劉勇,李澤秀,唐良玉,鄧靖,張堯,余雨蓉,陳云華,趙學(xué)梅
貴州泰邦生物制品有限公司,貴州貴陽550025
靜注人免疫球蛋白(human immunoglobulin for intravenous injection,IVIG)是治療原發(fā)性免疫缺陷病、繼發(fā)性免疫缺陷病和自身免疫性疾病(原發(fā)性血小板減少癥、川崎?。┑挠行幬铮?-4]。目前,國內(nèi)上市的IVIG 制劑為IVIG(pH4),蛋白濃度為50g/L(5%IVIG),以糖類作為穩(wěn)定劑。高濃度IVIG 是采用層析工藝開發(fā)的新一代 IVIG 制劑[5],蛋白濃度為 100 g /L(10%IVIG),以氨基酸類作為穩(wěn)定劑,國內(nèi)暫無產(chǎn)品上市。目前,10%IVIG 的研發(fā)已成為血液制品行業(yè)的焦點(diǎn)[6-7]。
選擇性IgA 缺乏癥(selective immunoglobulin A deficiency,SIgAD)是指患者血清 IgA 低于 0.05 g /L,IgG 和IgM 含量正常,是免疫缺陷中最常見的類型,占原發(fā)性免疫缺陷病的60%以上。IgA 缺乏型患者可能因使用含IgA 的IVIG 制劑而產(chǎn)生抗-IgA,當(dāng)再次輸入該類制品時可產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng),甚至危及生命,因此,嚴(yán)格控制IVIG 中IgA 殘留量具有重要的臨床意義[8-9],國外如Octaphama 公司內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)要求 IVIG 制品 IgA 殘留量 ≤ 200 μg / mL[10]。
《中國藥典》三部(2020 版)已增加IVIG 中IgA殘留量檢測要求,檢測方法包括紫外-可見分光光度法、酶聯(lián)免疫法和散射比濁法 3 種[11]。10% IVIG 較5%IVIG 蛋白濃度高1 倍,更應(yīng)關(guān)注制品中IgA 的殘留量。目前,紫外-可見分光光度法中所用抗人IgA 血清試劑批間質(zhì)量尚存在一定的差異,為加快10%IVIGⅢ期臨床樣品IgA 殘留量檢測方法的建立,本研究對酶聯(lián)免疫法和散射比濁法進(jìn)行驗(yàn)證及比較。
1.1 供試品 高濃度IVIG 由貴州泰邦生物制品有限公司生產(chǎn)。
1.2 主要試劑及儀器 人IgA 測定試劑盒購自美國Immunology Consultants Laboratory,Inc 公司(ICL);人腦脊液IgA 測定試劑盒購自德國Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH 公司;IgA 國際標(biāo)準(zhǔn)品(批號:67 / 086,規(guī)格:100 IU / 支,1 IU = 14.2 μg)購自NIBSC;全波長酶標(biāo)儀購自美國賽默飛公司;BN Pro-Spec?全自動蛋白分析儀購自德國Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH /西門子公司。
1.3 檢測方法
1.3.1 酶聯(lián)免疫法 取ICL 試劑盒中樣品稀釋液進(jìn)行5 倍稀釋,配制成樣品稀釋液,并將樣品 / 標(biāo)準(zhǔn)品按需求進(jìn)行稀釋。取100 μL 標(biāo)準(zhǔn)品 / 樣品,室溫孵育 30 min;洗滌液洗板 3 次,加入 100 μL 酶標(biāo)工作液,避光孵育30 min;洗滌液洗板3 次,加入100 μL TMB 顯色液,避光孵育 10 min;加入 100 μL 終止液,酶標(biāo)儀450 nm 測定A 值,A450值與濃度進(jìn)行四參數(shù)擬合,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算IgA 殘留量。
1.3.2 散射比濁法 IgA 試劑盒內(nèi)定標(biāo)液、質(zhì)控品、檢測試劑、檢測輔助試劑按要求進(jìn)行復(fù)溶,放入儀器指定位置;供試品經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后,取2 mL 濾液置于試管中,裝載上機(jī)檢測IgA 殘留量。
1.4 方法的驗(yàn)證
1.4.1 線性與范圍
1.4.1.1 酶聯(lián)免疫法 將ICL 試劑盒內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品按照試劑盒說明書用樣品稀釋液倍比稀釋,按1.3.1 項(xiàng)步驟檢測,驗(yàn)證線性與范圍。
1.4.1.2 散射比濁法 將試劑盒內(nèi)定標(biāo)品裝載至全自動蛋白分析儀上,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方法,儀器自動按預(yù)設(shè)比例倍比稀釋,驗(yàn)證線性與范圍。
1.4.2 準(zhǔn)確度 采用加標(biāo)回收率法。取復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別稀釋至 6、12 和 18 μg / mL;將 10%IVIG 原液稀釋至濃度分別約為 6、12 和 18 μg / mL,作為供試品。將對應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和供試品按體積比1 ∶1 混合,分別制成3 個濃度水平的加標(biāo)混合溶液,每個濃度制備3 份,分別采用酶聯(lián)免疫法和散射比濁法進(jìn)行測定,按下式計(jì)算回收率,驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度。
回收率(%)=(加標(biāo)供試品測定濃度-供試品測定濃度)/標(biāo)準(zhǔn)品理論濃度× 100%
1.4.3 重復(fù)性 分別采用酶聯(lián)免疫法和散射比濁法測定平行制備的6 份10% IVIG,并計(jì)算RSD,驗(yàn)證方法的重復(fù)性。
1.4.4 中間精密性 不同試驗(yàn)員于不同時間獨(dú)立采用酶聯(lián)免疫法和散射比濁法分別測定平行制備的6 份 10% IVIG 的 IgA 殘留量,并計(jì)算 RSD,驗(yàn)證方法的中間精密性。
1.4.5 專屬性 取同一批次的2 份10%IVIG 樣品,分別采用酶聯(lián)免疫法和散射比濁法測定,樣品1 直接測定IgA 殘留量,樣品2 添加甘氨酸濃度至20 g / L再測定IgA 殘留量,各平行測定3 次,并計(jì)算RSD,驗(yàn)證方法的專屬性。
1.5 兩種方法的比較 取3 批10% IVIG,分別采用酶聯(lián)免疫法和散射比濁法測定樣品中的IgA 殘留量,每個樣品平行制備3 份。
1.6 委外檢測比對 試制7 批次10% IVIG 的Ⅲ期臨床試驗(yàn)藥物,完成公司自檢后,委托中國食品藥品檢定研究院檢測IgA 殘留量,進(jìn)行比對分析。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn),以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 方法的驗(yàn)證
2.1.1 線性與范圍
2.1.1.1 酶聯(lián)免疫法 IgA 濃度在2.5~800 ng/mL范圍內(nèi),以IgA 標(biāo)準(zhǔn)品A450值和濃度做四參數(shù)曲線擬合,IgA 與A450呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r 為0.999 96。見圖1。
圖1 酶聯(lián)免疫法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ELISA
2.1.1.2 散射比濁法 以IgA 的濃度0.261~8.35mg/L與散射光強(qiáng)度值求得直線回歸方程,標(biāo)準(zhǔn)曲線均值偏差為0.56%,見圖2。
圖2 散射比濁法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of nephelometry assay
2.1.2 準(zhǔn)確度 酶聯(lián)免疫法和散射比濁法測定不同濃度水平樣品的平均加標(biāo)回收率(n = 9)分別為103.32%和89.82%,見表1。表明兩種方法受樣品基質(zhì)影響小,能夠準(zhǔn)確測定10%IVIG 中IgA 的殘留量。
表1 兩種方法的回收率測定結(jié)果Tab.1 Determination results of recoveries by two methods
2.1.3 重復(fù)性 酶聯(lián)免疫法和散射比濁法重復(fù)測定10%IVIG IgA 殘留量的RSD 分別為4.90%和5.05%,均小于8%,見表2。表明兩種方法重復(fù)性良好。
表2 兩種方法的重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果Tab.2 Verification for reproducibility of two methods
2.1.4 中間精密性 酶聯(lián)免疫法和散射比濁法測定10% IVIG IgA 殘留量的RSD 分別為5.88%和5.42%,均小于8%,見表3。表明兩種方法中間精密性良好。
表3 兩種方法的精密性驗(yàn)證結(jié)果Tab.3 Verification for precision of two methods
2.1.5 專屬性 酶聯(lián)免疫法和散射比濁法測定結(jié)果的均值分別為 9.38 和 7.28 μg / mL,RSD 分別為6.14%和4.3%,見表4。表明甘氨酸輔料對IgA 檢測干擾較小。
表4 兩種方法的專屬性驗(yàn)證結(jié)果Tab.4 Verification for specificity of two methods
2.2 兩種方法的比較 酶聯(lián)免疫法與散射比濁法相比,測定IgA 殘留量偏高,兩種方法平行測定的結(jié)果穩(wěn)定性良好,兩種方法檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t = 1.311,P = 0.260)。見表 5。
表5 兩種方法檢測結(jié)果的比較Tab.5 Determination results by two methods
2.3 委外檢測結(jié)果 委外檢驗(yàn)10% IVIG 的IgA 殘留量略低于企業(yè)自檢結(jié)果,見表6。
表6 委外檢測與企業(yè)自檢結(jié)果比對(μg / mL)Tab.6 Determination results by two laboratories(μg / mL)
本研究通過酶聯(lián)免疫法和散射比濁法檢測10%IVIG 中IgA 殘留量,并驗(yàn)證兩種檢測方法的線性范圍、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、中間精密性、專屬性均符合藥典要求,兩種方法的檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05),但酶聯(lián)免疫法較散射比濁法檢測結(jié)果略高,這可能與供試品IgA 含量較低有關(guān),有一定的誤差,今后需進(jìn)一步深入研究。
采用兩種方法檢測試制7 批次的高濃度IVIGⅢ期臨床試驗(yàn)藥物中的IgA 殘留量略高于中國食品藥品檢定研究院檢測結(jié)果,這可能與不同實(shí)驗(yàn)室采用的檢測試劑盒、儀器不同有關(guān),后續(xù)還需進(jìn)行多批次對比分析。高濃度IVIGⅢ期臨床試驗(yàn)藥物中的IgA 殘留量遠(yuǎn)低于 200 μg / mL。
已有研究報道國內(nèi)廠家已上市的IVIG(pH 4)IgA均值約 150 μg / mL,部分廠家接近 400 μg / mL[12]。IgA 是IVIG 中重要的安全性指標(biāo),本研究檢測的新型高濃度IVIG 中雜蛋白IgA 含量極低,能有效降低副作用,臨床使用更加安全[9]。
《中國藥典》三部(2020 版)中規(guī)定的3 種測定方法原理均是基于IgA 與相應(yīng)的抗體特異性結(jié)合,與酶聯(lián)免疫法和散射比濁法所用的包被IgA 特異性抗體的酶標(biāo)板和顆粒不同,紫外-可見分光光度法使用的試劑是抗人IgA 血清(應(yīng)為全血清經(jīng)一定純化技術(shù)分離制得的特異性抗體),而目前國內(nèi)抗人IgA血清試劑批間質(zhì)量尚存在一定差異,因此暫未系統(tǒng)地開展該方法驗(yàn)證。
酶聯(lián)免疫法具有簡便、快速、靈敏、精確等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用,更易于實(shí)驗(yàn)室操作[13];散射比濁法所使用的全自動蛋白分析儀更多地應(yīng)用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床檢驗(yàn),檢測時間短于酶聯(lián)免疫法,但對于IgA 含量較低的IVIG 檢測時需使用人腦脊液IgA 測定試劑盒,費(fèi)用相對較高。《中國藥典》三部(2020 版)規(guī)定,首次采用本法檢測供試品中IgA 殘留量時,應(yīng)根據(jù)不同樣品基質(zhì)及IgA 殘留量的水平選擇適宜的測定方法,并進(jìn)行相應(yīng)的驗(yàn)證[11]。
綜上所述,本研究結(jié)果表明,酶聯(lián)免疫法和散射比濁法均可用于高濃度IVIG 中IgA 殘留量的質(zhì)量控制,基于檢測費(fèi)用成本考慮,同時多批次酶聯(lián)免疫法檢測結(jié)果略高于散射比濁法,參考風(fēng)險評估原則,企業(yè)對于IgA 含量極低的10% IVIG 中IgA 殘留量進(jìn)行放行檢測時,更推薦使用酶聯(lián)免疫法。此外,參考《中國藥典》,企業(yè)也可根據(jù)研制的10% IVIG 樣品基質(zhì)及IgA 殘留量的水平選擇適宜的測定方法。