠脂肪性肝炎模型中，脂毒性肝細(xì)胞釋放的外泌體可誘導(dǎo)CD11b+和CD86+巨噬細(xì)胞的激活，同時促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、IL-6和TNFα等炎性因子的釋放。而外泌體中富含的miR-192-5p可抑制Rictor蛋白的表達(dá)，通過促進(jìn)叉頭框轉(zhuǎn)錄因子0亞族1的激活，來介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。另有研究[24]表明，在HFD喂養(yǎng)的小鼠中，成熟脂肪細(xì)胞分泌的外泌體高表達(dá)miR-34a，可經(jīng)旁分泌的形式轉(zhuǎn)運(yùn)至巨噬細(xì)胞中，通過抑制Krüppel樣因子4的表達(dá)來抑制M2極化，從而誘導(dǎo)全身性炎癥的發(fā)生。

死亡受體5(DR5)信號通路在介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化中也起著關(guān)鍵作用。Hirsoua等[27]證明，棕櫚酸酯(PA，一種有毒的飽和游離脂肪酸)可通過CHOP/DR5/caspase8/3信號級聯(lián)激活與鋅離子相關(guān)的RhoA蛋白1，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞來源的外泌體釋放增加。外泌體中包含的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體可與巨噬細(xì)胞表面的同源配體DR5相互結(jié)合，通過NF-κB信號通路將巨噬細(xì)胞激活為促炎表型，誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子(IL-1β和IL-6)的表達(dá)和釋放。此外亦有研究[28]證明，PA誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可通過IRE1a/XBP-1依賴性方式促進(jìn)肝細(xì)胞外泌體釋放，脂毒性外泌體所富含的C16∶0神經(jīng)酰胺可介導(dǎo)1-磷酸鞘氨醇(S1P)的生成。S1P與巨噬細(xì)胞表面的1-磷酸鞘氨醇受體(S1PR)結(jié)合后，可激活巨噬細(xì)胞的趨化性，將巨噬細(xì)胞募集到肝臟，導(dǎo)致肝臟炎癥的產(chǎn)生。如上所述，外泌體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化和遷徙是肝臟炎癥損傷的重要推動力量，這不僅加速肝細(xì)胞死亡，而且還促進(jìn)了肝臟纖維化的發(fā)展。因此，深入研究兩者的相互作用機(jī)制，抑制兩者之間的信息交流，對延緩甚至阻斷病情發(fā)展，具有至關(guān)重要的作用。

5 外泌體與肝纖維化

肝纖維化是慢性肝損傷期間細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度產(chǎn)生并沉積，導(dǎo)致肝臟結(jié)締組織異常增生的一種病變過程，是NASH向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)之路[29]。肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活受多種機(jī)制調(diào)控，是纖維化發(fā)展的關(guān)鍵步驟[30]?；罨腍SC可轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞并向肝臟遷徙，釋放大量ECM蛋白，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。越來越多的證據(jù)表明，外泌體在HSC的活化及肝纖維化的調(diào)控中起著重要作用。

活化的巨噬細(xì)胞不僅可以推動肝臟炎癥的發(fā)展，還可以釋放外泌體激活HSC，誘導(dǎo)纖維化的發(fā)生。Chen等[31]研究表明，源自脂多糖激活的THP-1巨噬細(xì)胞釋放的外泌體可以靶向HSC，外泌體富含的miR-103-3p通過與Krüppel樣因子4的3′URT結(jié)合而抑制其表達(dá)，從而誘導(dǎo)HSC增殖和活化。來源于HCV感染的肝細(xì)胞外泌體釋放增加，其攜帶的miR-192被傳遞到HSC中，通過增加轉(zhuǎn)化生長因子β1的表達(dá)，來誘導(dǎo)HSC的活化[30]。此外，肝lncRNA-H19水平與纖維化嚴(yán)重程度也密切相關(guān)。Liu等[32]研究表明，膽管細(xì)胞衍生的外泌體中高表達(dá)H19，可優(yōu)先被HSC吸收。H19不僅增加G1/S細(xì)胞周期過渡來促進(jìn)HSC的增殖和活化，而且在HSC衍生的成纖維細(xì)胞中上調(diào)了纖維化基因表達(dá)，促進(jìn)ECM蛋白形成，從而誘導(dǎo)纖維化。另有研究[33]發(fā)現(xiàn)，用血管緊張素Ⅱ處理的人肝LX-2星狀細(xì)胞中，促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-18和TNFα)和ECM蛋白(α-SMA、ColⅠ和ColⅢ)表達(dá)增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該結(jié)果的產(chǎn)生與凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)有關(guān)，用ASK1抑制劑GS-4997或siRNA預(yù)處理能夠逆轉(zhuǎn)血管緊張素Ⅱ?qū)X-2細(xì)胞的影響。因此，從功能上抑制ASK1可能是治療肝纖維化的一種潛在途徑。

miR-122是肝細(xì)胞中含量最豐富的miRNA，占總miRNAs的70%。研究報道，miR-122在脂質(zhì)代謝和肝纖維化中具有雙重調(diào)控作用。在肝臟中，miR-122的高表達(dá)可以誘導(dǎo)脂質(zhì)合成增加，而miR-122的低表達(dá)則可導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。Csak等[34]研究表明，miR-122可在多個步驟中影響肝纖維化。首先，在肝細(xì)胞中，miR-122的減少可導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)的表達(dá)增加，HIF-1α作用于其靶基因賴氨酸氧化酶，通過參與膠原纖維和彈性纖維的交聯(lián)，促進(jìn)ECM的形成。其次，miR-122的減少與促分裂原活化蛋白激酶3的增加有關(guān)，促分裂原活化蛋白激酶3與HIF-1α均可啟動內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,誘導(dǎo)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生。最后，波形蛋白是HSC和成纖維細(xì)胞中細(xì)胞骨架的主要成分，miR-122的減少可促使波形蛋白表達(dá)增加，間接促進(jìn)HSC的增殖和分化。所以，調(diào)節(jié)肝臟中miR-122的表達(dá)，對肝纖維化和脂質(zhì)代謝均具有重要意義。

6 小結(jié)

綜上所述，多種細(xì)胞來源的外泌體通過靶向釋放蛋白質(zhì)、miRNA及l(fā)ncRNA等生物活性分子介導(dǎo)細(xì)胞間信息傳導(dǎo)，在NAFLD的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，阻斷致病性外泌體的分泌及其內(nèi)容物的釋放可能在NAFLD的治療過程中獲益[4]。此外，由于其穩(wěn)定的雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，外泌體也可作為藥物運(yùn)送的載體，參與疾病的治療[35]。在診斷方面，外泌體也顯示出了巨大的優(yōu)勢，其中所包含的miRNAs與疾病進(jìn)展呈正相關(guān)[36]，可作為肝臟疾病的新型生物標(biāo)志物。但就目前而言，外泌體所包含的生物活性分子及其與受體細(xì)胞的相互作用機(jī)制尚未完全闡明，作為一種新的治療和診斷工具尚處于開發(fā)的早期階段，從動物實(shí)驗(yàn)到臨床運(yùn)用，還需要進(jìn)行更多的研究[5]。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：石清蘭、胡振斌負(fù)責(zé)課題設(shè)計，修改論文，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿；徐昆負(fù)責(zé)擬定寫作思路，資料分析，撰寫論文；張旭、李瑛負(fù)責(zé)收集整理數(shù)據(jù)。